一种大规模纯化APP胞内域（AICD）的方法。我们还描述了诱导该蛋白表达的方法 体外 通过原子力显微镜观察AICD的聚集与可视化。所述方法适用于AICD的生物化学/结构表征，以及分子伴侣对其聚集影响的研究。
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摘要
摘要
淀粉样前体蛋白（APP）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，与阿尔茨海默病（AD）的发病机制相关。APP具有一个大的细胞外结构域和一个较短的细胞质结构域，后者称为APP胞内结构域（AICD）。在通过分泌途径成熟的过程中，APP可被蛋白酶切割，这些蛋白酶被称为α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶。1. APP 经 β 和 γ-分泌酶的顺序蛋白水解切割后，产生一种称为 Aβ 的小分子蛋白水解肽，该肽具有淀粉样蛋白原性，是老年斑的核心成分。AICD 在分泌酶切割后亦从膜上释放，并通过与 Fe65 和 Tip60 相互作用，可转位至细胞核内，参与多种靶基因的转录调控2,3. 涉及AICD的蛋白质-蛋白质相互作用可能影响全长APP及其C端片段的转运、加工和细胞功能。我们最近发现AICD可发生聚集 体外，并且这一过程可被与阿尔茨海默病相关的分子伴侣蛋白ubiquilin-1所抑制4与这些发现一致，AICD 暴露出疏水区域，且本质上呈无序结构 体外5,6，但当与 Fe65 结合时可获得稳定的二级结构7我们提出，泛素连接酶-1可防止AICD发生不适当的分子间和分子内相互作用，从而抑制其聚集 体外 以及在完整细胞中4尽管大多数研究集中于APP在阿尔茨海默病（AD）发病机制中的作用，AICD在此过程中的功能尚不明确。已有研究表明，AICD的表达可诱导细胞凋亡8，以调控信号通路9以及调节钙信号传导10. 在转基因小鼠模型中过表达AICD和Fe65可诱导类似阿尔茨海默病的病理变化11，最近在使用适当的抗原修复技术后，可通过蛋白质印迹法在脑组织裂解液中检测到AICD12为促进对 AICD 的结构、生物化学和生物物理研究，我们开发了一种可重组表达大量高纯度 AICD 蛋白的方法。我们进一步描述了一种诱导其形成的方案。 体外 AICD的热聚集及其原子力显微镜分析。所述方法适用于AICD的生物化学、生物物理和结构表征，以及分子伴侣对AICD聚集影响的研究。
方案
1. 重组APP胞内域（AICD）的表达
- 将人源 AICD（APP 的第 649-695 位氨基酸，神经元亚型编号）克隆至载体 pGEX-4T-1（GE Healthcare）中，并转化入 E. coli BL21 菌株。该载体可表达 GST 融合蛋白的 C 端部分 AICD，即谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白。该载体还编码凝血酶切割位点，以利于去除 GST 部分。AICD 克隆至 pGEX-4T-1 的详细步骤见我们先前的发表文献4。
- 挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的 10 ml LB 液体培养基中，于 37 °C 强烈振荡培养过夜。
- 次日早晨，取 5 ml 过夜培养物接种于 1 L 锥形瓶中的 400 ml LB/氨苄青霉素培养基中。
- 于 37 °C 强烈振荡培养，直至 600 nm 处光密度值达到 0.4 至 0.6。通常需要 2 至 2.5 小时。
此时，可取出少量样品（约 10 μl）用于通过 SDS-PAGE 监测纯化过程（见图 1A,B）。后续每一步纯化过程也应取出少量等分试样，用于 SDS-PAGE 分析。
- 通过加入 0.4 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 GST-AICD 的表达。在 37 °C 下剧烈振荡培养 5 小时。
- 在 4 °C 下以 6,000 × g 离心 15 分钟收集细胞。此时细胞沉淀可在 -80 °C 下保存数月。
2. GST-AICD 的纯化
- 按下述方法配制 50 ml 裂解缓冲液：1 mM 二硫苏糖醇、1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1% Triton-X100、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、Complete 蛋白酶抑制剂混合液（Roche Applied Science）以及磷酸盐缓冲液。置于冰上冷却。
- 将细菌沉淀物（如先前已冷冻）置于冰上解冻。
此时，所有操作步骤必须在 4 °C 下进行，以最大限度减少蛋白水解。所有离心管、缓冲液及其他试剂均应预先冷却。若使用高压破碎仪或乳化器进行细胞裂解，这些设备也应预先冷却。
- 在冰上用涡旋振荡和10 ml移液器吹打，将细菌沉淀在20 ml裂解缓冲液中充分重悬，以确保沉淀完全分散。
- 将重悬的细菌细胞通过匀浆器处理（例如，Avestin EmulsiFlex-C3）或预冷的法国压滤器 4 °C 在30,000 psi下进行处理。将裂解液再次通过均质器处理一次。收集裂解液至预冷的50 ml离心管中。
这两种仪器的主要优势在于能够最大限度地减少样品加热。常用的超声处理技术会在超声探针尖端产生大量热量，可能导致重组蛋白发生聚集。
