切向流超滤（TFU）是一种基于分子量分离生物样品的循环方法。TFU 已被改进用于尺寸筛选（直径 1–20 nm）并高度浓缩大量多分散银纳米颗粒（将 4 L 浓度为 15.2 μg ml-1 的溶液浓缩至 4 ml 浓度为 8,539.9 μg ml-1），且聚集程度极低。
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摘要
摘要
如今，AgNPs 被广泛用于消费品的制造中，1 水消毒剂，2 治疗学1, 3 和生物医学设备4 由于其强大的抗菌特性。3-6 这些纳米粒子的应用在很大程度上受到银纳米粒子（AgNP）尺寸和聚集状态的影响。在可控制备方面仍存在诸多挑战7 基于大小的分离4,8 不含化学性质活泼的封端剂/稳定剂或有机溶剂的未修饰、均质银纳米颗粒。7-13 局限性源于试剂的毒性、银纳米粒子合成或分离方法的成本高昂或效率降低（例如离心、尺寸依赖性溶解度、尺寸排阻色谱等。10,14-18 为克服这一问题，我们近期研究表明，TFU 可实现对克雷顿法制备的 AgNPs（300 ml 浓度为 15.3 μg/ml）的粒径、浓度及聚集状态的更优控制-1 降至 10 ml 的 198.7 μg/ml-1比超速离心等传统分离方法更高效。19
切向流超滤（TFU）是一种常用于基于重量分离蛋白质、病毒和细胞的循环方法。20,21 简而言之，液体样品通过一系列孔径范围从1,000 kD到10 kD的中空纤维膜。样品中较小的悬浮或溶解成分会随溶剂一起穿过孔隙屏障（滤出液），而较大的成分则被截留（截留液）。由于TFU既不会破坏样品，也无需额外溶剂去除有毒过量试剂和副产物，因此可被视为一种“绿色”方法。此外，由于既有疏水性也有亲水性滤膜可供选择，TFU可应用于多种纳米颗粒。
本研究的两个主要目标是：1）通过邀请视频展示的方式说明TFU方法的实验细节；2）验证TFU方法在处理较大体积胶体纳米颗粒和较小体积截留液时的可行性。首先，采用成熟的克雷顿法22,23，通过NaBH4还原AgNO3合成了未功能化的AgNPs（4 L，15.2 μg ml-1）。随后，采用三步TFU法降低AgNPs的多分散性：使用50 nm滤膜（460 cm2）去除大于50 nm的AgNPs及其聚集体，再依次使用两个100-kD滤膜（分别为200 cm2和20 cm2）对AgNPs进行浓缩。代表性样品通过透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱、拉曼光谱以及电感耦合等离子体发射光谱进行表征。最终获得的截留液包含高度浓缩（4 ml，8,539.9 μg ml-1）、低聚集且均一的AgNPs，其粒径范围为1–20 nm，银的浓度回收率约为62%。
方案
1. 胶体银纳米颗粒的合成
Creighton 方法（稍作修改，成本较低）22 的反应机理在参考文献 Pavel 等人的支持信息中有详细描述，其中包括 NaBH4 在室温或更高温度下发生不希望的水解副反应。23
- 将所有玻璃器皿在10% HNO₃中清洗12-24小时3 先用酸浴处理，然后在含1.25 M NaOH的40%乙醇溶液中浸泡4–12小时，最后进行高压灭菌。经过酸浴和碱浴处理后，玻璃器皿须用超纯水（17 MΩ或更高）彻底冲洗至少五次。
- 配制 300 ml 2 mM NaBH₄ 溶液4 溶液和 100 ml 的 1 mM AgNO3 使用冷却的灭菌水配制溶液 10 °C较低的温度可防止 NaBH 的副反应4.
- 加入 300 ml 2 mM NaBH₄ 溶液4 将溶液加入含有搅拌子的500 ml锥形反应瓶中，并用铝箔包裹烧瓶以防止银氧化。将烧瓶置于置于搅拌器上的冰浴中，以325 rpm搅拌10分钟。
- 用超纯水冲洗25 ml滴定管，使其充满整段水柱，以进行预润。预润后，将滴定管装满AgNO₃溶液。3 溶液并用铝箔包裹。
- 在暗室中，加入 50 ml 1 mM AgNO₃ 溶液3 以每秒1滴的速度加入溶液-1 至 NaBH4 持续搅拌下的溶液（图1A）。用“锡箔帐篷”覆盖装置的中部，以减少 AgNO₃ 光照暴露3 加成。AgNO₃3 添加过程需要30-40分钟。定期补充冰浴。
- 在 AgNO₃ 溶液反应后3 加完后，补充冰浴，并继续搅拌胶体溶液45-50分钟。胶体AgNPs的形成以溶液颜色由无色变为金黄色为标志，该颜色变化特征性地对应于AgNPs的表面等离子体共振吸收峰（图1B).
