利用蒸发通量法（EFM）测定叶片水力导度和气孔导度及其对光照和脱水的响应

摘要

我们介绍一种相对较快速（30 分钟）且适用于蒸腾状态下离体叶片的叶水力导度（K_leaf）与气孔导度（g_s）同步测定的实用方法。该方法可经修改后用于测定 K_leaf 和 g_s 对光照和脱水的响应。

摘要

水是一种关键资源，植物的水分运输系统决定了其最大生长潜力和抗旱能力的上限。当植物打开气孔以实现高气孔导度（g_s）来吸收光合作用所需的CO₂时，水分会通过蒸腾作用散失^1,2。空气腔中蒸发的水分由细胞壁补充，进而从叶脉的木质部吸水，再依次从茎和根的木质部中吸取水分。当水被拉过整个系统时，会遇到水力阻力，从而在整个系统中产生张力，并导致叶片水势（Ψ_leaf）降低。叶片本身是整个植物系统中的关键瓶颈，平均占植物水力阻力的30%³。叶片水力导度（K_leaf = 1/叶片水力阻力）是指通过叶片的水流速率与水势梯度之间的比值，它概括了一个复杂系统的整体行为：水分经叶柄和多级叶脉运输，从维管束鞘释放后，穿过或绕过叶肉细胞，最终进入空气腔并经气孔蒸腾出去。K_leaf作为一个重要的生理性状，受到广泛关注，可用于比较不同物种之间叶片结构与生理在水分运输方面的有效性，也是研究其与结构变异（例如，叶脉构型）关系及其对光合气体交换影响的关键变量。此外，K_leaf对叶片内外环境变化具有显著响应³。K_leaf可随光照强度显著增加，这可能与参与膜上水分运输的水通道蛋白（aquaporins）的表达和活化状态改变有关⁴；而在干旱条件下，K_leaf则显著下降，原因包括木质部导管发生空穴化和/或塌陷，以及由于叶肉细胞和维管束鞘细胞收缩或水通道蛋白失活导致的木质部外组织通透性降低^5-10。由于K_leaf在水分充足条件和干旱过程中均可限制不同物种的g_s和光合速率，从而影响整株植物的表现，因此它可能在决定物种分布格局中起重要作用，尤其是在干旱事件频率和强度不断增加的背景下^11-14。

我们介绍一种用于离体叶片同时测定K_leaf和g_s的简单方法。将正在蒸腾的叶片通过其叶柄连接至通向置于天平上的水源的管路。通过记录天平上水分的损失量来计算流经叶片的流速。当达到稳态蒸腾（E，mmol • m^-2 • s^-1）时，通过除以水汽压亏缺来确定g_s，而K_leaf则通过除以利用压力室测定的水势驱动力来计算（K_leaf=E / -Δψ_leaf，MPa）¹⁵。

该方法可用于评估 K_叶 不同辐照度下的响应及其脆弱性 K_叶 脱水^14,16,17.

