芯片上内皮炎症表型分析

摘要

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。

摘要

动脉粥样硬化形成因代谢异常而加剧，这些代谢异常可促进全身性炎症状态增强，进而导致内皮功能障碍。然而，临床上尚未直接评估内皮早期功能改变以反映个体风险水平，从而指导治疗策略。此外，局部血流动力学对炎症的调控作用导致动脉粥样硬化呈非随机的空间分布，但其机制尚不明确。 体内我们描述了一种 芯片实验室 基于定量分析人内皮细胞（EC）和单核细胞在精确流动条件下炎症事件的代谢扰动。采用软光刻常规方法进行微加工 血管模拟微流控腔室（VMMC），这些物质直接与培养的内皮细胞单层结合。¹ 这些装置具有使用试剂量少的优点，同时为直接成像暴露于明确定义剪切力场下的内皮细胞膜上的炎症事件提供了平台。我们已成功应用这些装置研究细胞因子诱导的² 脂质-^{3, 4} 和RAGE诱导的⁵ 人主动脉内皮细胞（HAEC）中的炎症反应。本文记录了使用VMMC检测单核细胞（THP-1）在不同剪切力条件下培养并经炎症细胞因子TNF-α激活的HAEC单层上的滚动与黏附。此类研究为代谢危险因素下动脉粥样硬化易感性的机制提供了深入见解。

方案

1. 细胞培养与基质制备

1. 使用车床从100 × 20 mm组织培养皿（BD Falcon）上切割出3英寸的圆形基底。将基底浸入70%乙醇中进行灭菌。置于培养皿中，加入4 ml I型胶原蛋白（100 μg/ml），室温孵育1小时，然后用4 ml 1 × PBS冲洗。
2. 将人主动脉内皮细胞（HAEC，第4-6代）重悬于6.5×10⁵ 个细胞/ml，取1 ml直接接种至基底上。置于37 °C、5% CO₂培养箱中，使细胞贴附基底1小时。
3. 向细胞中加入9 ml内皮细胞生长培养基-2（EGM-2），并添加1×抗生素-抗真菌溶液。每2天更换一次培养基，直至细胞达到90%融合度。
4. 将THP-1细胞维持在添加10%胎牛血清和1×抗生素-抗真菌溶液的RPMI 1640培养基中。当细胞密度达到10⁶ 个细胞/ml时进行传代。

2. 细胞剪切实验方案

细胞在定制的锥板式细胞剪切装置（CSD）中进行处理。该装置的详细信息和设计参数见表1和图4。

1. 准备CSD。用乙醇对腔室外壳进行灭菌，并用无菌PBS冲洗。将外壳加热至37 °C并调平，以确保锥体垂直于细胞单层。从....

讨论

我们描述了使用微流控PDMS装置，通过实时成像细胞黏附分子（CAM）表达和单核细胞黏附，来在芯片上评估内皮细胞炎症表型的方法。本方法的主要优势在于能够在模拟动脉粥样硬化血管中剪切应力的明确流体动力学条件下，定量分析内皮细胞在暴露于饮食性脂质和细胞因子等炎症介质后所出现的功能障碍相关结果。血管微流控芯片（VMMC）可显著减少试剂或材料的使用量，适用于样品有限的情况，同时具有成本低、可定制化以及适合高通量分析的额外优势。

使用微流控装置代表了一种替代传统宏观尺度方法的新途径，后者数十年来一直被用于研究培养的内皮细胞（EC）对剪切力的响应。这些传统方法包括平行板流动室、圆柱形管和锥板黏度计，每种方法均能施加稳定的层流泊肃叶流条件（综述见¹⁶）。对这些装置进行改进后，可产生随时间或空间变化的管壁剪切应力，甚至可重现动脉血流波形⁶。然而，总体而言，这些装置通常需要大量培养基，制造成本高，适应性较差，且通量相对较低。

使用VMMCs也存在一些局限性。这些装置的设计基于平行板流动理论，该理论假设通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 x 20 mm 培养皿	BD Falcon	353003
95% 乙醇	EMD Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
I型大鼠尾部来源胶原蛋白	Gibco	A10483-01
人主动脉内皮细胞	Genlantis	PH30405A
抗生素-抗真菌素溶液	Invitrogen	15240-062
内皮细胞专用试剂盒	Lonza	CC-4176
内皮细胞基础培养基-2	Lonza	CC-3156
10 ml 注射器	BD Falcon	309604
聚氨酯管	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 培养基	Gibco	11415-069
Sylgard 184 硅弹性体基础液	道康宁	184
Sylgard 184 硅弹性体固化剂	道康宁	184
SU8 光刻胶母片	加州大学戴维斯分校 Pan 实验室	N/A
Eclipse TE200 倒置显微镜	尼康	Eclipse TE200
注射泵	哈佛仪器	PHD2000
19号皮下注射针头	Kendall	8881
THP-1 单核细胞系	ATCC	TIB-202
含钙汉克斯平衡盐溶液（HBSS, Hanks Buffered Saline Solution）2+/毫克2+	Gibco	14025-092
肿瘤坏死因子α（TNF-α）α)	R&D Systems	210-TA-010
基质细胞衍生因子-1（SDF-1）	R&D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
人血清白蛋白（HSA）	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32
<强>表2. 特定试剂与设备。