采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。
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本文内容
摘要
摘要
动脉粥样硬化形成因代谢异常而加剧，这些代谢异常可促进全身性炎症状态增强，进而导致内皮功能障碍。然而，临床上尚未直接评估内皮早期功能改变以反映个体风险水平，从而指导治疗策略。此外，局部血流动力学对炎症的调控作用导致动脉粥样硬化呈非随机的空间分布，但其机制尚不明确。 体内我们描述了一种 芯片实验室 基于定量分析人内皮细胞（EC）和单核细胞在精确流动条件下炎症事件的代谢扰动。采用软光刻常规方法进行微加工 血管模拟微流控腔室（VMMC），这些物质直接与培养的内皮细胞单层结合。1 这些装置具有使用试剂量少的优点，同时为直接成像暴露于明确定义剪切力场下的内皮细胞膜上的炎症事件提供了平台。我们已成功应用这些装置研究细胞因子诱导的2 脂质-3, 4 和RAGE诱导的5 人主动脉内皮细胞（HAEC）中的炎症反应。本文记录了使用VMMC检测单核细胞（THP-1）在不同剪切力条件下培养并经炎症细胞因子TNF-α激活的HAEC单层上的滚动与黏附。此类研究为代谢危险因素下动脉粥样硬化易感性的机制提供了深入见解。
方案
1. 细胞培养与基质制备
- 使用车床从100 × 20 mm组织培养皿（BD Falcon）上切割出3英寸的圆形基底。将基底浸入70%乙醇中进行灭菌。置于培养皿中，加入4 ml I型胶原蛋白（100 μg/ml），室温孵育1小时，然后用4 ml 1 × PBS冲洗。
- 将人主动脉内皮细胞（HAEC，第4-6代）重悬于6.5×105 个细胞/ml，取1 ml直接接种至基底上。置于37 °C、5% CO2培养箱中，使细胞贴附基底1小时。
- 向细胞中加入9 ml内皮细胞生长培养基-2（EGM-2），并添加1×抗生素-抗真菌溶液。每2天更换一次培养基，直至细胞达到90%融合度。
- 将THP-1细胞维持在添加10%胎牛血清和1×抗生素-抗真菌溶液的RPMI 1640培养基中。当细胞密度达到106 个细胞/ml时进行传代。
2. 细胞剪切实验方案
细胞在定制的锥板式细胞剪切装置（CSD）中进行处理。该装置的详细信息和设计参数见表1和图4。
- 准备CSD。用乙醇对腔室外壳进行灭菌，并用无菌PBS冲洗。将外壳加热至37 °C并调平，以确保锥体垂直于细胞单层。从外壳底部组装带有细胞的基底，并将锥体调节至所需高度。
- 使用添加了内皮细胞BulletKit的Leibovitz-15（L-15）培养基作为剪切介质，以在无CO2条件下维持适当的pH值。为诱导炎症反应，在剪切介质中加入肿瘤坏死因子-α（TNF-α，0.5 ng/ml），并通过连接至进样口的注射器向装置中注入6 ml液体，注意避免将气泡引入腔室。
- 对细胞施加高幅稳态剪切应力（HSS，15 dyne/cm2）或振荡剪切应力（OSS，0 ± 5 dyne/cm2，1 Hz），持续4小时。通过旋转细胞上方的锥体实现目标剪切应力（SS），该过程由微步进电机精确控制，具体方法如前所述6。表面壁面剪切应力（τw）可近似表示为：
其中μ为培养基的黏度，ω为锥体的角速度，α为锥体角度（0.5°）。通过精密调平将锥体与基底的对准误差控制在0.05°以内，并使用深度规将间隙高度设定为20 ± 10 μm，以最小化τw的周向和径向变化。该装置已通过验证，确保具备层流流动特性。实验结束后从装置中取出细胞，准备进行单核细胞黏附分析。
3. PDMS 微流控腔室的制备
- 根据应用需求获取所需微流控通道数量和通道高度的主模具。本方案所用特定设计的参数详见表1。此类模具的制备方法在文献中已有详尽记载1。简而言之，使用CAD软件（Autodesk Inventor）设计通道网络，并以5000 dpi的分辨率打印至透明胶片上。将负性光刻胶（SU8）以100 μm的厚度旋涂于硅片表面，再将透明胶片覆盖其上并进行紫外光曝光。去除未聚合的光刻胶后，即可获得正型复制主模具。
- 将硅胶基体与硅胶固化剂按10:1的质量比在称量皿中混合，用5 ml移液管搅拌均匀。搅拌时注意避免刮擦称量皿内壁，以防将塑料碎屑混入溶液中。