方案

1. 测定充分水合叶片的叶片导水率（K_max）

1. 最好在傍晚或夜间采集枝条，以确保木质部张力较低，在空气中切割后放入装有湿润纸巾的黑色塑料袋中。在实验室中，将每根枝条末端在水下重新剪切至少两个节段。将枝条在纯水中或用于测定K_leaf的其他溶液中重新水合过夜。除非将不同溶液的影响作为研究因素，否则推荐使用超纯水作为流动溶液。
2. 在部分脱气的流动溶液中，用锋利的剃刀片将叶片从枝条上切下。除非将不同溶液的影响作为研究因素，否则推荐使用超纯水作为流动溶液。建议使用真空泵在烧瓶中对溶液脱气过夜，但也可采用其他方法。
3. 将预先拉伸的Parafilm封口膜缠绕在叶柄上，以确保叶柄与导管之间形成良好密封。此步骤对于非圆形叶柄尤其重要，因为额外缠绕Parafilm可使叶柄更接近圆形，便于插入导管。在缠绕Parafilm前，可在叶柄上涂抹牙科用密封膏以填充叶柄上的沟槽。
4. 在超纯水中将叶片连接至硅胶导管，以防止空气进入系统。当叶片被抬高至水源上方时，导管内的水处于亚大气压状态，因此若在测量过程中无空气被吸入导管，则表明密封良好。除直接将叶柄密封于硅胶导管外，也可使用带橡胶垫圈的压紧接头（例如，(Omnifit A2227 bore adaptor; Omnifit, Cambridge, UK)）；该方法适用于形状特别复杂的叶柄，或草本植物的叶片，可将叶片缠绕在玻璃棒上，并用压紧接头密封。在条件允许的情况下，直接将叶柄密封于硅胶导管具有操作快速、叶柄-导管连接处透明的优点，便于观察气泡。导管将叶片连接至通向置于天平（±10 μg分辨率）上的量筒的硬质导管，天平每30秒向计算机记录一次数据（例如使用“Balance Link”软件；Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Switzerland），用于计算通过叶片的流速。
5. 应将叶片正面朝上固定在由鱼线悬挂的木制框架中，置于大型风扇上方，并在光源下（光合有效辐射 > 1,000 μmol • m² • s^-1，用于高辐照度测量），略高于量筒中弯月面的位置。应将叶片置于量筒水面之上，以确保流向叶片的水分由蒸腾作用驱动，而非因重力作用使水在压力下进入叶片（若叶片位于量筒水面下方则会发生此情况）。在天平腔内放置装有湿润纸巾的小容器，以确保天平内部空气饱和湿润，避免水源向天平内大气蒸发。可通过在导管中使用四通旋塞阀阻断流向叶片的水流，并检查天平上量筒的水质量是否下降，来验证是否存在蒸发。
6. 在叶片上方放置一个装有水的透明Pyrex容器，以吸收灯的热量。
7. 在整个实验过程中，通过向Pyrex容器中添加更多冷水，将叶片温度维持在23 °C至28 °C之间，使热灯不会使Pyrex容器升温至足以加热叶片下方空气的程度。
8. 让叶片在装置上蒸腾至少30分钟，以充分适应高辐照度环境，并持续至流速稳定，无上升或下降趋势，且在30秒间隔下连续5–10次测量的变异系数 <5%。流速达到稳态至关重要，因为该方法假设Ψ_leaf保持稳定。先前研究发现，这些标准足以使流速（E）、Ψ_leaf和K_leaf达到稳定；在七种叶电容差异较大的物种中，稳定流速建立后延长测量时间的测试显示，K_leaf与测量时间无相关性^17,18。通常稳定过程在30分钟或更短时间内完成，但在某些物种中可能需要超过一小时。

注意：当流速非常低（<8 μg s^-1）时，可通过最近五个30秒时间间隔的运行平均值来确定稳定性。

9. 若气流突然发生变化，无论是由于气孔突然关闭，还是密封处出现明显泄漏，或系统中存在颗粒物或气泡导致堵塞，均应舍弃该次测量数据。
10. 当气流稳定后，使用热电偶记录叶片温度。
11. 迅速将叶片从导管上取下，用吸水纸轻轻吸干叶柄，然后将叶片放入先前已呼气使其充满水汽的可密封袋中，以停止蒸腾作用。
12. 将叶片置于袋中平衡至少20 min。
13. 取最后10次流速测量值的平均值。该值将作为你的 E 测量
14. 当叶片达到平衡后，测定叶片的最终水势（Ψ_最终) 使用压力室。
15. 使用平板扫描仪和图像处理软件或叶面积仪测量叶面积。
16. K_叶 计算公式为 E / -ΔΨ_叶 （其中 ΔΨ）_叶 Ψ_最终 - 0 MPa）并按叶面积进行归一化处理。单位为 mmol m^-2 s^-1 MPa^-1由于叶片位置仅略高于量筒中的水面，重力对进入叶片的水分所产生的压力降低作用可忽略不计，尤其是相对于Ψ而言。_最终，这始终是 > -0.1 MPa
17. 为校正变化 K_叶 由水的黏度随温度变化而引起^15,19,20 ，标准化 K_叶片 值到 25 °C 通过使用以下公式：

