淀粉样前体蛋白胞内段的纯化与聚集

摘要

一种大规模纯化APP胞内域（AICD）的方法。我们还描述了诱导该蛋白表达的方法 体外 通过原子力显微镜观察AICD的聚集与可视化。所述方法适用于AICD的生物化学/结构表征，以及分子伴侣对其聚集影响的研究。

摘要

淀粉样前体蛋白（APP）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，与阿尔茨海默病（AD）的发病机制相关。APP具有一个大的细胞外结构域和一个较短的细胞质结构域，后者称为APP胞内结构域（AICD）。在通过分泌途径成熟的过程中，APP可被蛋白酶切割，这些蛋白酶被称为α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶。¹. APP 经 β 和 γ-分泌酶的顺序蛋白水解切割后，产生一种称为 Aβ 的小分子蛋白水解肽，该肽具有淀粉样蛋白原性，是老年斑的核心成分。AICD 在分泌酶切割后亦从膜上释放，并通过与 Fe65 和 Tip60 相互作用，可转位至细胞核内，参与多种靶基因的转录调控^2,3. 涉及AICD的蛋白质-蛋白质相互作用可能影响全长APP及其C端片段的转运、加工和细胞功能。我们最近发现AICD可发生聚集 体外，并且这一过程可被与阿尔茨海默病相关的分子伴侣蛋白ubiquilin-1所抑制⁴与这些发现一致，AICD 暴露出疏水区域，且本质上呈无序结构 体外^5,6，但当与 Fe65 结合时可获得稳定的二级结构⁷我们提出，泛素连接酶-1可防止AICD发生不适当的分子间和分子内相互作用，从而抑制其聚集 体外 以及在完整细胞中⁴尽管大多数研究集中于APP在阿尔茨海默病（AD）发病机制中的作用，AICD在此过程中的功能尚不明确。已有研究表明，AICD的表达可诱导细胞凋亡⁸，以调控信号通路⁹以及调节钙信号传导¹⁰. 在转基因小鼠模型中过表达AICD和Fe65可诱导类似阿尔茨海默病的病理变化¹¹，最近在使用适当的抗原修复技术后，可通过蛋白质印迹法在脑组织裂解液中检测到AICD¹²为促进对 AICD 的结构、生物化学和生物物理研究，我们开发了一种可重组表达大量高纯度 AICD 蛋白的方法。我们进一步描述了一种诱导其形成的方案。 体外 AICD的热聚集及其原子力显微镜分析。所述方法适用于AICD的生物化学、生物物理和结构表征，以及分子伴侣对AICD聚集影响的研究。

方案

1. 重组APP胞内域（AICD）的表达

1. 转化 E. coli 将人源AICD（APP的第649-695位残基，神经元亚型编号）克隆至载体pGEX-4T-1（GE Healthcare）中，转化大肠杆菌BL21菌株。该载体可表达GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合蛋白，其中AICD位于融合蛋白的C末端。该载体还编码凝血酶切割位点，便于去除GST部分。将AICD克隆至pGEX-4T-1载体的具体方法详见我们此前发表的文章⁴.
2. 从单个菌落接种含有氨苄青霉素（100 μg/ml）的10 ml LB液体培养基，于37 °C剧烈振荡培养过夜。
3. 次日早晨，取5 ml过夜培养物接种于1 L锥形瓶中的400 ml LB/氨苄青霉素培养基中。
4. 在37 °C下剧烈振荡培养，直至600 nm处的光密度达到0.4至0.6。通常需要2至2.5小时。

此时可取出少量样品（约 10 μl）用于通过 SDS-PAGE 监测纯化过程（见图 1A,B）。后续每一步纯化步骤也应取出少量等分试样，用于 SDS-PAGE 分析。

5. 通过加入 0.4 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 GST-AICD 的表达。在 37 °C 下剧烈振荡培养 5 小时。
6. 在 4 °C 下以 6,000 × g 离心 15 分钟收集细胞。此时细胞沉淀可在 -80 °C 下保存数月。

2. GST-AICD 的纯化

1. 配制50 ml裂解缓冲液，配方如下：1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1% Triton-X100、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、完全蛋白酶抑制剂混合物（Roche Applied Science）以及磷酸盐缓冲液（PBS）。置于冰上预冷。
2. 将细菌沉淀（如先前冷冻保存）置于冰上解冻。

此时，所有操作步骤必须在 4 °C 下进行，以最大限度减少蛋白水解。所有离心管、缓冲液及其他试剂均应预先冷却。若使用高压破碎仪或乳化器进行细胞裂解，这些设备也应预先冷却。

3. 将细菌沉淀物在20 ml裂解缓冲液中充分重悬。在冰上使用10 ml移液器反复吹打并结合涡旋振荡，可确保沉淀完全重悬。
4. 将重悬的细菌细胞通过均质器处理（例如，Avestin EmulsiFlex-C3）或法国压滤器，在4 °C预冷，压力为30,000 psi。将裂解液再次通过均质器处理一次。收集裂解液至预冷的50 ml离心管中。

