方法文章

片上内皮炎症表型

DOI：

10.3791/4169

⸱

2012年7月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

应用光刻和蚀刻的PDMS制作的微流室探测与欧共体功能障碍和炎症相关的功能性结果。在有代表性的实验，能力差剪应力调节单核细胞粘附因子激活欧共体单层证明。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

动脉粥样硬化是potentiated高度的全身性炎症的状态，造成血管内皮功能障碍，有助于代谢异常。然而，早在血管内皮细胞的功能变化，意味着个人的风险程度是不直接评估临床治疗策略，以帮助指导。此外，调节局部血流动力学炎症导致动脉粥样硬化的非随机分布，但机制是难以界定， 在体内 。我们描述了实验室在一个芯片为基础的方法，以定量检测人血管内皮细胞（EC）和精确的流量条件下的单核细胞炎症活动的代谢扰动。软光刻技术的标准方法，用于1这些器件具有microfabricate 模仿血管微商会（VMMC）的 ，这必将直接培养欧共体膜。使用小体积，同时试剂的优势直接成像在接触到一个明确的剪切场欧共体膜炎症事件提供了一个平台。我们已成功地应用于这些设备，以探讨细胞因子，脂质3，4和RAGE诱导人类主动脉EC（HAEC）炎症。在这里，我们记录使用的检测单核细胞（THP-1）轧制和逮捕条件下差剪切特性及炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α激活的HAEC单层VMMC。这类研究到atherosusceptibility提供的代谢危险因素在机械洞察力。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。细胞培养和基材的准备

  1. 削减3英寸100×20 mm组织培养皿（BD猎鹰）使用车床的圆形基板。浸入70％乙醇消毒基板。 4毫升型胶原在室温下为1小时（100微克/毫升）在培养皿和大衣的地方，然后用4毫升1×PBS冲洗。
  2. 申请1毫升直接基板，暂停在6.5x10 5细胞/ ml和种子的人主动脉内皮细胞（HAEC，通过4-6）。放置在37℃，5％CO 2的孵化器，使细胞坚持以基材为1小时。
  3. 添加9毫升内皮生长中期辅以1X抗生素抗霉菌解决细胞（EGM-2）。改变媒体每2天，直到细胞达到90％汇合。
  4. 保持在THP-1细胞的RPMI 1640培养基中10％FBS和:1X抗生素抗霉菌的解决方案。当他们到达密度为1的传代细胞0 6细胞/毫升。

2。细胞剪切协议

细胞习惯于在一个自定义板锥细胞剪切设备（CSD）。设备细节和设计规范，记录在表1和图4。

  1. 准备惩教署。消毒用乙醇室住房，并用无菌PBS冲洗。住房加热至37°C和水平，以确保锥细胞单层垂直。从外壳底部的细胞组装基板和锥设置到所需的高度。
  2. 使用莱博维茨-15（L-15的）内皮BulletKit补充中型剪切介质中的CO 2的情况下保持适当的pH值。刺激炎症，肿瘤坏死因子-α（TNF-α0.5毫微克/毫升）加剪切介质和注入设备，通过连接到进气口注射器6毫升，照顾不引进空气气泡室。
  3. （15达因/厘米2）或振荡剪切应力为4小时（OSS，0±5达因/厘米2，1赫兹）高速钢，高的幅度稳步剪应力剪细胞。所需的SS为实现以上的细胞，而这恰恰是如前面所述的微步进电机控制旋转锥6墙表面SS（τW）近似。
    figure-protocol-1
    其中，μ为介质的粘度，是圆锥体的角速度ω，α是锥角（0.5°）。锥与基板对齐调整为0.05°内通过精密水准和间隙高度设置在20±10微米，使用深度计，以尽量减少周向和径向在τ 瓦特变化。该设备已被验证，以确保层流特性。删除Ç从设备的ELLS和准备分析单核细胞粘附。

