本方案描述了使用切向流中空纤维超滤样品浓缩系统和热解离步骤，作为采用美国环保署方法1623检测水中隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）物种的替代方法。
方法文章
一种改良的美国环保署方法1623，采用切向流中空纤维超滤与热解离步骤检测水源性Cryptosporidium和Giardia spp.
本文内容
摘要
摘要
Cryptosporidium 和 Giardia 是全球引起水源性腹泻疾病暴发的两种最常见原生动物。为了更准确地评估这些病原体的流行情况，美国环保署（EPA）开发了方法 1623，并用于监测美国饮用水供应中这些生物体的水平12。该方法包括三个主要步骤：第一步为样品浓缩，需至少过滤 10 L 的原始地表水；随后将滤膜上截留的生物体和杂质洗脱，并通过离心进一步浓缩样品。第二步采用免疫磁分离程序，将浓缩后的水样加入免疫磁珠中，这些磁珠可特异性结合 Cryptosporidium 卵囊和 Giardia 包囊，从而从浓缩的杂质中特异性分离出寄生虫。接着通过酸解过程将这些（卵）囊从磁珠上解离下来。方法的最后一步是免疫荧光染色与计数，即将（卵）囊滴加到载玻片上，染色后在显微镜下进行观察和计数。
方法1623列出了四种样品浓缩系统用于捕获 隐孢子虫 卵囊和 贾第虫 水中的包囊：Envirochek 滤器（Pall Corporation，Ann Arbor，MI）、Envirochek HV 滤器（Pall Corporation）、Filta-Max 滤器（IDEXX，Westbrook，MA）或连续流动离心法（Haemonetics，Braintree，MA）。然而 隐孢子虫 和 贾第虫 (oo)囊孢子的回收率因水源基质和所用滤膜的不同而存在显著差异1,14一种新型切向流中空纤维超滤（HFUF）系统最近被证明在回收方面更高效、更稳定 隐孢子虫 卵囊 和 贾第虫 来自不同水体基质的包囊；此外，它比其他胶囊滤器更经济，并可同时浓缩多种病原体1-3,5-8,10,11此外，Hill 及其同事先前的研究表明，HFUF 显著改善了 隐孢子虫 卵囊回收率与Envirochek HV滤膜直接比较4此外，已有研究报道对现有方法进行其他改进以提升方法性能。用热解离替代酸解离步骤被证明在分离效果上更佳 隐孢子虫 从某些基质的磁珠中9,13 .
本方案描述了一种改进的1623方法，该方法采用新型HFUF过滤系统并结合加热解离步骤。与当前美国环保署方法1623的过滤选项相比，此改进方法中使用HFUF成本更低，且通过允许同时浓缩多种生物体而提供了更大的灵活性。
方案
1. 切向流中空纤维超滤步骤
- 缓冲液和溶液的配制：
洗脱液（1 L）：
向 1 L 试剂级水中加入 0.1 g 聚磷酸钠、0.1 ml Tween-80 和 0.01 ml Y-30 消泡剂。 - 在生物安全柜中准备滤器组件（图 1）：
- 将 Masterflex I/P 73 实验室管路穿过连接至 Masterflex I/P 精密无刷驱动器的 Masterflex I/P Easy-Load 泵头。
- 使用螺钉夹将管路固定在泵头上游配备 NPT 分支 T 型接头的 0–60 psi 甘油填充式压力表上，并将管路连接至泵头下游的 HDPE T 型接头。
- 通过将 Nalgene 53-B 加液/通气盖装配 Masterflex L/S 15 实验室管路和 T 型接头，并将其固定在 1 L Nalgene 耐用聚丙烯瓶上，组装截留液瓶。
- 在 Masterflex L/S 24 管路上安装夹管阀（夹管阀 2），并将该管路从截留液瓶连接至 HDPE T 型接头。
- 使用螺钉夹将 Masterflex L/S 24 实验室管路从压力表连接至 Asahi Kasei Rexeed 25S 高通量透析器，并从透析器连接至截留液瓶。使用定制的 DIN 适配器（设计用于适配内径为 ¼" 的管路）将管路连接至中空纤维超滤器。
- 在 Masterflex L/S 24 实验室管路上安装夹管阀（夹管阀 1），并将管路连接至已去除尖端和棉塞的 10 ml 塑料移液管，作为样品吸取管路，然后将该管路连接至 HDPE T 型接头。
- 在 Masterflex L/S-36 实验室管路的一端安装斜夹阀，并将管路连接至滤器出口端附近的废液口。将另一端置于废液容器中。
- 向 10 L 水样中加入 0.01%（w/v）聚磷酸钠，混匀 3 分钟。
- 关闭夹管阀 2，并从截留液瓶上取下通气盖。所有其他夹具应保持开启状态。
- 设置泵的流向，使液体从 T 型接头流向压力表（沿 图 1 从右向左）。将泵速调节至最大速度的 25%，然后启动泵。