- 反应完成后，将胶体冷藏。若胶体保持稳定，一周后可合并批次的胶体 AgNP。 即胶体溶液未发生聚集，且已使用紫外-可见吸收光谱法和拉曼光谱法对批次进行表征，以检测可能的聚集现象或污染物。
2. 胶体银纳米颗粒的表征
采用 Cary 50 UV-VIS-NIR 分光光度计（Varian Inc.）和配备 Olympus BX41 共聚焦拉曼显微镜的 LabRamHR 800 拉曼系统（Horiba Jobin Yvon, Inc.）对 AgNP 进行表征。数据采集与分析使用 Cary WinUV 软件、LabSpec v.5 和 Origin 8.0 软件完成。
注意：其他仪器型号需要优化采集参数。
通过紫外-可见分光光度法测定胶体银纳米粒子的表面等离子体共振
- 取一次性1 cm3比色皿，按1:10的体积比加入Creighton胶体和超纯水。另取一个1 cm3比色皿装入超纯水，用于空白基线校正。用无尘纸擦拭两个比色皿的外壁。
- 将分光光度计设置为吸光度模式，Y轴范围设为-0.5至1.0，X轴扫描范围设为200–800 nm，并选择4,800 nm min-1的快速扫描速率，同时启用基线校正。
- 将装有水的比色皿插入仪器，运行基线扫描。如有必要，重复操作直至获得稳定的非零基线控制结果。
- 将空白比色皿替换为样品比色皿，启动吸光度扫描，采集胶体样品的紫外-可见吸收光谱（图1C）。
通过拉曼光谱法检测胶体 AgNPs 的纯度
由于视频演示的时间限制（10-15 分钟视频）以及方案文本的篇幅限制（最多 3 页），本实验部分将不进行录像。
- 将仪器参数设置如下：激发光源（632.8 nm He-Ne），滤光片（无滤光片，样品处激光功率约 17 mW），共焦孔径（300 μm），光谱仪（730 cm-1），全息光栅（600 条/mm），物镜（50倍长工作距离空气物镜），曝光时间（30 s），累积次数（5）。
- 使用洁净的移液器将胶体填充至2 ml石英比色皿中，并轻轻插入塞子。用擦镜纸（Kimwipe）清除比色皿表面的指纹、污迹或残留胶体。显著降低显微镜载物台高度。选择50倍物镜，并将比色皿放置于载物台上。
- 利用仪器的视频模式及奥林巴斯（Olympus）相机，将激光束聚焦于比色皿内壁正下方的AgNP胶体处。关闭室内光源，采集拉曼光谱（图1D）。
3. 通过切向流超滤（TFU）对胶体银纳米颗粒（AgNPs）进行尺寸筛选与浓缩
使用KrosFlo II研究型过滤系统（Spectrum Laboratories，美国加利福尼亚州兰乔多明格斯）对银纳米颗粒（AgNP）的多分散性进行限制并实现其浓缩（图2）。切向流过滤（TFU）过程包含三个步骤：（1）利用50 nm MidiKros聚砜膜模块（460 cm2）对直径为50 nm及以上尺寸的AgNP及其聚集体进行尺寸筛选；（2）利用100-kD MidiKros滤膜（200 cm2）对直径为1–20 nm的AgNP进行尺寸筛选与浓缩；（3）进一步使用100-kD MicroKros聚砜滤膜（20 cm2）进行体积缩减（图3）。
步骤 1
- 根据图2A所示，将MasterFlex进样管（规格17）连接至蠕动泵。该装置需要一个Y型接头和一个管路连接件。将管路连接至50 nm MidiKros模块，并务必使用扎带将管路牢固固定在滤器上。通过SIZE按钮选择管路尺寸17。
- 使用DIR按钮选择泵的逆时针运转方向。确保MODE按钮处于INT模式。
- 启动泵前，将泵速调至低于300 ml min-1。泵速应根据所用管路的尺寸进行调整。设定值应较小，以便操作者能及时应对可能发生的泄漏，但又需足够大以确保系统能够有效预充。为产生将胶体从储液瓶吸入管路和滤器所需的真空，需将从滤器底部通向Y型接头顶部的管路在中间位置切断。
- 将从滤器引出的管路一端放入储液瓶中，并用夹具或用手夹紧靠近Y型接头的管路下段。开启泵，所产生的真空应开始虹吸胶体溶液。
- 当液体在管路中自由流动后，关闭泵，用管路连接件将之前切断的管路重新连接，并用扎带固定。再次开启泵，继续过滤过程。
- 检查管路系统是否存在泄漏。若发现泄漏，应通过调整接头或重新用扎带固定来修复。一旦管路系统无泄漏，可将泵流速提高至不超过700 ml min-1。该流速应根据管路尺寸优化，以避免管路损坏。持续过滤，直至储液瓶中的液体几乎完全耗尽。