3。制备的PDMS微流控室

  1. 获得所需的微通道数量和通道的高度，取决于应用程序的主模具。在本协议中所使用的具体设计的特点，详列于表1。 创建这些方法已在文献记载。1简言之，网络渠道使用CAD软件Autodesk Inventor的设计和印刷于5000 DPI透明度。负光阻（SU8）纺到硅片厚度100微米。覆盖的透明度和暴露在紫外线下。非聚合光刻胶去除产生积极的副本主。
  2. 使用硅胶固化按重量10:1代理在权衡船的PDMS溶液混合硅基地和5毫升血清吸管搅拌。要小心，不要刮墙壁称重船解决方案，以避免增加塑料片。
  3. 主晶片放置在一个100x15mm培养皿，倒入菜的PDMS解决方案。
  4. 覆盖的菜，放入真空容器中，15分钟，以消除气泡。 15分钟后，培养皿，在表面轻轻吹空气中删除任何多余的气泡。
  5. 1小时烤箱放置在培养皿，在70°C。取出盘子切出微腔，用锋利的刀片。

4。大会在显微镜设备

  1. 打开光源倒置显微镜和设置加热至37°C。连接管10毫升注射器装满蒸馏水等，有没有气泡。将在注射器的注射泵和集流率，诱使1达因/厘米2的墙卫队。沿着通道中心线产生的壁面剪切应力（τW）使用标准的近似平行板流动腔方程为:
    figure-protocol-2
    其中，μ为介质的粘度，Q为体积流量，H通道高度，w为通道宽度注:因为渠道有限宽度的实际τw将随W的通道长宽比，避免测量的25％，在最近的一面墙壁。1,7
  2. 放置在水中的PDMS室和使用100μL微量消除空气从各个渠道。将适配器真空室制作确保设置为关闭阀门。
  3. 将培养皿HAEC单层以上的目标。放置在培养皿中的PDMS室和精心设置的HAEC单层，同时确保无气泡形成之间的设备和单层。关闭阀门，使真空室连接牢固。 李>
  4. 削减19个表针生硬等，有金属左侧只有5毫米。缓冲区填充塑料水库和投入的PDMS室门口。重复使用的通道的适当数量。附加油管从注射泵的PDMS通道出口。

5。剪应力下的单核细胞粘附实验

  1. 暂停在2X10 6个细胞/毫升的HBSS +的Ca 2 + /镁2 + 0.1％HSA的THP-1细胞。激活的THP-1细胞与基质细胞衍生因子1（SDF-1，50微克/毫升）的孵化室温为15分钟。
  2. 注射泵转动建立流，然后加入50μL细胞悬液，水库没有引入气泡。一旦流充分发展，开始数据采集。
  3. 运行适当的流速为5分钟，加入缓冲水库解决方案，如果变低。继续流入渠道洗出流流中的任何绑定细胞的缓冲区。

6。数据采集​​与分析

  1. 在3帧/秒，2分钟后，沿纵轴通道3通道的位置流充分发展，照顾侧面记录后，立即入口或出境口岸前，或在25％，最近获得的数字图像序列墙壁。
  2. 每场拘捕细胞的数量计算确定其相明亮的外观，在相同的单层焦平面。
  3. 细胞周期阻滞是指公司通过运动<半细胞直径在10秒。平均超过3个随机的领域/通道和数据量化使用ImageJ的软件。