- 将主模具硅片置于100×15 mm的培养皿中，随后将PDMS溶液倒入培养皿内。
- 盖上培养皿，放入真空容器中抽气15分钟以去除气泡。15分钟后取出培养皿，轻轻向表面吹气以除去残留的多余气泡。
- 将培养皿放入70 °C烘箱中加热1小时进行固化。取出后用锋利刀片切割出微流控腔室。
4. 在显微镜上组装装置
- 打开倒置显微镜的光源，并将加热器设置为 37 °C。将管路连接至 10 ml 注射器，并用蒸馏水充满注射器，确保无气泡。将注射器放入注射泵中，并设定流速以产生 1 dyne/cm2 的管壁剪切应力。通道中心线处产生的管壁剪切应力（τw）可通过平行板流动腔的标准公式近似计算：
其中 μ 为培养基的黏度，Q 为体积流速，h 为通道高度，w 为通道宽度。注意：由于通道具有有限宽度，实际的 τw 会随 w 变化，具体取决于通道的宽高比，因此应避免在靠近侧壁 25% 的区域内进行测量。1,7 - 将 PDMS 腔室浸入水中，并使用 100 μl 微量移液器从各个通道中去除空气。将真空接头连接至腔室，并确保阀门处于关闭状态。
- 将含有 HAEC 单层细胞的培养皿置于物镜上方。将 PDMS 腔室放置在培养皿上，并小心地将其置于 HAEC 单层细胞上，确保装置与单层细胞之间不产生气泡。旋转阀门，使真空开启，从而牢固固定腔室。
- 将 19 号针头磨钝，使其仅保留 5 mm 的金属部分。用缓冲液填充塑料储液器，并插入 PDMS 腔室的入口。根据所需使用的通道数量重复此操作。将注射泵的管路连接至 PDMS 腔室的出口。
5. 剪切应力条件下的单核细胞黏附实验
- 将THP-1细胞以2×106个细胞/ml的浓度悬浮于含Ca2+/Mg2+和0.1% HSA的HBSS中。通过在室温下用基质细胞衍生因子-1（SDF-1，50 μg/ml）孵育15分钟来激活THP-1细胞。
- 启动注射泵以建立流动，然后将50 μl细胞悬液加入储液池中，避免引入气泡。待流动完全稳定后，开始数据采集。
- 以适当的流速运行5分钟，若储液池中液体量减少，可补充缓冲液。持续向通道中流入缓冲液，以冲洗流路中未结合的细胞。
6. 数据采集与分析
- 以每秒3帧的速率，在通道内沿轴向流动完全发展后的3个位置，各采集2分钟的数字图像序列，注意避免在入口或出口端口附近，以及侧壁最近25%的区域内进行记录。
- 通过在与单层细胞相同的焦平面上识别其相位明亮的外观，计数每个视野中停滞的细胞数量。
- 牢固的细胞停滞由运动状态定义 < 10 秒内移动半个细胞直径。使用 ImageJ 软件对每个通道的 3 个随机视野进行平均数据测量与定量分析。
7. 代表性结果
尽管血管内皮普遍暴露于可导致全身性炎症的激动剂，动脉粥样硬化却是一种局灶性疾病，优先在动脉血流紊乱的部位发生，提示内皮功能存在空间异质性。8 在代谢应激状态下，人血清中循环的炎症介质（如 TNF-α）水平升高，并与内皮功能受损相关。9, 10 TNF-α 可诱导内皮细胞产生特征明确的反应，包括上调细胞黏附分子（CAMs；如 VCAM-1、ICAM-1、E-选择素）和趋化因子，从而募集循环中的单核细胞，这是早期动脉粥样硬化病变的典型特征。11 血流动力学是内皮细胞炎症表型的重要调控因素。12 高幅度剪切应力（HSS；例如 15 dynes/cm2）或脉动剪切应力（PSS；例如 15 ± 5 dynes/cm2）与动脉中抗动脉粥样硬化位点相关，可下调TNF-α诱导的反应。相反，低幅剪切应力（LSS；例如 2 dynes/cm²）2）或振荡剪切（OSS；例如 0 ± 5 dynes/cm2），易感位点的特征 体内，加剧细胞因子诱导的炎症。13, 14 我们的微流控PDMS装置为开展机制性研究提供了平台，可用于检验代谢应激与流体动力学因素叠加在调控内皮功能及病理过程中的相关假说。以下代表性结果充分展示了该方法的实用性与多功能性。
