利用标准的可互换DNA元件（BioBricks），设计了一种用于修复石油污染的可持续自调控细菌系统。通过β-氧化途径，构建的大肠杆菌（E. coli）菌株可在有毒水环境中降解烷烃。来自不同物种的相应酶均表现出烷烃降解活性。此外，通过引入来自烷烃耐受性细菌的基因，实现了对正己烷（n-hexane）耐受性的提高。
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摘要
摘要
本研究提出了一种可实现大肠杆菌（Escherichia coli）转化烷烃的工具箱，并验证了其应用的可行性。该工具箱由多个标准化且可互换的元件（BioBricks）9组成，分别用于烷烃的转化、基因表达的调控以及在富含毒性烃类环境中的生存。
一种用于烷烃降解的三步途径被构建于 E. coli 以实现中长链烷烃向相应的烷醇、烷醛以及最终的烷酸的转化。后者通过宿主固有的β-氧化途径进行代谢。为促进中链烷烃（C5-C13）和环烷烃（C5-C8）的氧化，引入了四个基因（alkB2, rubA3, rubA4和 rubB烷烃羟化酶系统 戈登氏菌属 sp. TF68,21 被转化到 E. coli对于长链烷烃（C15-C36）的转化，ladA 基因来自 Geobacillus thermodenitrificans 已实施。对于降解过程所需的后续步骤， ADH 和 ALDH（源自 G. thermodenitrificans被引入10,11通过静息细胞实验测定活性。每个氧化步骤均观察到酶活性。
为了优化过程效率，仅在低葡萄糖条件下诱导表达：使用了一种底物调控型启动子 pCaiF。pCaiF 存在于 E. coli K12 中，可调控参与非葡萄糖碳源降解相关基因的表达。
工具包的最后部分——靶向生存能力——通过溶剂耐受基因 PhPFDα 和 β 实现，二者均来自 Pyrococcus horikoshii OT3. 有机溶剂可通过对蛋白质折叠产生负面影响，诱导细胞应激并降低细胞存活率。作为分子伴侣，PhPFDα 和 β 能够改善蛋白质折叠过程 例如 在烷烃存在条件下。这些基因的表达提高了菌株对碳氢化合物的耐受性，表现为在10%烷烃存在下生长速率提高（最高达50%） n在培养基中观察到正己烷。
综上所述，实验结果表明该工具包能够使大肠杆菌（E. coli）在水相环境中转化并耐受烃类物质。因此，这代表了利用合成生物学方法实现石油污染治理可持续解决方案的初步进展。
引言
石油污染是造成环境污染最严重的原因之一，对生态系统、企业和社区产生重大影响3。例如，加拿大阿尔伯塔省油砂尾矿废水持续产生的石油污染亟需解决方案。在从油砂中提取原油的过程中，采用热回收技术去除沥青（一种半固态的氧化石油形式），每提取一桶原油约消耗3.1桶水1。含油的工艺废水主要来自当地河流，在沥青提取后被储存在尾矿池中。为了减少对淡水的取用需求，亟需更高效地回收利用工艺废水。为了促进沥青的提取，并确保下游水体达到保护水生生态系统的水质标准，工艺废水处理技术正在迅速发展3。
为了治理有机化合物污染，目前鼓励采用利用微生物的生物修复技术1。烷烃是原油中最丰富的烃类家族，每分子含有5至40个碳原子7, 21。已知许多细菌可通过逐步氧化末端甲基，将不同链长的烷烃依次转化为醇、醛，最终生成脂肪酸，从而实现降解8。在本iGEM项目中，来自不同生物体的多种酶被表达并进行了表征，并通过BioBrick标准及标准生物元件注册库提供使用。
对 Gordonia sp. TF6 中研究较为深入的烷烃羟化酶系统，可在最少四个组分的参与下催化 C5-C13 烷烃以及 C5-C8 环烷烃的初始氧化步骤，这四个组分包括....
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方案
1. BioBrick 组装
- 来自标准生物部件注册库（Registry of Standard Biological Parts）的 BioBrick 由 iGEM 总部提供。要利用已有 BioBrick 构建新的 BioBrick，可使用 EcoRI 和 SpeI 酶切供体 BioBrick（最多 1.0 μg），以将供体部件定位在受体部件的下游；若要将供体部件定位在受体部件的上游，则使用 XbaI 和 PstI 进行酶切。同时添加第三种合适的限制性内切酶，用于切割供体的质粒骨架。根据供应商说明，在适当的缓冲液中进行酶切反应，总体积为 20–25 μL（终浓度为 1×）。限制性内切酶的用量为 5 单位/μg DNA。
- 使用 EcoRI 和 XbaI 或 SpeI 和 PstI 酶切受体 BioBrick。
- 在 37 °C 下孵育酶切反应体系至少 1 小时。通过 80 °C 加热 10 分钟使限制性内切酶失活，并短暂离心。
- 将酶切后的 BioBrick 部件（供体与受体）连接在一起。由于 XbaI 和 SpeI 产生兼容性 DNA 末端，因此会形成一个无法被任何限制性内切酶切割的杂合位点，从而生成一个新的“组合型” BioBrick，其两侧由 4 个标准限制性酶切位点所包围。连接反应体系中 DNA 的终浓度建议约为 100 ng/μL。在 T4 连接缓冲液（终浓度 1×）和 T4 DNA 连接酶（1 单位/μg DNA）存在下，总体积为 10–15....