18. 气孔导度（g_s）可通过蒸腾速率（E）除以叶片与空气之间的水汽压差来确定，该水汽压差等同于水汽压亏缺（VPD），通过叶片附近的温度和相对湿度传感器测定。VPD 使用以下公式计算²¹

其中 RH 为相对湿度，VP 为空气的饱和蒸气压（单位为 kPa；根据 Arden Buck 公式²²，其为温度的函数），AP 为大气压（单位为 kPa）。

2. 测定脱水叶片的叶片导水率

1. 最好在傍晚或夜间采集枝条，以确保木质部张力较低，在空气中剪切后放入装有湿润纸巾的黑色塑料袋中。在实验室中，将每根枝条末端在水下重新剪去至少两个节段。将枝条置于纯水或其他待用溶液中，静置过夜使其充分复水 K_叶片 测量。除非将不同溶液的影响作为因素进行研究，否则建议使用超纯水作为流动相溶液。
2. 在超纯水中将茎段切割成至少带有三片叶子的小段，并使用风扇在不同时间段内对茎段进行脱水处理，使其水势（Ψ）达到一定范围_叶片 值。
3. 待枝条脱水后，将预先呼气过的密封袋（Whirl-Pak；Nasco，Fort Atkinson，WI，USA）分别套在枝条的每一片叶子上，然后将整个枝条放入一个较大的密封袋中，并放入湿润的纸巾。
4. 让枝条平衡至少30分钟（对于严重失水的枝条，可能需要更长的平衡时间）。
5. 平衡后，剪下顶部和底部叶片，测定初始Ψ_叶 (=Ψ_o) 使用压力室。
6. 如果 Ψ 的差异过大，则舍弃该茎段_叶 这两个叶片之间的水势差大于0.1 MPa（对于严重脱水的叶片，此范围可扩展至0.3 MPa）。
7. 第三片叶子随后用于确定 K_叶 和 g_s 使用EFM，按照上述步骤1.2–1.18进行操作。值得注意的是，即使对于严重脱水的叶片，仍可获得稳态E值，因为气孔仍能开启并产生 g_s 显著高于表皮导度的数值¹⁷.
8. 为了构建水力脆弱性曲线，计算 K_叶 使用 Ψ_最终 如步骤 1.16 所述，然后绘制 K_叶 以最低值为基准的数值，Ψ_o 或 Ψ_最终, 即，叶片在实验期间经历的最强脱水程度（=Ψ_最低）。类似地，衰退的 g_s 通过绘制叶片脱水响应曲线可确定 g_s 抗 Ψ_最低先前的研究表明，脱水会导致至少部分不可逆的下降 K_叶 和 g_s^14,16.
9. 我们建议至少获取6个 K_叶 每0.5 MPa Ψ值间隔的数值_最低 （如果所研究的物种对脱水极为敏感，此间隔可减小至 0.25 MPa。）
10. 对...执行迪克森异常值检验 K_叶 每个0.5 MPa水势区间Ψ的数值_最低 去除脆弱性曲线中的异常值²³.
11. 因为物种在反应上存在差异 K_叶 和 g_s 脱水^14,16，为每个物种拟合不同的函数，并选择最大似然估计（最低AIC值；参见 ¹⁴ 有关详细信息，请参见文献）。我们建议至少拟合四种先前在文献中使用过的函数：线性（），S形（sigmoidal））、逻辑（logistic）) 和指数（).