7。代表结果

虽然血管内皮细胞均匀地暴露激动剂有助于全身炎症，动脉粥样硬化是一种疫源性疾病动脉流扰动的网站，优先发展，在血管内皮功能的空间异质性暗示。 。9日，10肿瘤坏死因子-α诱导良好的特点，在欧共体的反应，包括上调细胞粘附分子（CAMS如VCAM-1，ICAM-1，E-选择素）和趋化因子，招募单核细胞11血流动力学，从流通，早期动脉粥样硬化的一个标志，是一个重要的调节内皮细胞炎症型12个高幅度剪应力（高速钢。如15达因/厘米2）或脉动剪切应力（PSS;如15±5达因/厘米2）与抗动脉粥样硬化的网站，在动脉下调TNF-α诱导的反应。相反，低幅度剪切应力（LSS，如2达因/厘米2）或振荡剪切（OSS;如0±5达因/厘米2）， 在体内的易感位点的特点，加剧cytokiNE引起的炎症。13，14我们的PDMS微流控设备进行机理研究，测试与流体力学因素在调节血管内皮功能和病理代谢应激叠加的假设提供了一个平台。通过以下的有代表性的成果，大致说明了该方法的实用性和多功能。

figure-protocol-3
图1。剪应力差异调节THP-1细胞粘附肿瘤坏死因子-α发炎的内皮细胞单层。使用上面描述和记录视频的详细协议，这些数据被收购。 HAEC单层同时暴露到低剂量的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（0.5纳克/毫升，50〜欧共体VCAM-1的上调），要么HSS（15达因/厘米2）或OSS（0±5达因/厘米2，定制惩教署在1赫兹）作为descri 4小时床的详细协议。 THP-1细胞阻滞在PDMS流动腔的剪切流场下的量化。这模仿人类单核细胞表型的细胞系，被选为其重现性和易用性。相比，高速钢抑制炎症​​反应的OSS，导致下降的THP-1细胞逮捕。学生t检验数据进行分析，并表示为平均值±SEM 3个独立的实验适应从DeVerse等权限5。

下面的数据表明我们的方法的通用性，使用的例子，从我们的出版工作。偏离上述协议表示（如适用）。

figure-protocol-4
图2。调节细胞因子诱导的VCAM-1表达和单核细胞在剪应力梯度招聘。一）HAEC单层4小时刺激下FLO与肿瘤坏死因子-α（0.3毫微克/毫升）w在设计基于海伦-肖流理论VMMC 15在SS幅度沿着通道中心线的直线下降。设计室侧壁配合二维停滞流简化和塑造年底实现通道，以符合ISO-电位线。沿着这个通道从入口（X）的轴向距离中心线产生的壁面剪切应力（τW）计算公式如下:

figure-protocol-5

其中，μ为介质的粘度，Q为体积流量，h是通道的高度，W 1通道入口的宽度，L是总的通道长度，Q被选为生成从16日在SS幅度梯度达因/厘米，在进口2 0驻点"一个"公正的outle近端ţB）-C），VCAM-1表达的原位免疫荧光显微镜使用抗体共轭量子点和比例中位数的荧光强度（MFI）。无刺激的静态控制测量。卫队没有调节VCAM-1的基础水平，这是在未刺激HAEC（灰色三角形）低。然而，VCAM-1表达增加肿瘤坏死因子-α在LSS的程度，高峰在2达因/厘米2，并返回到TNF-α的基线或以下> 5达因/厘米2（黑色正方形），D剪切程度）单核细胞（10 6 /毫升）灌流2达因/厘米2， 在A）为前提的单层，平行流渠道为5分钟。单核细胞向血管内皮细胞的招聘数量与VCAM-1表达，在一个给定的剪应力。值得注意的是，能够探测与罚款在monolaye空间分辨率的VCAM-1表达和单核细胞招聘ŕ透露了在党卫军幅度狭窄的范围内，不会被应用在不同的实验只有几个离散值剪切赞赏显着的变化。数据进行了分析，重复测量方差分析和纽曼的两两比较后测评估差异，静态条件下，* P <0.05从肿瘤坏死因子-α。数据平均值±3-6独立实验的SEM 改编权限由邹族等。2