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结果
烷烃转化
通过静息细胞实验和酶活性测定，评估了从烷烃到相应脂肪酸的三个氧化步骤的活性。结果按照代谢途径的反应顺序呈现：（1）烷烃羟化酶，（2）醇脱氢酶，以及（3）醛脱氢酶。
对于第一步，分别构建了用于中链和长链烷烃的质粒。BBa_K398014 质粒包含中链烷烃氧化所需的烷烃羟化酶（AH）系统的四个基因：alkB2、rubA3、rubA4 和 rubB，这些基因由一个单一的组成型启动子（BBa_J23100）调控。以携带质粒 BBa_J13002 的 E. coli K12 作为阴性对照。通过酶活性测.......
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讨论
BioBrick 原则被用于构建降解烷烃的底盘系统，并对工具包中各单一组分进行了原理验证。提出了多种检测方法以测量 体内 和 体外 烷烃降解途径酶的活性。本研究所展示的方法成功地证明了可用于测定宿主生物中酶活性与表达水平的多种技术 E. coli 在引入合适的生物砖（BioBricks）后，进一步证明了生物砖原理可用于设计一种表达降解烷烃所需蛋白的生物体，该生物体具备仅在需要时才产生这些酶的调控系统，并能在烃类存在条件下增强宿主生物的耐受性。经过进一步优化后，该底盘系统可应用于残余石油的生物降解。 例如 在油砂尾矿水中，或用于石油工业废水的处理。
关于烷烃降解，通过实验对参与烷烃降解第一步反应的酶（AH系统和ladA）进行了表征。结果表明，一种 E. coli 携带AH系统的菌株 戈登氏菌属 sp. TF6 能够转化辛烷 体内 这一发现与藤井的结果一致 等 8，其中发生生物转化 n-烷烃的使用
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致谢
本视频文章中描述的实验是为国际基因工程机器大赛 9 设计的。作者谨此感谢 iGEM 团队成员 Luke Bergwerff、Pieter T.M. van Boheemen、Jelmer Cnossen、Hugo F. Cueto Rojas 和 Ramon van der Valk 在研究过程中提供的协助。感谢 Han de Winde、Stefan de Kok 和 Esengül Yıldırım 提供的有益讨论及对本研究的支持。本工作得到了代尔夫特理工大学生物技术系、代尔夫特生物信息学实验室、代尔夫特理工大学生物纳米科学系、油砂领导力倡议（OSLI）、StuD 学生派遣局、荷兰基因组学倡议、Kluyver 中心、荷兰生物技术协会（荷兰生物技术基金会）、DSM、Geneart、Greiner bio-one 和 Genencor 的资助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 K12 | New England Biolabs | C2523H | |
| 辛烷 | Fluka | 74822 | |
| 十六烷 | Fluka | 52209 | |
| 1-辛醇 | Fluka | 95446 | |
| 1-十二醇 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
| 己烷 | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| NADH | Sigma-Aldrich | N4505 | |
| FMN | Sigma-Aldrich | F2253 | |
| MgSO4 | J.T. Baker 货号 | 7487 889 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| T4 连接酶 | New England Biolabs | M0202L | |
| 气相色谱仪 | |||
| 细胞破碎仪 | LA Biosystems | CD-019 | |
| 分光光度计 | Amersham pharmacia | spec 2000 | |
| 酶标仪 | Tecan Group Ltd. | Magellan v7.0 | |
| 培养箱 | Innova, 44 | ||
| BioBrickTM K398014：BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398014 | 烷烃羟化酶系统 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398027：BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398027 | ladA 蛋白生成器 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398018：BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398018 | ADH 基因片段生成器 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398030：BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398030 | 醛脱氢酶（ALDH）生成器 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398326： pCaiF | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398326 | pCaiF 启动子 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398331： pCaiF- BBa_B0032 - BBa_I13401 | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398331 | pCaiF 测量装置 抗性：氯霉素 |
| BioBrickTM K398406：BBa_J23002-BBa_J61107-PhPFDαBBa_J61107- | 代尔夫特理工大学生物技术系或标准生物部件注册中心 | BBa_K398406 | 溶剂耐受基因簇 抗性：氯霉素 |
参考文献
- Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
- Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological C....
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重印与许可
