溶液中生物大分子的小角与广角X射线散射研究

摘要

小角与广角X射线散射（SWAXS）实验方法的建立，已成为生物大分子研究中的关键手段。通过特定角度方法的仪器使用与样品制备流程，SWAXS实验数据能够呈现大分子的原子级与纳米级结构特征。

摘要

本文通过实验演示了大分子的小角与广角X射线散射（SWAXS）分析。SWAXS是一种X射线在纳米尺度范围内对非均匀样品进行弹性散射的技术，散射角度包括小角（通常为0.1 - 5°）和广角（通常> 5°）。该技术可提供有关大分子的形状、尺寸和分布、部分有序材料的特征距离、孔径大小以及比表面积的信息。小角X射线散射（SAXS）能够提供1至200 nm尺度范围内大分子的结构信息，而广角X射线散射（WAXS）则可根据具体系统配置和探测器，分辨出样品中0.33 nm至0.49 nm范围内的更小布拉格间距。该间距由布拉格定律确定，取决于X射线波长和入射角。

在小角X射线散射（SWAXS）实验中，材料可以是固体或液体，并可包含以任意组合形式存在的同种或异种材料的固体、液体或气体区域（所谓颗粒）。SWAXS的应用范围非常广泛，涵盖所有类型的胶体：金属、复合材料、水泥、油类、聚合物、塑料、蛋白质、食品和药物制剂。对于固体样品，其厚度通常限制在约5 mm以内。

本文详细介绍了实验室用SWAXS仪器的使用方法。利用现有软件（例如，可使用GNOM-ATSAS 2.3软件包（由D. Svergun，EMBL-Hamburg开发）和EasySWAXS软件）对SWAXS系统开展实验，以测定样品的若干关键参数。一个典型的生物大分子实验示例是分析水基缓冲液中2 wt%的溶菌酶，该样品可通过多种方法选择和制备。样品的制备步骤遵循下文“样品制备”部分中的指南。通过SWAXS实验，可获得溶菌酶的重要结构参数， 例如 回转半径可被分析。

方案

1. 样品制备

1. 使用针头从样品容器中取出部分样品。
2. 用针头将样品填充至毛细管（最大直径为 2.2 mm）中，填充长度需从底部起达到 2 至 3 cm。
3. 在毛细管尖端熔化石蜡，将其封闭。
4. 将真空样品杆从系统中旋下。
5. 用手握住毛细管的熔封端（石蜡端），将未熔封的一端插入样品杆中。
6. 将样品杆放回系统中，并旋紧固定。

* 固体样品（包括粉末样品）可直接放入样品架中（无需毛细管），而液体样品必须置于毛细管内。

SWAXS 仪器的启动

2. 源设备冷启动程序

1. 通过按下安全快门按钮关闭快门。
2. 按下绿色开启按钮，将主电源打开。
3. 确认紧急“关闭”按钮处于伸出位置。
4. 按下绿色按钮，打开主电源。
5. 确认联锁LED指示灯为绿色，表示所有联锁状态正常。
6. 等待触摸屏加载完成。加载完成后，按菜单上的“R6”按钮。
7. 将待机钥匙转至“ON”位置。
8. 将X射线钥匙转至“ON”位置。红色X射线指示灯应亮起。
9. 等待触摸屏显示待机参数（30 kV 和 0.4 mA）。
10. 将待机安全钥匙转至“OFF”位置。按下触摸屏底部的“Start Cycle”按钮。
11. 等待触摸屏显示额定功率（50 kV 和 1 mA）。如需设置不同功率，可在触摸屏上按下“R4”进入配置界面，并输入所需参数。

3. 冷却器操作步骤

1. 将温度控制面板上的电源开关拨至“ON”位置。控制指示灯和LED温度显示屏将亮起。
2. 将冷水机上的电源开关拨至“ON”位置。
3. 等待温度显示屏显示“OFF”。此时为待机模式。
4. 按住确认按钮（回车符号）约4秒，或直到温度显示屏显示实际温度。
5. 如需更改温度，请按向上或向下箭头按钮。设定值将在温度显示屏上显示约8秒，随后恢复显示实际值。
6. 当所需设定值显示时，按下确认按钮一次，以保存该设定值。
7. 等待实际温度达到所需的设定值。

注意：如果温度显示屏上任何时候出现“E 01”错误，请按照冷水机关闭说明操作，通过将纯水倒入水箱加水口重新注满浴槽单元，然后再次执行冷水机启动程序。

4. 冷却器关闭

1. 按“回车”键约 4 秒。
2. 将电源开关转至“关闭”位置。

5. 开启真空系统

1. 确保真空门已牢固就位。
2. 将真空泵1和真空泵2的旋钮转至“ON”位置。
3. 等待VAP5真空计读数达到低于1.5 mbar的真空水平。

6. 检测系统设置

1. 设置气体压力时，确认减压阀的主压力表压力至少为 10 bar。
2. 打开主阀门。
3. 缓慢打开工作压力阀，直至工作压力表显示压力达到 8 bar。
4. 打开第二主阀门。
5. 调节气体流量时，通过将气体控制面板上的主压力阀旋钮转至垂直位置来打开主压力阀。
6. 使用针阀调节流量，直至压力表读数约为 8 bar。
7. 将主电源开关拨至“ON”位置，LED 指示灯应亮起。
8. 调节高压时，将开关拨至“ON”位置以启动高压，LED 指示灯应亮起。
9. 缓慢旋转电压调节旋钮，直至电压表读数约为 3.5kV。切勿超过 4kV。