- 当截留液瓶充满至约 2/3 时，打开夹管阀 2，并迅速将通气盖重新装回截留液瓶。检查所有管路和接头，确保无泄漏。
- 缓慢提高泵速至所需的过滤速率（约 1.5 L/min），并检查是否泄漏。使用量筒和计时器或流量计，检测从废液管路排出的水的滤液流速（图 1 中的蓝色 L/S 36 管路）。通常在滤器出口端会形成气泡，导致难以维持稳定的压力和过滤速率。可通过手动短暂捏压废液管路来纠正此问题。该操作通常可促使气泡移向滤液口并经由废液管路排出。根据需要重复操作，需注意豌豆大小的气泡通常难以完全避免。
- 监控过滤过程。根据需要测量并记录压力和过滤速率。压力不得超过 20 psi。建议过滤速率不超过 2.0 L/min。必须持续监控截留液瓶中的水量，确保其不被排空。水量轻微增加或减少属正常现象。若截留液瓶中的水位降至不足 1/3，应立即取下通气盖，并关闭截留液瓶管路上的夹管阀 2。将液位恢复至约 2/3，打开夹管阀并迅速重新装上通气盖，确保密封紧密。若截留液瓶中的液位持续快速下降，则应检查瓶盖是否拧紧、通气盖是否牢固安装，以及管路是否仍浸没在水样中。若上述问题均不存在，则可能是截留液瓶盖的密封圈损坏，需更换。
- 当样品容器排空后，立即关闭夹管阀 1，将泵速降至最大速度的 20%，取下截留液瓶的通气盖，并关闭斜夹阀。
- 通过调节废液管路上的斜夹阀，将截留液瓶中的样品体积调整至约 200 ml。当体积达到约 200 ml 后，拧紧斜夹阀，以进行后续洗脱步骤（1.11–1.12）。
- 向样品容器中加入 500 ml 洗脱液，并冲洗容器内壁。将连接在样品吸取管路上的 10 ml 移液管插入含有洗脱液的容器中。确保斜夹阀处于关闭状态。打开夹管阀 1，并短暂关闭夹管阀 2，以吸入洗脱液。
- 当 500 ml 洗脱液完全吸入后，关闭夹管阀 1，打开夹管阀 2。以最大泵速的 20% 使洗脱液循环 5 分钟。
- 通过调节废液管路上的斜夹阀，将截留液瓶中的样品体积调整至约 100 ml。拧紧斜夹阀，使样品继续循环 1 分钟。确保截留液瓶中的样品液位足够高，以浸没进入瓶内的 L/S 15 管路，避免将空气吸入管路中。
- 反转泵的运行方向，使样品被推入截留液瓶。使泵反向运行 20 秒，使截留液瓶中总体积达到约 225 ml。关闭泵。
- 将 Masterflex I/P 73 管路从泵头上取下，并断开压力表连接。断开从中空纤维超滤器出口的 Masterflex L/S 24 管路。将管路举高至截留液瓶上方，以迫使残留样品全部进入截留液瓶。
- 断开所有与瓶体连接的管路，并将通气盖更换为非通气盖。
- 使用约 225 ml 的截留液继续进行 IMS/IFA 操作。
2. 免疫磁珠分离步骤
- 缓冲液和溶液的配制：
- 将 Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia 联检试剂盒中所含的缓冲液恢复至室温。
- 1X SL-缓冲液A：将1 ml的10X SL-缓冲液A加入9 ml的试剂级水中。
- 将截留瓶中的约225 ml液体转移至已标记的250 ml锥形离心管中。用10 ml试剂水将截留瓶冲洗两次，并将冲洗液加入锥形离心管中。在4 °C条件下，以1500 × g离心15分钟，离心过程中不启用刹车。
- 小心吸除上清液，从气-液界面处吸至沉淀体积每0.5 ml上方5 ml处（例如，若沉淀体积为1.3 ml，则吸至上清液面距沉淀上方15 ml处；若沉淀体积为0.5 ml或更少，则吸至距沉淀上方5 ml处）。
- 通过涡旋振荡或移液混合，将沉淀充分重悬于上清液中。将每5 ml液体转移至平侧Dynal L10管中，该管内已含有各1 ml的10X SL-缓冲液A和10X SL-缓冲液B。用2.5 ml试剂水将锥形离心管冲洗两次，并将冲洗液加入L10管中，使L10管中的总体积（包括缓冲液）达到12 ml。
- 向L10管中各加入100 μl充分混匀的抗Cryptosporidium和抗Giardia Dynabeads。将L10管置于旋转混合仪上，在室温下以18 rpm旋转1小时。
- 将L10管的平侧紧贴MPC-6磁铁，手动轻轻来回翻转管体180°，持续2分钟。
- 保持L10管置于MPC-6磁铁中，磁铁侧朝上，弃去上清液，保留与磁珠结合的(卵)囊合体。将L10管从磁铁上取下，向管中加入0.5 ml的1X SL-缓冲液A。使用另外两次各0.5 ml的1X SL-缓冲液A冲洗，将全部悬浮液转移至置于MPC-S磁铁中（磁铁垂直放置）的1.5 ml微量离心管中。
- 在MPC-S磁铁中轻轻翻转微量离心管180°，持续1分钟。保持磁铁在位，使用巴斯德吸管从微量离心管底部吸除上清液。
