无需电力的核酸与蛋白质分步提取法

摘要

介绍了一种无需电力即可从样品中依次分离核酸和蛋白质的工具及化学方法。该工具由固定在移液管内的吸附剂组成，分离化学方法基于固相萃取原理。所分离的生物大分子可通过基于免疫检测和PCR的分析方法进行检测。

摘要

传统和新发的病原体，如肠出血性大肠杆菌 大肠杆菌 （肠出血性大肠杆菌）， 鼠疫耶尔森菌， 或朊病毒相关疾病对全球各国政府、产业界和医疗专业人员而言均构成重大关切。例如，产志贺毒素大肠杆菌（EHECs）与 志贺氏菌每年导致约32.5万名儿童死亡，在发展中国家尤为普遍，而基于实验室的病原鉴定（在美国较为常见）在这些地区往往无法实现 ¹低成本、基于现场的即时检测工具的开发与推广，有助于快速鉴定或诊断病原体或疾病标志物，可能显著改变疾病进展和患者的预后。我们开发了一种无需电力或配套实验室设备、通过固相萃取（SPE）从样本中分离核酸和蛋白质的工具。 ²分离得到的大分子可用于实验室或基于现场的即时检测平台进行诊断。重要的是，该方法能够对未分割的同一样本直接进行核酸和蛋白质数据的比较，通过基因组和蛋白质组分析的相互印证，提高检测结果的可信度。

我们的分离工具采用行业标准的固相核酸分离技术——BOOM 技术，该技术通过硅基颗粒或滤膜从变性盐溶液（通常为异硫氰酸胍）中结合并分离核酸³。CUBRC 专有的固相萃取化学方法则用于从变性盐溶液中纯化蛋白质，此处是从核酸分离后的废液或穿流液中进行纯化⁴。

通过将性能明确的化学试剂集成到一个小型、廉价且操作简便的平台上，我们开发出一种便携式的核酸与蛋白质提取系统，可在多种条件下进行操作。所提取的核酸具有良好的稳定性，可运输至具备电源的场所进行PCR扩增；而蛋白质组分则可立即用于手持式或其他基于免疫学的检测方法进行分析。在野外快速鉴定疾病标志物，有助于在疾病进展的早期阶段即指导采取正确的治疗方案，从而显著改善患者的预后。本文所述的工具与方法几乎适用于所有类型的病原微生物，能够在降低操作与后勤负担的同时，为使用者提供针对多种大分子类型的并行分析冗余能力。

方案

1. 样品裂解

1. 样品应为液态。若样品为固态（如食物或粪便），应将其悬浮于水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）等液体介质中。
2. 在1.5 mL离心管中，将500 μL样品与500 μL 6M硫氰酸胍（pH 6.5）混合。
3. 按压提取移液管的吸头，排出其中的空气。
4. 缓慢释放吸头，使其逐渐膨胀，将全部1 mL样品通过吸附材料吸入提取移液管中。
5. 将提取装置倒置，使吸附珠和样品流入吸头部分。
6. 在吸头内将吸附珠与样品充分研磨，注意避免将样品从提取移液管中挤出。

2. 核酸提取（图1，图版 A）

1. 将提取移液管倒置（开口向下），并将样品排入原来的 1.5 mL 离心管中。
2. 以适中速度将全部 1 mL 样品吸入提取移液管，使其流经吸附剂，注意保持吸附剂位于提取移液管的颈部。
3. 按压吸球，将全部样品排入 1.5 mL 离心管中。
4. 重复步骤 2.2 和 2.3，使样品再经过吸附剂 4 次，共完成 5 次过柱。
5. 第五次过柱后，将全部 1 mL 样品排入含有 4 mL 蛋白提取缓冲液的 15 mL 尖底离心管中，盖紧管盖，留待后续使用。
6. 用 1 mL 95% 乙醇重复过柱洗涤 3 次，以洗涤分离的核酸，最后一次过柱后将乙醇返回至原管。
7. 使用另一份 1 mL 95% 乙醇，重复步骤 2.6 进行第二次洗涤。
8. 按压并释放吸球持续 5 分钟，使环境空气流经整个提取移液管，以干燥核酸/吸附剂层。用无尘纸（Kimwipe）擦拭提取移液管尖端残留的乙醇。
9. 用 250 μL 10 mM Tris 缓冲液（pH 6.8）重复过柱 5 次，以洗脱核酸。Tris 缓冲液可用其他合适的水溶液（如 PBS）替代。所得溶液即为提取的核酸溶液。