- 过滤完成后，收集滤出液，其中含有直径为50 nm及更小的AgNPs。截留物可根据特定的AgNP应用需求保存用于进一步分析。
步骤 2
- 安装 100-kD MidiKros 滤膜前，使用与 50-nm 模块相同的装置，先用 2% HNO3 和超纯水冲洗管路。
- 使用 100-kD MidiKros 模块重复步骤 3.3。
- 过滤完成后，收集管路和滤膜中的内容物（100-kD 截留液），体积应约为 50 ml。
步骤 3
- 根据图2B，将14号MasterFlex管路和100-kD MicroKros FILTER连接至蠕动泵。使用扎带固定所有连接处。在泵上通过SIZE按钮选择14号管路，并将泵速调低至30 ml min-1。
- 开始过滤过程。检查管路系统是否存在泄漏。若发现泄漏，通过调整接头或重新用扎带紧固来修复泄漏点。
- 当管路系统无泄漏后，可将泵的流速提高至不超过90 ml min-1。继续过滤，直至储液瓶中剩余的液体含有极少的浓缩物为止。
- 在泵仍在运行时，通过将进样管从瓶中取出，可将管路和滤器中剩余的内容物收集到储液瓶中。一旦管路和滤器中的内容物全部进入储液瓶，即可关闭泵。
4. 采用电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）定量测定胶体银纳米粒子（AgNPs）中的银含量
每种胶体样品均经过化学消解，并使用A 710E型光谱仪（Varian Inc.）通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）定量测定银含量。采用八个银标准溶液（0、3、7、10、15、25、50 和 100 μg L-1）绘制银的线性回归校准曲线（图4），这些标准溶液由痕量金属分析用10,000 μg ml-1银标准溶液（Ultra Scientific）配制而成。
- 使用 HNO3 对样品进行化学消解。代表性样品包括原始胶体（步骤 1）、50 nm 滤过液（步骤 1）、100 kD 截留液（步骤 2）以及最终 100 kD 截留液（步骤 3）（图 3）。
- 使用 2% HNO3 按以下体积比稀释样品：原始胶体为 1:1000，50 nm 滤过液为 1:1000，第一个 100 kD 截留液为 1:25,000，最终 100 kD 截留液为 1:250,000。为防止银的溶出，所有样品均应储存于低密度聚丙烯容器中。
- 设定 ICP-OES 仪器参数如下：Ag 的波长为 328.068 nm，功率为 1.20 kW，等离子体流量为 15.0 L min-1，辅助气流量为 1.50 L min-1，雾化器压力为 200 kPa。
- 每个样品应重复测定三次，每次重复测量时间为 10 秒。两次测量之间的稳定时间为 15 秒，样品进样延迟时间为 30 秒。每两个样品之间应引入方法空白，以减少潜在的交叉污染。
5. 通过透射电子显微镜（TEM）分析胶体银纳米颗粒（AgNPs）的尺寸分布
采用 Phillips EM 208S 透射电子显微镜（TEM）观察胶体银纳米颗粒（AgNPs）。电子显微图像使用高分辨率 Gatan Bioscan 相机采集，并在 ImageJ 软件中进行分析。24
- 用超纯水按1:100的体积比稀释100-kD截留样品。将20 μl原始胶体和稀释后的100-kD截留液（步骤3）滴加到300目铜网载有Formvar膜的金网格（Electron Microscopy Sciences）上。将网格置于干燥器中干燥，并在一天内观察。
- 将透射电子显微镜（TEM）的加速电压设为70 kV以观察AgNPs。使用高分辨率相机拍摄电子显微照片（图5），并以TIFF格式保存图像文件。
6. 代表性结果
胶体银纳米颗粒的合成与表征
采用图1A所示装置成功合成了4升克雷顿胶体AgNPs。最终胶体呈特征性的金黄色（图1B）22, 23。该胶体的紫外-可见吸收光谱在394 nm处显示出典型的尖锐且对称的表面等离子体共振峰（SPR）（图1C）。原始克雷顿胶体及最终的100 kD截留物的拉曼光谱仅显示三个振动峰，分别为H2O的弯曲振动峰（1640 cm-1）以及对称和不对称伸缩振动峰（分别为3245 cm-1和3390 cm-1）（图1D）。
胶体银纳米颗粒的转导形成单位（TFU）