- 向微量离心管前侧加入1 ml的1X PBS，移除磁铁并轻轻摇动管子，直至磁珠完全重悬。将磁铁恢复至垂直位置，轻轻翻转管体180°，持续1分钟。使用巴斯德吸管小心吸除PBS冲洗液，避免扰动磁珠沉淀，尽可能去除杂质。
- 移除磁铁，向微量离心管背面加入50 μl试剂水。以最大速度涡旋振荡50秒，随后在80 °C孵育10分钟，再进行30秒涡旋。将磁铁以倾斜位置放回MPC-S中，使磁珠结合至管壁，而(卵)囊保留在液体中。将(卵)囊悬浮液加至SingleSpot单孔载玻片的孔中。
- 重复步骤2.10，将液体加至含有第一次解离产物的同一孔中。将载玻片置于37 °C玻片加热器上1小时，使悬浮液干燥并固定于玻片孔中。
3. 染色与观察
- 缓冲液与溶液的配制：
工作用 DAPI 溶液：取 25 μl DAPI 储存液（2 mg/ml，甲醇配制）加入 25 ml 1× PBS 中。储存液及工作液均需避光保存于 1 °C 至 10 °C 条件下。 - 向载玻片小室中加入 50 μl 甲醇，室温下自然干燥。
- 向载玻片小室中加入 50 μl 工作用 DAPI 溶液，室温孵育 2 分钟。
- 用 Kimwipe 纸从孔中吸去 DAPI 溶液，然后加入 50 μl EasyStain 染色液，35 °C 孵育 30 分钟。
- 用 Kimwipe 纸吸去染色液，缓慢加入 300 μl 冷的 EasyStain 固定缓冲液，使其流过小室边缘。室温孵育 2 分钟。
- 用 Kimwipe 纸吸去缓冲液，加入 10 μl EasyStain 封片介质。
- 小心加盖盖玻片，排除产生的气泡，并用透明指甲油封固盖玻片。
- 使用 FITC 滤光片在 200 倍总放大倍数下扫描整个载玻片，寻找呈卵圆形或球形、苹果绿色荧光、类似卵囊或包囊的结构。对所有此类结构使用 DAPI 滤光片在 1000 倍总放大倍数下进行观察，随后在同一放大倍数下使用微分干涉差（DIC）显微镜进一步检查。使用经校准的目镜测微尺记录其大小及形态学特征。
- 记录实验结果。
注意：有关原始步骤的更多信息可参见2005年12月版的美国环保署方法162312。本文所述的切向流中空纤维超滤步骤用于替代EPA方法1623的第12.0节。热解离步骤对EPA方法1623的第13.3.3节进行了修改。本方法还描述了在免疫磁性分离（IMS）过程中增加一次PBS冲洗步骤，该步骤可插入2005年12月版方法1623的第13.3.2.16节之后。包含上述修改内容在内的EPA方法1623所用全部耗材、试剂和设备清单见设备列表。
4. 典型结果
Cryptosporidium 卵囊和通过过滤与免疫磁分离过程回收的Giardia 囊肿通过显微镜分析进行检测。在总放大倍数200倍下，对每种呈现典型染色模式、大小和形状的生物体（如图2所示）应进一步使用油浸镜在总放大倍数1000倍下观察。这将有助于测量并识别典型特征或可排除阳性鉴定的非典型特征。Cryptosporidium 为椭圆形至球形结构，直径为4至6 μm，呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著发亮（图3A）。使用DAPI紫外荧光时，卵囊会表现出以下典型特征类别之一：内部呈浅蓝色染色并带有绿色边缘但无明显细胞核（DAPI阴性）、内部呈强蓝色染色，或具有最多四个清晰的天蓝色细胞核（DAPI阳性——图3B）。非典型特征包括颜色、结构或DAPI荧光的异常（例如，染色细胞核过多，内部结构呈红色荧光）。若荧光物体符合典型的FITC和DAPI染色标准，则需通过微分干涉差（DIC）显微镜进一步检查。检查该物体是否存在非典型的外部或内部形态学特征，例如细胞壁装饰结构，或一个或两个大细胞核充满整个细胞。若未观察到非典型结构，则将该物体计入总IFA计数，并归类为空的无定形结构，或含有一个至四个子孢子的结构（图3C）。类似地，对疑似Giardia 的物体也需依据其FITC和DAPI染色特性以及DIC特征（如轴丝、中体和细胞核）进行检查。Giardia 囊肿为圆形至椭圆形、明亮苹果绿色的物体，长8–18 μm，宽5–15 μm，边缘显著发亮（图3D）。使用DAPI紫外荧光时，Giardia 囊肿可表现为DAPI阴性染色或DAPI阳性特征（图3E）。该荧光物体以与Cryptosporidium 相同的方式通过DIC检查其典型与非典型特征。若未观察到非典型特征，则将该物体计入总IFA计数，并归类为含有无定形结构的空囊，或含有一个或多种内部结构的囊（图3F）。
观察到具有非典型特征的任何生物体均不应计为（卵）囊。环境样品的显微镜分析可能具有挑战性，因为某些生物体会自发荧光，或与FITC标记的抗Cryptosporidium和/或抗Giardia抗体发生交叉反应1。建议分析人员熟悉水生微生物，并通过观察数十张载玻片积累识别Cryptosporidium和Giardia的经验。每次显微镜操作前，应先对阳性染色对照片上的至少三个（卵）囊进行特征鉴定。