图 1. 剪切应力差异性调控 THP-1 细胞对 TNF-α 炎症刺激的内皮单层细胞的黏附。 这些数据是使用上述详细方案并在视频中记录的方法获得的。人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在自制的 CSD 装置中，同时暴露于低剂量炎症细胞因子 TNF-α（0.5 ng/ml，约为 VCAM-1 上调的 ~EC50）以及高剪切应力（HSS，15 dynes/cm2）或振荡剪切应力（OSS，0 ± 5 dynes/cm2，1 Hz）条件下，持续 4 小时，具体操作如详细方案所述。THP-1 细胞在剪切流条件下于 PDMS 流动腔室中进行黏附定量分析。该细胞系可模拟人单核细胞表型，因其可重复性好且易于操作而被选用。与 OSS 相比，HSS 减弱了炎症反应，导致 THP-1 细胞黏附减少。数据采用 Student t 检验进行分析，表示为 3 次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）。经 DeVerse 等人许可改编。5
以下数据通过我们已发表工作的实例，展示了本方法的多功能性。适用时已注明对上述方案的偏离之处。
图2. 在剪切应力梯度下细胞因子诱导的VCAM-1表达及单核细胞募集的调控。A） 人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在VMMC装置中受到TNF-α（0.3 ng/mL）刺激4小时，该装置基于Hele-Shaw流动理论设计15。通过将腔室侧壁设计为与二维驻点流的流线重合，并将通道末端形状设计为与等势线匹配，从而在通道中心线上实现剪切应力（SS）大小的线性递减。在距入口轴向距离（x）处，该通道中心线上的壁面剪切应力（τw）由以下公式给出：
其中 μ is 培养基的黏度， Q 是体积流量， h 是通道高度， w1 是通道入口的宽度，以及 L 为总通道长度。 Q 被选用来产生从16 dynes/cm的SS强度梯度2 从入口处到出口近端的驻点“a”，压力由入口处的0逐渐变化。 B)-C) VCAM-1 表达水平被测定 原位 通过使用与量子点偶联的抗体进行免疫荧光显微镜检测，并以未刺激静态对照的百分比中位荧光强度（MFI）表示。SS 对 VCAM-1 的基础水平无调节作用，在未刺激的 HAEC 中该水平较低（灰色三角形）。然而，在 LSS 幅度下，VCAM-1 表达相对于 TNF-α 增加，并在约 2 dynes/cm² 时达到峰值2 并回到 TNF-α 基线水平或低于该水平的剪切力大小 > 5 dynes/cm2 （黑色方块） D) 单核细胞（106/ml）以 2 dynes/cm 的速率灌注2 在经预处理的单层细胞上，于平行流通道中持续5分钟 A)单核细胞向内皮的募集数量与特定剪切应力水平下VCAM-1的表达呈定量相关。值得注意的是，在单层细胞中以高空间分辨率检测VCAM-1表达和单核细胞募集的能力，揭示了剪切应力（SS）幅度在较窄范围内变化时所引起的显著差异，而若仅在独立实验中施加少数离散的剪切应力值，则难以察觉此类变化。数据采用重复测量方差分析（ANOVA）进行分析，并通过Newman-Keuls事后检验评估差异，*P < 在静态条件下，TNF-α 的值为 0.05。数据来自 3–6 次独立实验，表示为均值 ± 标准误。 经 Tsou 等人许可改编2
图3. 富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）对细胞因子诱导的炎症反应的调节作用与供体血清甘油三酯水平及VCAM-1表达呈正相关。 人主动脉内皮细胞（HAEC）单层在静态培养条件下，同时用TNF-α（0.3 ng/mL）刺激4小时，并加入来自高脂餐后人体受试者的TGRL（10 mg/dL ApoB）。A) 采用流式细胞术分别测定悬浮内皮细胞中的VCAM-1表达水平，并按照详细实验方案所述使用VMMC定量单核细胞黏附。数据以相对于TNF-α处理组的百分比变化表示。单核细胞黏附程度与内皮细胞VCAM-1表达呈正比，且随供体血清甘油三酯水平升高而增加。B) 在存在VCAM-1阻断抗体的情况下，部分促炎性供体的单核细胞黏附被显著抑制。统计学显著性通过配对Student t检验确定，数据表示为3–5次独立实验的均值±标准误。经Wang等人许可改编。4