TFU 装置及三步 TFU 过程的示意图分别如图 2 和图 3所示。在第 1 步中，使用 50 nm 滤膜（460 cm2）对原始胶体进行粒径筛选，并去除直径为 50 nm 及以上尺寸的 AgNPs 及其聚集体（得到约 100 ml 的 50 nm 截留液）。此步骤同时伴随体积略微减少，即从 4 L 原始胶体减少至 3.9 L 的 50 nm 滤出液。该过程中未使用反冲洗或流中断步骤。最大体积减少（即水的去除）发生在第 2 步，此时将 50 nm 滤出液进一步通过 100 kD 滤膜（200 cm2）。所得 100 kD 截留液总体积为 50 ml。在此步骤中，大部分合成副产物和过量试剂通过水溶剂被去除（产生 3.850 ml 的 100 kD 滤出液）。此外，通过在先前报道的方法中增加第三步过滤步骤，实现了 AgNP 的进一步浓缩19。在第 3 步中，使用更小表面积（20 cm2）的 100 kD 滤膜将 100 kD 截留液体积进一步减少至 4.0 ml。透射电子显微镜（TEM）测量结果将表明，该最终的 100 kD 截留液主要由直径为 1–20 nm 的低度聚集 AgNPs 组成。
胶体银纳米颗粒的 ICP-OES 与 TEM 分析
通过八个标准样品（0、3、7、10、15、25、50 和 100 μg L-1）建立了银的线性回归校准曲线（图 4）。随后，通过外推法利用 ICP-OES 校准曲线测定四个代表性胶体样品中的银含量：原始胶体（15.2 ppm，图 3A）、50 nm 滤过液（14.1 ppm，图 3B）、第一次 100 kD 截留液（683.1 ppm，图 3C）和最终 100 kD 截留液（8,538.9 ppm，图 3D）。实测产率 15.2 ppm 与 Creighton 反应的典型理论产率 15.4 ppm 非常接近。AgNPs 的极高浓度（4 ml，8,538.9 ppm）表现为颜色从原始胶体的金黄色变为最终 100 kD 截留液的深棕色（图 3，小瓶照片插图）。滤膜质量被发现对切向流超滤（TFU）过程至关重要，尤其是步骤 1。最终截留液的浓度范围为 3,390.1 ppm 至 9,333.3 ppm，具体取决于滤膜状态（重度使用与全新）。若膜孔受损，直径小于 50 nm 的 AgNPs 也会被截留，从而减少滤过液中 AgNPs 的总体收集量。优化过滤过程，包括压力监测和适当的清洗，可延长滤膜的使用寿命。
原始Creighton胶体和最终100-kD截留物（步骤3）的代表性透射电子显微镜（TEM）图像分别如图5A和5C所示。在未聚集状态下，AgNPs在较浅的灰色背景上呈现为黑色圆形区域。在两种样品的TEM图像中，各识别出约800个AgNPs，并使用Image J软件进行分析。每个颗粒由完整且封闭的轮廓定义。根据TEM图像的分辨率，设定面积阈值为1.0 nm2。随后将AgNPs的数量和面积数据导出至Microsoft Excel，并据此推算AgNPs的直径。原始胶体和最终100-kD截留物中AgNPs的平均直径分别为9.3 nm和11.1 nm。AgNPs的直径测量数据随后被导入Origin 8.0软件，并为每个样品构建TEM粒径分布直方图（图5B和5D）。
图 1. A) 合成装置，B) 特征颜色，C) Creighton 胶体 AgNPs 的紫外-可见吸收光谱，以及 D) 拉曼光谱。
图 2. TFU 实验装置示意图，其中 A) 步骤 1 和 2：I) 盛放 Creighton 胶体 AgNPs 的储液槽。II) 滤液收集储液槽。III) 管路上的 Y 型接头。IV) 蠕动泵泵头。V) 50 nm 或 100 kD Midi Kros 滤器。B) 步骤 3：I) 盛放 Creighton 胶体 AgNPs 的储液槽。II) 滤液收集储液槽。III) 100 kD Micro Kros 滤器。
图3. TFU过程的流程图。蓝色阴影框表示收集用于进一步分析的AgNPs胶体悬浮液。小瓶照片显示：A) 原始胶体批次，B) 将原始胶体通过50-nm滤膜（460 cm2）过滤后收集的50-nm滤过液，C) 使用100-kD Midi Kros滤膜（200 cm2）进行体积浓缩后获得的首个100-kD截留液，以及D) 使用100-kD Micro Kros滤膜（20 cm2）进行体积浓缩后获得的最终100-kD截留液。100-kD滤过液外观类似水。