7. 校准

1. 上述实验步骤使用已知峰的样品进行。
2. 使用 ASA 3.3 获得具有 5 个峰的强度与通道关系图。
3. 进入菜单 → 选项 → 输入通道及其对应的强度。
4. 转到 ASA3 的“TPF”选项卡，首先选择该选项卡。
5. 更改滤波器，左上角选择1 mm 镍（束流滤波器）。
6. 设置位置为 32,000（范围 28,000 至 32,000，关键区域在 28,000 附近）→ 移动至该位置，确保真空度低于 5 mbar，确保探测器读数在 1k - 10k 之间。
7. 运行 10 秒，约每秒 52 个计数。
8. 更改能量窗口（或仅用样品测量能量窗口，不包括滤波器情况），设置最终运行时间为 10 秒。
9. 找到主束的位置（例如通道 233）。
10. 对于其他运行，再次更改滤波器为2 mm 钨（W，束流阻挡器），并从 30,000 开始。
11. 找出样品所有其他峰的位置。
12. 使用 ImageJ-macro 软件校准 SAXS —— 实现从强度与通道关系到强度与 q（或 d 间距）的转换（图 1）。
13. 使用 ImageJ-macro 软件校准 WAXS —— 实现从强度与通道关系到强度与 q（或 d 间距）的转换（图 2）。

8. 软件操作流程

1. 使用软件 ASA 3.3 收集实时数据：实时数据→ TPF 选项卡→ 保存文件。
2. 对于 EasySWAXS，点击设备设置选项卡。
3. 输入“a”、lambda 和 d 值，以及质心位置。
4. 选择点准直模式。
5. 选择球状颗粒类型（除非已知为棒状或扁平形状颗粒）。
6. 点击 Guinier-Plot 选项卡，将显示 I 对 q² 的图像。
7. 拖动垂直线，圈出一段近似线性斜率的区域。
8. 屏幕底部将显示一个 R 值，其旁边有验证要求。
9. 继续将垂直线逐渐靠近，直到验证值介于 1 到 2 之间。此过程具有主观性。所得 R 值（即回转半径）为估算值。

9. 源关闭程序

1. 确认安全快门和快速快门已关闭。
2. 将待机钥匙转至“ON”位置。
3. 等待触摸屏显示待机状态。
4. 在触摸屏上按下 R5。
5. 将电流降至 0 A。
6. 将电压降至 0 A。
7. 将X射线钥匙转至“OFF”位置。
8. 按下红色关闭按钮，关闭主电源。

结果

小角X射线散射（SAXS）和广角X射线散射（WAXS）结合可提供样品的多种结构信息，包括回转半径、颗粒尺寸与形状、溶液结构因子、比内表面积和孔径、晶格类型与晶格尺寸，以及电子密度。SAXS和WAXS还可用于研究蛋白质动力学¹。

通过比较实验测得的谱图与系统的计算结果，可以获得小角与广角X射线散射（SWAXS）实验的结构信息。计算结果是在软件中利用基于统计力学模型（如Ornstein-Zernike（OZ）积分方程理论）构建的合理有效势V _eff(r)得出的（此类分析的一个示例可参见文献²）。

作为数据分析方法的一部分，模型 用于SWAXS绝对强度 I(q) 需要在软件中为研究开发散射强度， I(q), 是倒易空间中动量转移的函数，即散射矢量 q = 4π sin(θ/2)/λ。 q 是一个与...

讨论

SWAXS 系统的对比分析方法可从实验分析中确定多种变量。根据样品和实验设置的不同，分析所得的参数可用于不同目的。SAXS 提供有关物体纳米尺度尺寸和形状的信息，而 WAXS 则侧重于原子级和微米级结构（例如 分子晶格、晶胞尺寸对称性）。更具体而言，对于稀溶液中的颗粒，SAXS 可研究回转半径、颗粒尺寸和形状；对于高密度样品，SAXS 可研究溶液的结构因子；对于无序多孔/两相体系，SAXS 可研究特定内表面积和孔径；对于液晶样品，WAXS 可研究晶格尺寸和晶胞结构。然而，SWAXS 的一个局限性在于，颗粒尺寸分布范围过宽或存在多分散性会严重降低实验结果的质量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
System3 小角和广角X射线散射（SWAXS）相机	Hecus XRS 和 IBN， 奥地利格拉茨
GNOM	由 D. Svergun 提供的 EMBL-汉堡 ATSAS 2.3 软件包