figure-protocol-6
图3。富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）调节比例捐助者的血清甘油三酯水平和VCAM-1表达的细胞因子诱导的炎症。HAEC膜与肿瘤坏死因子-α（0.3毫微克/毫升）4个小时与TGRL（10 mg / dL的同时刺激载脂蛋白B）分离，从静态培养高脂肪食物后，人类受试者A）测定VCAM-1表达在暂停欧共体分别用流式细胞仪和单核细胞粘附在详细协议中所述，使用VMMC作为量化。数据以％肿瘤坏死因子-α的变化。单核细胞逮捕不同直接比例内皮VCAM-1表达，从而增加直接与捐助者的血清甘油三酯水平B）单核细胞促炎症捐助者的一个子集逮捕被废止的VCAM-1的阻断抗体的存在。配对t检验确定的意义，这意味着±SEM 3-5独立实验。 改编，王等人的许可。4

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了微硅橡胶设备的使用片上，通过实时成像CAM的表达和单核细胞粘附内皮炎症型评估。我们的方法的一个主要优势在于能够量化细胞暴露炎症介质，如饮食中的脂肪和定义的水动力条件下的细胞因子，反映在动脉粥样硬化的血管剪应力的血管内皮功能障碍的相关成果。的VMMC方便使用少量的试剂或材料，可能是在有限的供应，并有增加的优点是价格低廉，可定制的，适合高吞吐量。

微流体装置的使用，替代已使用了几十年的宏观方法，探讨培养欧共体的回应剪切。这些包括平行板流动腔，圆柱管，锥板粘度计，这是每个CA实行稳定，层Poiseuille流条件（审查）在16 pable。修改这些设备可以产生在壁面剪切应力的时间或空间的变化，甚至复述动脉波形。6然而，这些设备一般需要大量的媒体，是制作昂贵，较难适应，忍受相对较低的吞吐量。

限制也存在与使用VMMCs。这些器件的设计基础上平行板流理论，承担无限宽度。这是一个合理的假设，其中宽度大于高度的宏观设备。然而，微通道宽度有限，必须沿纵轴中心的通道，消除侧墙效果进行研究，为...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

没有利益冲突的声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了国立卫生研究院/ NHLBI赠款以R01 HL082689一西蒙斯科特和安东尼·G. Passerini。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
项目 公司 目录编号
100 x 20mm的培养皿屋宇署猎鹰 353003
乙醇95％ 电解二氧化锰化学品 EX0290-1
DPBS cellgro 21-031-CV
I型鼠尾源性胶原蛋白 Gibco公司 A10483-01
人类主动脉内皮细胞 genlantis PH30405A
抗生素抗霉菌解决方案 Invitrogen公司 15240-062
内皮BulletKit 龙沙 CC-4176
内皮细胞基底媒体2 龙沙 CC-3156
10毫升注射器屋宇署猎鹰 309604
PU管聚乙烯 ABW0001
莱博维茨-15媒体 Gibco公司 11415-069
sylgard 184硅橡胶基地道康宁 184
sylgard 184硅橡胶固化剂道康宁 184
SU8光刻胶主晶片加州大学戴维斯分校的泛实验室 N / A
的Eclipse TE200倒置显微镜尼康日食TE200
注射泵哈佛仪器 PHD2000
19计注射器针头肯德尔 8881
THP-1单核细胞株 ATCC TIB-202
HBSS中（汉克斯缓冲液）与Ca 2 + /镁2 + Gibco公司 14025-092
肿瘤坏死因子α（肿瘤坏死因子-α） R＆D系统 210-TA-010
基质细胞衍生因子 - 1（SDF-1） R＆D系统 350-NS-010
RPMI 1640培养 cellgro 10-040-CV
人血清白蛋白（HSA） ZLB Behring公司 NDC 0053-7680-32

表2。特定的试剂和设备。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
  2. Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
  3. Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
  4. Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
  5. Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
  6. Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
  7. Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
  9. Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
  10. Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
  11. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
  12. Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
  13. Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
  14. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  15. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  16. Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
  17. Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
  18. Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
  19. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

TNF THP 1 PDMS

相关文章