切向流超滤：一种用于胶体银纳米颗粒尺寸筛选与浓缩的“绿色”方法

摘要

切向流超滤（TFU）是一种基于分子量分离生物样品的循环方法。TFU 已被改进用于尺寸筛选（直径 1–20 nm）并高度浓缩大量多分散银纳米颗粒（将 4 L 浓度为 15.2 μg ml^-1 的溶液浓缩至 4 ml 浓度为 8,539.9 μg ml^-1），且聚集程度极低。

摘要

如今，AgNPs 被广泛用于消费品的制造中，¹ 水消毒剂，² 治疗学^{1, 3} 和生物医学设备⁴ 由于其强大的抗菌特性。^3-6 这些纳米粒子的应用在很大程度上受到银纳米粒子（AgNP）尺寸和聚集状态的影响。在可控制备方面仍存在诸多挑战⁷ 基于大小的分离^4,8 不含化学性质活泼的封端剂/稳定剂或有机溶剂的未修饰、均质银纳米颗粒。^7-13 局限性源于试剂的毒性、银纳米粒子合成或分离方法的成本高昂或效率降低（例如离心、尺寸依赖性溶解度、尺寸排阻色谱等。^10,14-18 为克服这一问题，我们近期研究表明，TFU 可实现对克雷顿法制备的 AgNPs（300 ml 浓度为 15.3 μg/ml）的粒径、浓度及聚集状态的更优控制^-1 降至 10 ml 的 198.7 μg/ml^-1比超速离心等传统分离方法更高效。¹⁹

切向流超滤（TFU）是一种常用于基于重量分离蛋白质、病毒和细胞的循环方法。^20,21 简而言之，液体样品通过一系列孔径范围从1,000 kD到10 kD的中空纤维膜。样品中较小的悬浮或溶解成分会随溶剂一起穿过孔隙屏障（滤出液），而较大的成分则被截留（截留液）。由于TFU既不会破坏样品，也无需额外溶剂去除有毒过量试剂和副产物，因此可被视为一种“绿色”方法。此外，由于既有疏水性也有亲水性滤膜可供选择，TFU可应用于多种纳米颗粒。

本研究的两个主要目标是：1）通过邀请视频展示的方式说明TFU方法的实验细节；2）验证TFU方法在处理较大体积胶体纳米颗粒和较小体积截留液时的可行性。首先，采用成熟的克雷顿法^22,23，通过NaBH₄还原AgNO₃合成了未功能化的AgNPs（4 L，15.2 μg ml^-1）。随后，采用三步TFU法降低AgNPs的多分散性：使用50 nm滤膜（460 cm²）去除大于50 nm的AgNPs及其聚集体，再依次使用两个100-kD滤膜（分别为200 cm²和20 cm²）对AgNPs进行浓缩。代表性样品通过透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱、拉曼光谱以及电感耦合等离子体发射光谱进行表征。最终获得的截留液包含高度浓缩（4 ml，8,539.9 μg ml^-1）、低聚集且均一的AgNPs，其粒径范围为1–20 nm，银的浓度回收率约为62%。

方案

1. 胶体银纳米颗粒的合成

Creighton 方法（稍作修改，成本较低）²² 的反应机理在参考文献 Pavel 等人的支持信息中有详细描述，其中包括 NaBH₄ 在室温或更高温度下发生不希望的水解副反应。²³

1. 将所有玻璃器皿在10% HNO₃中清洗12-24小时₃ 先用酸浴处理，然后在含1.25 M NaOH的40%乙醇溶液中浸泡4–12小时，最后进行高压灭菌。经过酸浴和碱浴处理后，玻璃器皿须用超纯水（17 MΩ或更高）彻底冲洗至少五次。
2. 配制 300 ml 2 mM NaBH₄ 溶液₄ 溶液和 100 ml 的 1 mM AgNO₃ 使用冷却的灭菌水配制溶液 10 °C较低的温度可防止 NaBH 的副反应₄.
3. 加入 300 ml 2 mM NaBH₄ 溶液₄ 将溶液加入含有搅拌子的500 ml锥形反应瓶中，并用铝箔包裹烧瓶以防止银氧化。将烧瓶置于置于搅拌器上的冰浴中，以325 rpm搅拌10分钟。
4. 用超纯水冲洗25 ml滴定管，使其充满整段水柱，以进行预润。预润后，将滴定管装满AgNO₃溶液。₃ 溶液并用铝箔包裹。
5. 在暗室中，加入 50 ml 1 mM AgNO₃ 溶液

讨论

胶体银纳米颗粒的紫外-可见吸收分光光度法和拉曼光谱分析

众所周知，胶体吸收光谱中表面等离子体共振峰的数量随着银纳米颗粒（AgNPs）对称性的增加而减少。此外，AgNPs的聚集会导致出现更宽或红移的吸收峰。^25,26 在394 nm处出现单一、尖锐且对称的SPR峰，表明存在粒径分布较均匀、轻度聚集的小型球形AgNPs。

通过原始克林顿胶体和最终100-kD截留物的拉曼光谱，证明了超滤前后胶体样品的纯度，其光谱仅显示出三个属于H₂O的特征振动模式。具有大拉曼截面的有机杂质或超滤污染物所产生的拉曼信号，会因其与AgNP表面的直接接近而得到增强（即所谓的表面增强拉曼光谱（SERS）效应）。

超滤胶体银纳米颗粒的 ICP-OES 与 TEM 分析

在先前报道的TFU方法¹⁹基础上增加第三步100-kD过滤，成功将更大体积的克雷顿胶体AgNPs（4 L、15.2 pp.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硝酸银（AgNO₃）3)	Acros Organics Inc.	CAS：7761-88-8
硼氢化钠（NaBH₄）4)	Acros Organics Inc.	CAS：16940-66-2
硝酸（HNO3，Optima）	Fisher Scientific Inc.	A467-1	用于ICP分析的痕量金属级
10,000 μg/ml-1 银标准，EnviroConcentrate	Ultra Scientific	US-IAA-047
KrosFlo Research IIi 切向流过滤系统	Spectrum Laboratories Inc.	SYR2-U20-01N
0.05 μm PS（0.5 mm）460 cm2	Spectrum Laboratories Inc.	X30S-900-02N
Midi 100 kD PS 200 cm2	Spectrum Laboratories Inc.	X3-100S-901-02N
Micro100 kD PS 20 cm2	Spectrum Laboratories Inc.	X1AB-300-10N
MasterFlex C-Flex 管道 L/S 17号尺寸	Cole-Palmer Instrument Co.	06424-17
MasterFlex C-Flex 管道 L/S 14号尺寸	Cole-Palmer Instrument Co.	06424-14
Cary 50 紫外-可见-近红外分光光度计	Varian Inc.
LabRam HR 800 系统	Horiba Jobin Yvon 公司
Varian 710ES ICP-–S	Varian Inc.
<强>表1. 特定试剂与设备