可通过向质量控制样品中添加（卵）囊肿，利用以下计算公式确定每种原生动物的回收率百分比：
（卵）囊肿回收率百分比 = （（QC 样品计数 - 未添加样品计数）/ 添加量）× 100。
图 1. 切向流中空纤维超滤系统的示意图。管道采用颜色编码，以辅助系统组装。
图2. Cryptosporidium 和 Giardia (卵)囊合子的代表性荧光图像。Cryptosporidium 卵囊和 Giardia 囊合子使用FITC标记的抗Cryptosporidium/Giardia 抗体进行染色。箭头所示为Giardia 囊合子；箭头尖端所示为Cryptosporidium 卵囊。在焦平面共观察到四个Cryptosporidium 卵囊和六个Giardia 囊合子。样品在200倍放大倍数下观察。
图3. 用于表征的Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊的代表性显微图像。Cryptosporidium卵囊（A - C）。直径为4至6 μm的球形结构呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著亮染（A），内含最多四个 distinct 的天蓝色DAPI染色细胞核（B），以及每个卵囊内含有一至四个子孢子（S）（C）。Giardia包囊（D - F）。呈圆形至卵圆形、大小为长8 - 18 μm、宽5 - 15 μm的结构呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著亮染（D），内含最多四个天蓝色DAPI染色细胞核（E），并具有一种或多种可辨别的内部结构，如细胞核（N）、中体（M）和/或轴丝（A）（F）。白色箭头：显示Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊壁的明亮苹果绿色荧光染色；白色箭头头：DAPI阳性细胞核。样品在1000倍放大倍数下观察。
讨论
切向流中空纤维超滤是一种从水中初步浓缩Cryptosporidium oocysts和Giardia包囊的有效替代技术。中空纤维超滤的成本低于传统滤器。由于该方法能够从多种不同类型的水基质中浓缩Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊，因此可作为美国环保署方法1623现行过滤技术的一种有效替代方案。与其他大多数过滤方法一样，中空纤维超滤在处理极高浊度样品时容易发生膜污染。滤膜污染会导致水压升高，因此建议在过滤过程中持续监测压力。除Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊外，研究已表明中空纤维超滤还能够浓缩细菌和病毒1-3,5,8。本方法所述的中空纤维超滤可用于在单个样品中同时浓缩多种微生物。值得注意的是，在浓缩过程中获得200至250 ml之间的终体积是关键的最后步骤，以避免因额外离心步骤而导致（卵）囊丢失（步骤2.2）。然而，若允许瓶中液体体积过低，则可能对回收率产生不利影响，因为液体量不足将无法将所有卵囊或包囊完全压入截留液收集瓶中。因此，建议将终体积维持在200至250 ml之间。
热解离是方法1623中酸解离步骤的替代方案。研究表明，该替代步骤在从河流水或试剂水中分离时，可提高隐孢子虫（Cryptosporidium）卵囊的回收率，并降低方法的变异程度9。酸解离与热解离方法的并行比较显示，使用热解离将生物体从免疫磁珠上解离下来，可使隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）的平均回收率更高。此外，采用热解离处理的样品在隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）回收方面的精密度优于酸解离9。
采用HFUF作为浓缩步骤，能够浓缩多种生物体，因而提供了更大的灵活性。此外，与当前方法1623的过滤选项相比，它是一种成本较低的替代方案。
披露
本研究由美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency）通过其研究与发展办公室，与地下水与饮用水办公室的技术支持中心合作资助。所有工作均在美国环保署位于俄亥俄州辛辛那提的现场完成。尽管本文所描述的信息全部或部分由美国环境保护署根据与肖环境与基础设施公司（Shaw Environmental and Infrastructure, Inc）签订的合同（合同编号 EP-C-06-031）资助，但其内容不一定反映该机构的观点，不应推断出任何官方认可。本文已经过该机构审查并批准发表。