3. 蛋白质提取（图1，图版B）

1. 将步骤2.5中的样品与蛋白质提取缓冲液管通过倒置混合，并将约2至3毫升的该5 mL样品通过新的提取移液管的吸附剂。
2. 将全部样品排入同一个15 mL离心管中，注意保持吸附剂留在提取移液管的颈部。
3. 重复步骤3.1和3.2，使样品在吸附剂上通过15次。
4. 用1 mL的95%乙醇在吸附剂床中洗涤3次，以清洗吸附剂及结合的蛋白质，每次将乙醇排入其原始试管中。
5. 使用第二份1 mL的95%乙醇重复步骤3.4进行洗涤。
6. 按压并释放吸球5分钟，使环境空气通过整个提取移液管，以干燥蛋白质/吸附剂床。用无尘纸擦去提取移液管尖端残留的乙醇。
7. 通过在吸附剂上重复5次加入250 μL PBS来回收蛋白质。PBS缓冲液可替换为其他合适的水溶液，例如10 mM Tris（pH 6.8）。所得溶液即为样品中的蛋白质组分。

图1.

图2.

图3.

图 4.

图 5.

结果

核酸分离：分离的核酸可进行PCR扩增，且无蛋白质污染。

示例1：回收的核酸适用于基于PCR的应用。例如， 图2 显示与肠出血性大肠杆菌相关的志贺毒素基因的扩增 大肠杆菌 O157:H7 菌株 EDL-933（ATCC # 35150）来自使用提取移液管进行核酸/蛋白质提取的实验步骤。志贺毒素基因 stx1 和 stx2 存在于本种及其他肠出血性大肠杆菌中的温和型λ样噬菌体和缺陷型噬菌体上 E. coli 在P的调控下菌株_R 启动子 ^{5 6 7 8}SOS反应的激活在 E. coli 导致前噬菌体诱导和/或毒素产生 ⁹我们采用了一种经改良的Feng多重PCR检测方法 等.¹¹ 以鉴定 stx1 和 stx2个基因，在培养物和加标污水样本中。泳道A和B 图2 显示未处理培养样品（泳道 A）和已处理培养样品（泳道 B）的 PCR 扩增结果。这些结果几乎完全相同，表明在处理或分离的核酸中没有保真度损失。接下来，我们对加标原始污水（泳道 D）以及从加标污水中分离的核酸（泳道 E）进行了扩增 & F)。这些数据表明，与未提取的加标污水样本中的核酸相比，提取后的核酸产生了更强的扩增效果。因此，我们得出结论：在提取过程中，可能去除了污水中天然存在的PCR抑制物，或在提取过程中对核酸进行了浓缩。这两种假设的共同作用也是可能的。

接下来使用紫外光谱法证明所分离的核酸相对不含污染性蛋白质。图3展示了两种E. coli O157:H7核酸提取物（标记为提取a和提取b）的紫外光谱，并与标记为提取前的细菌培养物的归一化光谱进行比较。所分离核酸的紫外光谱类似于纯核酸的光谱，其在260 nm与280 nm处的吸光度比值接近1.8¹⁰。这些数据表明，采用所述技术回收的核酸组分中几乎不含污染性蛋白质。

蛋白质分离：从核酸/蛋白质分离实验中回收的蛋白质具有免疫反应性，并且在电泳上与纯蛋白质完全相同。

示例2：将分离的蛋白质组分加入RapidChek E. coli O157侧向流动检测条（SDIX, Inc.）中。对照显示，所有含有E. coli O157的样本均呈阳性鉴定结果，无论是否进行STX诱导（图4，分别为B道和C道）。图4中的数据还显示，那些含有E. coli O157的样本在经提取移液管进行核酸提取后再进行蛋白质处理的，也得到阳性结果。这些数据表明，从每个样本中分离出的蛋白质具有免疫反应性，因而引发阳性反应。

对蛋白质样品进行PCR扩增（如示例1所述），以验证分离得到的蛋白质组分中不含污染性核酸。这些实验的凝胶电泳结果均为阴性。因此，我们得出结论：样品中的蛋白质组分已与污染性核酸分离。综合核酸分离步骤所述结果可见，核酸与蛋白质组分通过不同的分级分离步骤得以分别纯化。

示例3：分离得到的蛋白质适用于电泳¹⁰。图5展示了一块经考马斯亮蓝染色的8%丙烯酰胺凝胶，其中加样孔加载了BSA（图5，泳道A和C）以及使用提取移液管及相关方案从6M异硫氰酸胍中分离得到的BSA。该分离蛋白质的电泳迁移率与对照样品完全相同。因此我们得出结论：提取过程未改变分离蛋白质的共价结构。