这两种仪器的主要优势在于能够最大限度地减少样品的加热。常用的超声处理技术会在超声探针的尖端产生大量热量，可能导致重组蛋白发生聚集。

5. 将裂解液在 15,000 x g 离心 30 分钟。分离上清液并转移至预冷的 50 ml 离心管中。
6. 加入 500 μl 的 50% 谷胱甘肽琼脂糖悬液（Sigma-Aldrich）。在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟。在样品旋转孵育期间，配制新鲜的洗脱缓冲液：50 mM Tris 7.8、0.1% Triton-X100、0.5 mM 二硫苏糖醇、10 mM 还原型谷胱甘肽。

该实验方案中唯一在室温下进行的步骤是洗脱步骤。因此，洗脱缓冲液应置于室温保存。洗脱缓冲液需新鲜配制。

7. 将裂解液和浆液倒入一次性5英寸聚苯乙烯层析柱中，柱底带有粗孔（90-130 μm）滤膜（Evergreen Scientific）。用3 ml磷酸盐缓冲液洗涤层析柱5次。
8. 封闭层析柱底部，加入500 μl室温洗脱缓冲液。封闭柱顶，在室温下旋转孵育5分钟。将洗脱液收集至预冷的1.5 ml微量离心管中。重复洗脱两次（共收集1.5 ml洗脱液）。
9. 将洗脱液置于10,000分子量截留的透析膜中（例如，Thermo Scientific Slide-A-Lyzer透析盒），在4 °C条件下用4升磷酸盐缓冲液透析过夜。次日再于4 °C用另外4升磷酸盐缓冲液透析1小时。
10. 从透析盒中取出蛋白，进行蛋白定量分析，以确定GST-AICD的得率。通常从400 ml培养物中纯化可获得>20 mg纯化蛋白，浓度为10-20 mg/ml。将蛋白分装为每份200 μl，于-80 °C保存。

3. GST-AICD 的凝血酶切割及 AICD 的纯化

1. 解冻200 μl纯化的GST-AICD，加入20 μl浓度为1 U/μl的凝血酶。37 °C下孵育过夜。

凝血酶的质量和纯度在不同生产商之间差异较大，可能成为显著的污染源。我们使用GE Healthcare生产的凝血酶（见试剂表）。经 overnight 培养后， >融合蛋白应有95%被切割图1B).

2. 经凝血酶过夜裂解后，部分释放出的AICD可能发生聚集，溶液可能呈现浑浊状态。在4 °C条件下，以20,000 × g离心30分钟，去除聚集物。将上清液转移至预冷的微量离心管中。
3. 加入50 μl 50%谷胱甘肽-琼脂糖悬液以去除GST，再加入50 μl 50%对氨基苯甲脒-琼脂糖悬液以去除凝血酶。室温下旋转孵育5分钟。
4. 短暂离心使琼脂糖珠沉降，将上清液转移至新管中。使用谷胱甘肽-琼脂糖对GST再萃取四次。单次使用对氨基苯甲脒-琼脂糖即可完全去除20 U的凝血酶。
5. 取5 μl纯化的AICD进行蛋白质定量分析。通常从400 ml培养液中可获得50–100 μg蛋白，浓度为0.2至0.5 mg/ml。通过裂解更大体积的GST-AICD可获得更高的产量。

应 freshly 制备纯化的 AICD 用于生化/生物物理表征。未使用的材料应丢弃。也可通过冻干样品并重悬于较小体积的缓冲液中来浓缩 AICD⁶。如果检测 AICD 需要印迹（如滤膜捕获或点印迹实验后），应在膜上按照 Pimplikar 和 Suryanarayana¹² 描述的方法进行抗原修复。

4. 用于原子力显微镜（AFM）的AICD聚集

1. 将新配制的 AICD 用磷酸盐缓冲液稀释至终体积为 15 μl、浓度为 0.1 mg/ml。此时可加入不同化合物和/或蛋白质，以检测其是否抑制 AICD 聚集。例如，我们已证明在此实验中，等摩尔浓度的泛素连接蛋白-1 可阻止 AICD 的聚集⁴。

对于生化实验，例如滤膜捕获实验和光散射实验，也可以合并较大的反应体积⁴。我们已成功对体积高达 400 μl 的反应混合物进行滤膜捕获实验，其中 AICD 稀释至低至 1 μM 的浓度。

2. 在 Eppendorf Thermomixer 中，于 43 °C 下以 800 rpm 振荡孵育样品 48 小时，以诱导热聚集。该温度的选择基于分子伴侣检测实验，此类实验通常检测模型伴侣底物柠檬酸合酶的热聚集行为^4,13。

热聚集是一种常用的方法，用于诱导蛋白质从天然结构向非天然结构（通常富含β折叠）发生构象转变，从而导致分子间聚集体的形成。热聚集也用于研究分子伴侣的功能，分子伴侣能够保护疏水区域，防止其形成不适当的分子间相互作用（从而延缓或抑制热聚集的发生）。