- 将裂解液在 15,000 x g 离心 30 分钟。分离上清液，并转移至预冷的 50 ml 离心管中保存。
- 加入 500 μl 50% 谷胱甘肽琼脂糖悬液（Sigma-Aldrich）。在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟。在样品旋转孵育期间，配制新鲜的洗脱缓冲液：50 mM Tris（pH 7.8）、0.1% Triton-X100、0.5 mM 二硫苏糖醇、10 mM 还原型谷胱甘肽。
该实验方案中唯一在室温下进行的步骤是洗脱步骤。因此，洗脱缓冲液应保持在室温。洗脱缓冲液需新鲜配制。
- 将裂解液和浆液倒入一次性5英寸聚苯乙烯层析柱中，该柱带有粗孔（90-130 μm）过滤器（Evergreen Scientific）。用 3 ml 磷酸盐缓冲液将柱子洗涤 5 次。
- 盖住柱子底部并加入 500 μl 加入室温洗脱缓冲液。盖上柱子顶部，室温下旋转5分钟。将洗脱液收集至预冷的1.5 ml微量离心管中。重复洗脱两次（共1.5 ml洗脱液）。
- 将洗脱液在10,000分子量截留的透析膜中透析（例如，Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 透析盒）中，在 4 升磷酸盐缓冲液中于 4°C 过夜透析 4 °C. 用额外的4升磷酸盐缓冲液透析 4 °C 第二天继续孵育1小时。
- 从透析盒中取出蛋白质，进行蛋白质定量检测，以确定GST-AICD的得率。通常从400 ml培养液中纯化可获得的产量为 >20 mg 纯化蛋白，浓度为 10–20 mg/ml。将蛋白分装成等份 200 μl 分装并置于 -80 °C.
3. GST-AICD 的凝血酶切割及 AICD 的纯化
- 解冻200 μl纯化的GST-AICD，并加入20 μl浓度为1 U/μl的凝血酶。在37 °C下孵育过夜。
凝血酶的质量和纯度在不同生产商之间差异显著，可能成为重要的污染源。我们使用 GE Healthcare 公司的凝血酶（见试剂表）。经 overnight 培育后 >融合蛋白应有95%被切割图1B).
- 经凝血酶过夜裂解后，部分释放出的 AICD 可能发生聚集，溶液可能呈现浑浊状态。在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟，去除聚集物。将上清液转移至预冷的微量离心管中。
- 加入 50 μl 的 50% 谷胱甘肽-琼脂糖悬浮液和 50 μl 的 50% 对氨基苯甲脒-琼脂糖悬浮液，分别用于去除 GST 和凝血酶。室温下旋转孵育 5 分钟。
- 短暂离心使琼脂糖珠沉淀，将上清液转移至新的离心管中。再用谷胱甘肽-琼脂糖对 GST 进行四次提取。单次使用对氨基苯甲脒-琼脂糖提取足以去除 20 U 的凝血酶。
- 取 5 μl 纯化的 AICD 进行蛋白质定量分析。通常从 400 ml 培养液中可获得 50–100 μg 的蛋白，浓度为 0.2 至 0.5 mg/ml。通过裂解更大体积的 GST-AICD 可获得更高的产量。
应新鲜制备纯化的AICD用于生化/生物物理表征。未使用的材料应予以丢弃。也可通过冻干样品并重悬于较小体积的缓冲液中来浓缩AICD6。如果检测AICD需要进行膜印迹（如滤膜捕获或点印迹实验后），应按照Pimplikar和Suryanarayana所述方法对膜进行抗原修复12。
4. 用于原子力显微镜（AFM）的AICD聚集
- 将新配制的 AICD 用磷酸盐缓冲液稀释至终体积为 15 μl、浓度为 0.1 mg/ml。此时可加入不同化合物和/或蛋白质，以检测其是否抑制 AICD 聚集。例如，我们已证明在此检测中，等摩尔浓度的泛素结合蛋白-1 可阻止 AICD 的聚集4。
对于生化实验（如滤膜捕获实验和光散射实验），也可以合并较大的反应体积4。我们已成功对体积高达 400 μl 的反应混合物进行滤膜捕获实验，其中 AICD 被稀释至低至 1 μM 的浓度。
- 在 Eppendorf Thermomixer 中，于 43 °C 下以 800 rpm 振荡孵育样品 48 小时，以诱导热聚集。该温度的选择依据是基于检测模型伴侣蛋白底物柠檬酸合酶热聚集的伴侣蛋白实验4,13。
热聚集是一种常用的方法，用于诱导蛋白质从天然结构向非天然结构（通常富含β片层）转变，从而导致分子间聚集体的形成。热聚集也用于研究分子伴侣的功能，这些分子伴侣可保护疏水片段，防止其形成不适当的分子间相互作用（从而延缓或阻止热聚集的发生）。
- 用去离子水将样品稀释20倍，取2 μl滴加到新解理的云母片上。在干燥器中过夜干燥样品。有必要通过实验确定成像的最佳稀释倍数，因此建议尝试10至100倍范围内的多个稀释梯度。
- 采用轻敲模式原子力显微镜观察聚集态AICD14。所用悬臂为金镀层微尖氮化硅悬臂（MSNL，Bruker），标称针尖半径为2 nm。成像时典型的轻敲振幅为10–20 nm，频率处于悬臂的共振频率范围（30–50 kHz）。
我们发现，不同蛋白质聚集体的图像质量和对比度取决于施加的作用力和实验持续时间。为了尽量减少探针对样品的扰动，我们通过保持高于95%的设定点比例并将每个样品的扫描时间限制在5-10分钟内，使施加的作用力保持相对较低。图像处理使用WSxM软件（Nanotec）完成。标准图像处理包括平面扣除和平整化。我们的实验室使用自行搭建的原子力显微镜15，并与商用扫描探针显微镜控制系统（Nanotec）相连接。
5. 典型结果