致谢
我们感谢Ann Grimm和Michael Zimmerman对本文稿的审阅，以及Doug Hamilton提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 旭化成 Rexeed 25 S/R 湿式中空纤维超滤器 | Dial Medical | REXEED25S/R | |
| I/P 73（Masterflex R-3603）或同等产品 | Cole-Parmer | EW-06408-73 | |
| L/S 24（Masterflex 铂金固化），或同等产品 | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
| L/S 15（Masterflex 铂金固化型）或同等产品 | Cole-Parmer | EW-96410-15 | |
| L/S 36（Masterflex 铂金固化），或同等产品 | Cole-Parmer | EW-96410-36 | |
| I/P 精密无刷驱动器 | Cole-Parmer | EW-77410-10 | |
| I/P Easy Load 泵头 | Cole-Parmer | EW-77601-10 | |
| 黑色高密度聚乙烯三通接头，1/4英寸"x 3/8" x 3/8" | US Plastics | 62064 | |
| Masterflex T型连接头 L/S 15-25 | Cole-Parmer | EG-30613-12 | |
| Nalgene 耐用型聚丙烯 1 L 瓶 | Cole-Parmer | EW-06257-10 | |
| 10 ml 移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11C | |
| Nalgene 1/4 英寸加液/排气盖" 管路，53B | Cole-Parmer | EW-06258-10 | |
| 压力计 | Cole-Parmer | A-680-46-10 | |
| 直通接头，NPT(F)，1/4" | Cole-Parmer | EW-06469-18 | |
| NPT 分支三通，天然聚丙烯 | Cole-Parmer | A-30610-75 | |
| 止血钳，1/2英寸" | Cole-Parmer | EW-06833-00 | |
| 定制适配的 DIN 转接头 | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 | |
| 铁架台 | Fisher Scientific | 14-670B | |
| 铁架台夹具 | Fisher Scientific | 05-769-6Q | |
| Keck 斜面夹，14 mm | Cole-Parmer | EW-06835-10 | |
| 多聚磷酸钠 | Sigma-Aldrich | 305553 | |
| 五水合硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 72050 | |
| Y-30 抗泡沫乳剂 | Sigma-Aldrich | A5758 | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| 10 L 可折叠高密度聚乙烯容器 | VWR 国际公司 | IR314-0025 | |
| 离心机瓶架 | Fisher Scientific | 05-663-103 | |
| 250 ml 锥形离心管 | 康宁 | 430776 | |
| 一次性漏斗 | Cole-Parmer | U-6122-10 | |
| 洗瓶 | Cole-Parmer | U-06252-40 | |
| 离心 | 贝克曼库尔特公司 | Allegra X-15R | |
| 水平转子 | 贝克曼库尔特公司 | ARIES SX4750 | |
| 用于250 ml锥形管的离心机转子适配器 | 贝克曼库尔特公司 | 349849 | |
| 200 μ大口径移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-134 | |
| VacuShield 滤器 | Gelman | 629-4402 | |