3. 将样品用去离子水稀释20倍，取2 μl滴加到新解理的云母片上。在干燥器中过夜干燥。有必要通过实验确定成像的最佳稀释倍数，因此建议尝试10至100倍范围内的多个稀释梯度。
4. 采用轻敲模式原子力显微镜观察聚集的AICD¹⁴。所用悬臂为金镀层微尖氮化硅悬臂（MSNL，Bruker），标称针尖半径为2 nm。成像时典型的轻敲振幅为10–20 nm，频率处于悬臂的共振频率范围（30–50 kHz）。

我们发现，不同蛋白质聚集体的图像质量和对比度取决于施加的作用力和实验持续时间。为了尽量减少探针对样品的扰动，我们通过保持高于95%的设定值比率并将每个样品的扫描时间限制在5-10分钟内，使施加的作用力保持相对较低。图像处理使用WSxM软件（Nanotec）完成。标准图像处理包括平面扣除和平整化。我们的实验室使用自行搭建的原子力显微镜¹⁵，并与商用扫描探针显微镜控制系统（Nanotec）相连接。

5. 代表性结果

GST-AICD 的表达与相对富集情况如图 1A所示。裂解后，大部分融合蛋白存在于可溶性组分中，因此无需从包涵体中提取。从谷胱甘肽琼脂糖柱洗脱的材料纯度>95%。在图 1所示的实验中，从层析柱洗脱的蛋白浓度为 14.5 mg/ml，产量为 22 mg（起始培养体积为 400 ml）。用 20 U 凝血酶对 200 μl 该蛋白溶液过夜消化，可实现融合蛋白近 100% 的切割（图 1B）。所用凝血酶的量极低，考马斯亮蓝染色无法检测（见“Cleaved”泳道，图 1B）。去除凝血酶和 GST 后，材料有所损失，但最终产物纯度仍>90%，本批次制备获得 70 μg AICD，浓度为 0.35 mg/ml。 图 1C展示了 AICD 聚集及后续分析的流程图。原子力显微镜（AFM）成像显示 AICD 聚集体通常呈球形/无定形，尺寸范围为 50 至 100 nm（图 1D,F）。当在聚集反应中加入等摩尔量的分子伴侣 ubiquilin-1 时，无法检测到聚集物（图 1E）⁴。

图1. AICD的纯化与聚集。 A) 纯化过程中每一步所收集样品的考马斯亮蓝染色结果。对于未诱导和诱导样品，各取20 μl总菌液上样至凝胶。对于上清组分，取裂解液5 μl（来自20 ml总体积）上样。对于沉淀组分，将沉淀重悬于20 ml裂解缓冲液中，取5 μl该样品在4 °C水浴超声仪中进行超声处理30分钟，随后上样。对于穿流组分，取5 μl上样。洗脱液的上样量已在图中标明。B) 未切割和切割后的GST-AICD（2 μl）以及1 μl和5 μl纯化的AICD的考马斯亮蓝染色凝胶图。C) AICD纯化、聚集及分析流程图。D, E) 热诱导聚集的AICD在无（D）和有（E）分子伴侣蛋白ubiquilin-1存在下的代表性原子力显微镜（AFM）图像。F) AICD聚集体尺寸分布的直方图。

讨论

在本方案中，我们概述了一种获取高纯度AICD用于结构、生物物理及生化分析的步骤。该方法无需复杂的层析设备，因此大多数实验室均可实施。其他研究团队也已纯化过AICD^5-7,16，包括 GST-AICD^17-19，用于生化/结构分析。先前方案的缺点包括AICD溶解性差¹⁶纯度不理想¹⁷以及对尺寸排阻的要求¹⁶ 或反相色谱^6,20因此，本文所述方案将极大促进 体外 AICD 的研究。我们还描述了一种通过热聚集 AICD 并利用原子力显微镜（AFM）进行检测的方法。尽管原子力显微镜在淀粉样蛋白研究领域中的应用日益广泛²¹，原子力显微镜（AFM）是一种高度专业化的技术。其他更易操作的检测方法，如光散射、沉降和滤膜滞留实验，也可用于研究AICD的热聚集行为。⁴最后，直接检测的能力 体外 纯化分子伴侣（如ubiquilin-1）的能力⁴，防止AICD的热聚集为阐明其他胞质伴侣蛋白在调控APP生物学功能中的作用提供了可能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
凝血酶	GE Healthcare	27-0846-01
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760
Bradford 蛋白检测试剂	Bio-Rad	500-0002
考马斯亮蓝	Bio-Rad	161-0786
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）	Sigma-Aldrich	I6758
谷胱甘肽琼脂糖	Sigma-Aldrich	G4510
对氨基苯甲脒琼脂糖	Sigma-Aldrich	A7155
完全蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer 透析盒	Thermo Scientific	66380
层析柱	Evergreen Scientific	208-3367-050
均质器	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	强烈推荐
Eppendorf 恒温混匀仪	Eppendorf	022670107
云母片	Ted Pella	50-12
原子力显微镜悬臂	Bruker	MSNL-10
WSxM 软件	Nanotec	N/A	免费下载