GST-AICD 的表达及相对富集情况如图所示 图1A裂解后，大部分融合蛋白存在于可溶性组分中，因此无需从包涵体中提取。从谷胱甘肽琼脂糖柱洗脱的材料是 >95% 纯度。在所示的制备过程中 图1，从层析柱中洗脱出的蛋白浓度为14.5 mg/ml，得率为22 mg（起始培养液体积为400 ml）。切割 200 μl 该制备物与20 U凝血酶在过夜反应中几乎实现了融合蛋白100%的切割（图1B）。所用凝血酶的量极少，无法通过考马斯亮蓝染色检测到（见“已切割”泳道， 图1B）。尽管去除凝血酶和GST导致部分材料损失，但这一过程仍然 >纯度90%，本制备的产率为 70 μg 浓度为 0.35 mg/ml 的 AICD。 图1C 显示了AICD聚集及后续分析的流程图。原子力显微镜（AFM）观察到的AICD聚集体通常呈球形/无定形，大小范围为50至100 nm图 1D,F）。当在聚集反应中加入等摩尔量的分子伴侣ubiquilin-1时，无法检测到聚集物质。图1E)4.
图 1. AICD 的纯化与聚集。 A) 纯化过程中各步骤所收集样品的考马斯亮蓝染色结果。对于未诱导和诱导样品，每泳道上样 20 μl 总菌液。对于上清组分，取裂解液（总体积 20 ml）5 μl 上样。对于沉淀组分，将沉淀重悬于 20 ml 裂解缓冲液中，取 5 μl 该样品在 4 °C 水浴超声仪中处理 30 分钟后上样。对于穿流组分，取 5 μl 上样。洗脱组分的上样量已在图中标明。B) 未切割和切割后的 GST-AICD（2 μl）以及 1 μl 和 5 μl 纯化的 AICD 的考马斯亮蓝染色凝胶图。C) AICD 纯化、聚集及分析流程图。D, E) 热诱导聚集的 AICD 在无（D）和有（E）分子伴侣 ubiquilin-1 存在下的代表性原子力显微镜（AFM）图像。F) AICD 聚集体大小分布的直方图。
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讨论
在本方案中，我们概述了一种获取高纯度AICD用于结构、生物物理及生化分析的步骤。该方法无需复杂的层析设备，因此大多数实验室均可实施。其他研究团队也已纯化过AICD5-7,16，包括 GST-AICD17-19，用于生化/结构分析。先前方案的缺点包括AICD溶解性差16纯度不理想17以及对尺寸排阻的要求16 或反相色谱6,20因此，本文所述方案将极大促进 体外 AICD 的研究。我们还描述了一种通过热聚集 AICD 并利用原子力显微镜（AFM）进行检测的方法。尽管原子力显微镜在淀粉样蛋白研究领域中的应用日益广泛21，原子力显微镜（AFM）是一种高度专业化的技术。其他更易操作的检测方法，如光散射、沉降和滤膜滞留实验，也可用于研究AICD的热聚集行为。4最后，直接检测的能力 体外 纯化分子伴侣（如ubiquilin-1）的能力4，防止AICD的热聚集为阐明其他胞质伴侣蛋白在调控APP生物学功能中的作用提供了可能。
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致谢
作者谨此感谢贝勒医学院的 Hui Zheng 博士提供 APP cDNA。本研究由以下基金资助：NIH 基金 R21AG031948（D.B.，J.M.B.）、F30AG030878（E.S.S.）、R01DK073394（AFO）、John Sealy 医学研究纪念基金（AFO）以及 Jean C. 和 William D. Willis 神经科学研究基金（E.S.S.）。J.M.B. 是转化研究学者项目学者，同时也是德克萨斯大学医学分部 Claude E. Pepper 老年美国人独立中心成员（分别由 NIH 基金 UL1RR029876 和 P30-AG-024832 支持）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| 凝血酶 | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford 蛋白检测试剂 | Bio-Rad | 500-0002 | |
| 考马斯亮蓝 | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖 | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| 对氨基苯甲脒琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer 透析盒 | Thermo Scientific | 66380 | |
| 层析柱 | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| 均质器 | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | 强烈推荐 |
| Eppendorf 恒温混匀仪 | Eppendorf | 022670107 | |
| 云母片 | Ted Pella | 50-12 | |
| 原子力显微镜悬臂 | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM 软件 | Nanotec | N/A | 免费下载 |
参考文献
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