图1，图版A：典型的核酸提取流程示意图。 将样本与6M硫氰酸胍混合于样本管中，并通过吸附剂反复转移五次。最后一次通过后，将样本加入蛋白提取缓冲液中。吸附剂及其结合的核酸用乙醇洗涤两次。然后将样本空气干燥，并从吸附剂中洗脱。

图1，图版B：典型的蛋白质提取流程示意图。 将步骤1中与蛋白质分离缓冲液混合的样品（来自图1图版A）通过第二个提取移液器的吸附剂重复15次。其余操作步骤与核酸提取方案完全相同。

图2：溴化乙锭染色琼脂糖凝胶的负片图像。 使用培养样品（泳道A和B）或添加了 E. coli O157:H7 的原始污水样品（泳道D、E和F）进行了多重志贺毒素1和2基因扩增实验。样品直接加入PCR反应管（泳道A和D），或经核酸提取流程处理后将提取的核酸加入PCR反应管（样品B、E和F）。该PCR方案是对Feng et al¹¹ 所描述方法的改进，仅保留针对 stx1（下方条带）和 stx2（上方条带）引物对的扩增，去除了所有其他引物对。泳道C为BioRad公司的1 Kb DNA ladder。

图3：使用所述提取移液管分离的 E. coli O157:H7 核酸的紫外光谱结果。 分离的核酸标记为分离a和分离b。在核酸提取前也对样品进行了紫外光谱检测，标记为提取前。光谱数据使用日立U3010分光光度计及配套软件获得。

图 4：RapidChek 快速检测试纸条的彩色照片。 使用提取移液管分离 图 2 中所用样品的蛋白质，并通过侧向流动分析检测其免疫反应性。A–C 泳道为未经处理的对照，即直接将细胞培养物加入试纸条中，未进行核酸或蛋白质提取。泳道 A 为阴性对照 E. coli BL21 DE3 pLysS；泳道 B 和 C 显示未处理（B）或经丝裂霉素 C 处理 4 小时（C）的 E. coli O157:H7。D 至 H 泳道显示将提取的蛋白质加入侧向流动试纸条后的结果。D 和 E 泳道使用来自 E. coli BL21 DE3 pLysS 的蛋白提取物作为阴性对照，分别未经（D）或经丝裂霉素 C 处理（E）。F–H 泳道显示使用从 E. coli O157:H7 提取的蛋白质时的结果。蛋白质分别提取自未经处理（F）、经丝裂霉素 C 处理 2 小时（G）或 4 小时（H）的培养物。阳性结果呈现两条红色条带。

图5：考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶照片。 使用提取移液管及所述实验方案从溶液中分离BSA。泳道A和C分别为250 μg/mL和500 μg/mL的对照样品。泳道B和D显示从含有与相应对照相同浓度溶液中回收的BSA。

讨论

本报告中所述的工具、化学试剂和实验方案代表了首个已知的无需电力的多重大分子提取系统，可用于基于现场的即时检测应用。这两种大分子均可应用于多种下游诊断或分析设备。例如，分离得到的核酸具有适用于PCR的品质（图2和图3），而样品中的蛋白质组分具有免疫反应活性（图4）。在环境恶劣或资源有限的地区使用该提取系统，可显著减轻当地人群的疾病负担。此外，该提取系统还可通过在条件艰苦或偏远地区提供一种稳健、快速且成本效益高的样本处理方法，助力全球范围内的疾病监测项目。

上述提取方法的一个重要方面是用户可根据需要对其进行修改。例如，当样本体积大于或小于初始的500 μL（步骤1.2）时，用户可相应调整试剂的体积。也就是说，试剂与样本体积之间的比例应保持恒定，而绝对体积则可进行调整。此外，用户也可根据需要调整样本通过吸附剂的次数。例如，若使用更大的样本体积，可将样本通过吸附剂的次数增加至超过所列次数（步骤2.4和3.3），从而提高大分子类型（核酸或蛋白质）与吸附剂接触的可能性。增加通过次数可提高捕获效率，直至达到吸附剂的饱和状态。

我们发现，该提取工具及相关化学试剂存在一些局限性，其中最显著的是蛋白质提取化学试剂在回收高度糖基化蛋白质方面效率较低。如果下游诊断的目标是糖基化蛋白质，则该系统可能不适合用于鉴定。此外，核酸或蛋白质提取效率的上下限仍在确定中，目前正在进行优化以最大程度提高回收效率。该工具的进一步开发将弥补这些现有的知识空白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫氰酸胍	TEKnova, Inc.	G4000
乙醇	Pharmco-AAPER	11ACS200
2-丙醇	Sigma-Aldrich	109827-1L
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A-4503