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讨论
我们描述了使用微流控PDMS装置，通过实时成像细胞黏附分子（CAM）表达和单核细胞黏附，来在芯片上评估内皮细胞炎症表型的方法。本方法的主要优势在于能够在模拟动脉粥样硬化血管中剪切应力的明确流体动力学条件下，定量分析内皮细胞在暴露于饮食性脂质和细胞因子等炎症介质后所出现的功能障碍相关结果。血管微流控芯片（VMMC）可显著减少试剂或材料的使用量，适用于样品有限的情况，同时具有成本低、可定制化以及适合高通量分析的额外优势。
使用微流控装置代表了一种替代传统宏观尺度方法的新途径，后者数十年来一直被用于研究培养的内皮细胞（EC）对剪切力的响应。这些传统方法包括平行板流动室、圆柱形管和锥板黏度计，每种方法均能施加稳定的层流泊肃叶流条件（综述见16）。对这些装置进行改进后，可产生随时间或空间变化的管壁剪切应力，甚至可重现动脉血流波形6。然而，总体而言，这些装置通常需要大量培养基，制造成本高，适应性较差，且通量相对较低。
使用VMMCs也存在一些局限性。这些装置的设计基于平行板流动理论，该理论假设通...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）资助，资助号为 R01 HL082689，授予 Scott I. Simon 和 Anthony G. Passerini。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 x 20 mm 培养皿 | BD Falcon | 353003 | |
| 95% 乙醇 | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| I型大鼠尾部来源胶原蛋白 | Gibco | A10483-01 | |
| 人主动脉内皮细胞 | Genlantis | PH30405A | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Invitrogen | 15240-062 | |
| 内皮细胞专用试剂盒 | Lonza | CC-4176 | |
| 内皮细胞基础培养基-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml 注射器 | BD Falcon | 309604 | |
| 聚氨酯管 | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 培养基 | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 硅弹性体基础液 | 道康宁 | 184 | |
| Sylgard 184 硅弹性体固化剂 | 道康宁 | 184 | |
| SU8 光刻胶母片 | 加州大学戴维斯分校 Pan 实验室 | N/A | |
| Eclipse TE200 倒置显微镜 | 尼康 | Eclipse TE200 | |
| 注射泵 | 哈佛仪器 | PHD2000 | |
| 19号皮下注射针头 | Kendall | 8881 | |
| THP-1 单核细胞系 | ATCC | TIB-202 | |
| 含钙汉克斯平衡盐溶液（HBSS, Hanks Buffered Saline Solution）2+/毫克2+ | Gibco | 14025-092 | |
| 肿瘤坏死因子α（TNF-α）α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| 基质细胞衍生因子-1（SDF-1） | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| 人血清白蛋白（HSA） | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
<强>表2. 特定试剂与设备。 |
参考文献
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