| 5 ml 移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Dynabeads 隐孢子虫/贾第虫 组合试剂盒 | IDEXX | 73002 | |
| 50 ml 锥形离心管 | Falcon BD | 352098 | |
| Dynal L10 平底管 | IDEXX | 74003 | |
| 计时器 | VWR 国际公司 | 23609-202 | |
| Dynal MPC-6 磁力架 | IDEXX | 12002D | |
| 1 ml 移液管 | VWR 国际公司 | 53283-700 | |
| 1.5 ml 低吸附微量离心管 | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 1000 μ移液器 &和相应的屏障吸头 | Gilson, Inc. | P1000/DF1000ST | |
| 100 μ移液器 &和相应的屏障提示 | Gilson, Inc. | P100/DF100ST | |
| 9 英寸巴斯德吸管 | VWR 国际公司 | 14672-412 | |
| Dynal MPC-S 磁力架 | IDEXX | 12020D | |
| 涡旋混合 | VWR 国际公司 | 14216-188 | |
| Dynabeads 旋转混匀仪 | IDEXX | 94701 | |
| 加热块 | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Lab Armor 珠 | Lab Armor | 42370-750 | |
| 数字温度计 | Fisher Scientific | 15-077-60 | |
| 1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（1× PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 单点载玻片 | IDEXX | 30201 | |
| 盖玻片 | 康宁 | 287018 | |
| EasyStain 直接试剂盒 | BTF | - | |
| 10 μ移液器 &和相应的屏障吸头 | Gilson, Inc. | P10 & DF10ST | |
| 4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 透明指甲油 | Fisher Scientific | S30697 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | L6815 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| 培养箱 | Boekel Scientific | 133000 | |
| 载玻片加热板 | Fisher Scientific | 11-474-521 | |
| 香柏油，A型，ND = 1.515 | 尼康仪器公司 | MXA20234 | |
| 尼康90i显微镜，具备微分干涉差（DIC）功能 | 尼康仪器公司 | MBA 77000 | |
| Plan APO 100X 油镜 | 尼康仪器公司 | MRD01901 | |
| Plan Achro 20X | 尼康仪器公司 | MRL00202 | |
| FITC滤光片 | 尼康仪器公司 | 96302 | |
| DAPI滤光片 | 尼康仪器公司 | 96301 | |
| X-cite 荧光光源 | 尼康仪器公司 | 87540 | |
| 镜头纸 | 尼康仪器公司 | 76997 | |
| 生物危害性废弃物处理袋 | Fisher Scientific | 01-829D | |
| 生物危害锐器容器 | Fisher Scientific | 14-827-117 | |
| 3 % 过氧化氢 | VWR 国际公司 | BDH3540-2 | |
| 漂白剂 | Fisher Scientific | 1952030 | |
| Wypall | Kimberly Clark | 34790 |
参考文献
- DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952(2002).
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- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
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