3. 代表性结果

叶片水力导度随脱水而下降的程度在不同物种间存在显著差异（图1）。在高光强（PAR > 1,000 μmol • m^-2 • s^-1）条件下测量时，干旱敏感物种在水分势尚未达到较负值时即表现出更强烈的下降，而抗旱性较强的物种则相对稳定。Helianthus annuus（中生草本植物）在水力导度丧失80%时的水分势（P₈₀）比原产于加利福尼亚灌丛区的Heteromeles arbutifolia高出3 MPa。Heteromeles arbutifolia对水分势下降呈线性响应，而Helianthus annuus则表现为非线性下降。

气孔导度（g_s）和叶片水力导度（K_leaf）对光照强度也有显著响应（图2）。对于Raphiolepis indica，在高光照（PAR > 1,000 μmol • m^-2 • s^-1）和实验室光照（PAR < 6 μmol • m^-2 • s^-1）条件下测量的叶片，其气孔导度随脱水过程显著下降。在高光照下，使用EFM测量的、脱水至典型中午光照植株叶片水势的离体叶片，其g_s与使用气孔计在完整植株上测量的叶片结果相似（图2中的星号所示）。值得注意的是，在最大吸水状态下，暴露于高光照的叶片其K_leaf比低光照下的高出四倍（分别为11与2.8 mmol m^-2 s^-1 MPa^-1），因此在充分吸水的叶片中，K_leaf对光的响应强于g_s。此外，在高光照下，K_leaf随脱水下降更为显著。P₈₀在高光照下比低光照下低0.93 MPa（即更偏正值）。

图1. 一种干旱敏感型（上图）和一种干旱耐受型（下图）植物物种的叶片水力脆弱性曲线（引自^14,24）。每个数据点代表使用蒸发通量法（EFM）对离体叶片测得的单次叶片水力导度（K_leaf）测量值。垂直条线表示该物种叶片水力导度下降至初始值80%时对应的水势（P₈₀）。两条物种的最佳拟合函数均通过最大似然法绘制。

图 2. 在高光强与低光强条件下（来自¹⁶），Raphiolepis indica 的气孔导度（g_s）和叶片水力导度（K_leaf）随叶片水势下降的变化响应。（光合有效辐射 PAR > 1,000 和 < 6 mmol • m^-2 • s^-1）。每个数据点代表使用蒸发通量法（EFM）对离体叶片进行的一次单独测量，其中白色和黑色圆点分别表示在高光强和低光强下测得的叶片。高光强与低光强下气孔导度曲线的方程分别为： 和 。高光强与低光强下脆弱性曲线的方程分别为： 和 。上图中的灰色星号表示使用气孔计在中午时分对完整植株叶片测得的 g_s 与叶片水势的平均值 ± 标准误。下图中的灰色和黑色竖条分别表示在高光强和低光强下，该物种的初始叶片水力导度丧失 80% 时对应的水势（P₈₀）。

讨论

本文介绍的蒸发通量法可在实验室中相对快速地（30分钟）测定叶片水力导度，同时测量气孔导度。

到目前为止，EFM 是最接近叶片中水分自然传输途径的方法，因为水分在叶片气腔中蒸发，并通过气孔扩散¹⁵。目前存在多种其他用于测定 K_leaf 的实验方法²⁵，其中三种尤为常见。（1）在高压流法（HPFM）中，通过施加高压使水流经叶片^15,26。然而，该方法无法获得脆弱性曲线，因为施加的正压可能使栓塞重新充水并使叶肉组织再水合。（2）在再水合动力学法（RKM）中，K_leaf 的计算基于脱水叶片再水合过程与电容器在电阻串联电路中充电过程的类比^27,28。该方法速度快，但不能完整再现叶片中自然蒸腾路径的整个系统，且难以改造以测量经高光强驯化的叶片。（3）在真空泵法（VPM）中，将叶片置于密闭室中，其叶柄连接至置于天平上的水源，同时对叶片施加不同强度的真空，促使叶片失水^15,26。该方法可能耗时较长。研究发现，这三种方法的测量结果具有一致性^15,28,29，因此 EFM 因其基于蒸腾驱动的水分运动、相对快速，以及可改造用于在不同条件下测定 K_leaf 而被广泛使用。