图 4. 使用八种银标准溶液（0、3、7、10、15、25、50 和 100 μg L-1）构建的 ICP-OES 线性校准曲线。
图5. 透射电子显微镜照片 A) 原始的克雷顿法合成的AgNPs C) 最终100 kD截留物（比例尺为100 nm）。通过分析约800个AgNPs构建的TEM粒径分布直方图 B) 原始的Creighton AgNPs，以及 D) 最终100 kD截留物。插图中的 图5B 显示扩展的41-75 nm尺寸范围，以供比较。 点击此处查看大图.
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讨论
胶体银纳米颗粒的紫外-可见吸收分光光度法和拉曼光谱分析
众所周知，胶体吸收光谱中表面等离子体共振峰的数量随着银纳米颗粒（AgNPs）对称性的增加而减少。此外，AgNPs的聚集会导致出现更宽或红移的吸收峰。25,26 在394 nm处出现单一、尖锐且对称的SPR峰，表明存在粒径分布较均匀、轻度聚集的小型球形AgNPs。
通过原始克林顿胶体和最终100-kD截留物的拉曼光谱，证明了超滤前后胶体样品的纯度，其光谱仅显示出三个属于H2O的特征振动模式。具有大拉曼截面的有机杂质或超滤污染物所产生的拉曼信号，会因其与AgNP表面的直接接近而得到增强（即所谓的表面增强拉曼光谱（SERS）效应）。
超滤胶体银纳米颗粒的 ICP-OES 与 TEM 分析
在先前报道的TFU方法19基础上增加第三步100-kD过滤，成功将更大体积的克雷顿胶体AgNPs（4 L、15.2 pp...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
谨此感谢美国国家科学基金会通过工程学本科教育创新项目（NUE）和LEADER联盟项目提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硝酸银（AgNO₃）3) | Acros Organics Inc. | CAS：7761-88-8 | |
| 硼氢化钠（NaBH₄）4) | Acros Organics Inc. | CAS：16940-66-2 | |
| 硝酸（HNO3，Optima） | Fisher Scientific Inc. | A467-1 | 用于ICP分析的痕量金属级 |
| 10,000 μg/ml-1 银标准，EnviroConcentrate | Ultra Scientific | US-IAA-047 | |
| KrosFlo Research IIi 切向流过滤系统 | Spectrum Laboratories Inc. | SYR2-U20-01N | |
| 0.05 μm PS（0.5 mm）460 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X30S-900-02N | |
| Midi 100 kD PS 200 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X3-100S-901-02N | |
| Micro100 kD PS 20 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X1AB-300-10N | |
| MasterFlex C-Flex 管道 L/S 17号尺寸 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-17 | |
| MasterFlex C-Flex 管道 L/S 14号尺寸 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-14 | |
| Cary 50 紫外-可见-近红外分光光度计 | Varian Inc. | ||
| LabRam HR 800 系统 | Horiba Jobin Yvon 公司 | ||
| Varian 710ES ICP-–S | Varian Inc. | ||
<强>表1. 特定试剂与设备 |
参考文献
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