所有用于测定 K_leaf 的常规方法在准确量化与蒸腾作用相对应的驱动力方面均存在一定程度的不确定性²⁵。在压力室法（EFM）中，用于计算 K_leaf 的 ΔΨ_leaf 低于真实的驱动力，因为该方法基于叶片在压力室中平衡后的整体 Ψ_leaf。此时，整体 Ψ_leaf 并不一定代表水分在水分传导路径末端蒸发部位细胞的水势，而是少数正在失水并蒸发的低水势细胞与数量较多但可能已脱离蒸腾流的高水势细胞之间的一种体积加权平均值。因此，Ψ_leaf 与真实驱动力之间的差异程度取决于水分在叶片中的蒸发位置。如果水分在整个叶片中均匀蒸发，则整体 Ψ_leaf 可能接近真实的驱动力；而如果水分仅从靠近气孔的少数细胞中蒸发，则整体 Ψ_leaf 可能显著低估真实驱动力，即，这些细胞的实际水势可能要低得多，因此实际的 K_leaf 将低于通过 EFM 测定的结果。因此，EFM 所测定的 K_leaf 在多大程度上反映真实的 K_leaf，取决于水分流动路径，而这些路径目前尚未被充分理解。尽管 EFM 提供的数据与其他测定 K_leaf 的方法结果一致（见上文），且适用于比较研究，但不同物种间水分在叶肉中流动路径的差异仍需进一步研究。事实上，即使是同一物种的叶片，这些水分路径在不同条件下也可能发生变化，例如，在不同光照强度和热负荷下^4,30，或在不同水分状况下（考虑到组织收缩）³¹。对水分运输路径的进一步了解将有助于利用 EFM 解析路径变化对整体叶片水分传导的影响。

使用EFM测量气孔导度的优点在于能够测定气孔对光照和脱水的响应，并提供与g_s相匹配的K_leaf响应。此外，该方法还可用于评估叶片先前经历脱水后再复水对g_s的影响。然而，该方法存在两个潜在缺点：第一，该g_s测量是在离体叶片上进行的，而非在完整植株上进行；第二，气孔导度的测定依赖于距离叶片一定距离处的气候参数测量，而不是像气孔计小室那样在紧邻叶片的位置进行测量，尽管风扇对叶片的通风作用可使叶表面与周围空气达到平衡。对于某些物种而言，离体叶片的气孔响应可能与完整植株上的叶片不同^16,32。然而，对于多个物种，在中午叶水势（Ψ_leaf）条件下，利用EFM估算的g_s值与使用气孔计在完整植株上测得的数值相似¹⁶（图2）。

EFM 可用于生理学研究，例如，探究 K_leaf 的动态变化、其结构与解剖学基础，以及其对环境因素的响应。此外，该方法还可用于比较在不同条件下生长的特定物种植物、不同年龄的植物，或比较适应不同环境的不同物种植物。

通过构建叶片脆弱性曲线，可以深入了解物种对干旱耐受性的机制。在干旱过程中，某些物种的叶片木质部会发生气穴化和细胞塌陷，而脱水期间叶肉细胞的收缩也可能影响水分运输（详见文献¹⁴）。未来的研究需要确定这些过程中每一个在导致叶片导水率（K_leaf）下降和气孔关闭中的相对重要性。

光照强度也是影响叶片导水率（K_leaf）的重要因素，而EFM非常适用于高光照强度下的测量。集光与干旱对水通道蛋白的联合响应应受到更多关注。高光照强度会增加水通道蛋白的表达和/或激活，促进水分在活细胞中的快速运输，从而提高K_leaf；而脱水则导致水通道蛋白的表达减少和/或失活，降低K_leaf。光照强度与水分供应对K_leaf的联合影响仍需进一步研究^4,10,16,33。

此外，在不同物种间，K_leaf 及其脆弱性与物种分布相关，反映了物种对光、水及其他资源供给的适应^3,13,24。来自干旱地区的物种通常表现出更强的抗水力衰退能力，能够耐受更低的土壤水势；通过在更低水势下维持较高的 K_leaf，它们能够保持较高的 g_s，持续吸收 CO₂ 以进行光合作用^13,14。因此，叶片水力特性的研究可揭示细胞、叶片及整株植物水平上的生理机制及其对环境的响应，有望在各个尺度上产生大量重要的新发现。