通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。
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本文内容
摘要
摘要
在组织切片中，心肌细胞核的鉴定一直具有挑战性，因为大多数策略仅依赖于细胞质标记蛋白1。在心肌细胞中发生的稀有事件，如增殖和凋亡，需要准确识别心肌细胞核，以分析稳态及病理条件下细胞的更新情况2。本文提供了一种通过密度沉降法结合针对中心粒周围物质1（pericentriolar material 1, PCM-1）抗体进行免疫标记，从而从死后组织中分离心肌细胞核的方法，并随后通过流式细胞术进行分选。该策略具有高通量分析和分离的优势，且对新鲜组织和冷冻保存的存档材料均适用。这使得研究生物样本库中已收集的样本成为可能。该技术已在多种物种中得到验证和应用，适用于多种下游实验，如碳-14测年3、细胞周期分析4、胸腺嘧啶类似物（如BrdU和IdU）的可视化4、转录组学及表观遗传学分析。
方案
1. 心脏细胞核的分离
- 用10 ml的1% BSA/PBS包被液包被超速离心管（Beckman Centrifuge Tubes #363664）。盖上管盖，在管式旋转仪中旋转30分钟。弃去包被液，让离心管自然晾干（分析单个鼠心需使用一根离心管；也可选择在一根离心管中处理最多5只鼠心或来自其他物种（如人）的1 g心脏组织）。
- 所有后续步骤均需在冰上操作。使用解剖刀从新鲜或速冻的小鼠心脏中分离左心室。注意：本方案针对小鼠心脏优化，但也可适用于大鼠或人的心脏组织。或者，可使用最多1 g来自其他物种的心脏组织。
- 用解剖刀将组织切成小块。
- 将组织块转移至装有15 ml裂解缓冲液的50 ml Falcon管中。
- 使用T-25 Ultra-Turrax探头式匀浆器（IKA）以24,000 rpm匀浆10秒，对心脏组织进行均质化处理。
- 加入等体积的裂解缓冲液将匀浆液稀释至30 ml。
- 使用玻璃Dounce匀浆器（40 ml）进一步匀浆组织以释放细胞核。使用大间隙杵头进行8次上下研磨。
- 依次将粗提的细胞核悬液通过100 μm和70 μm的尼龙网细胞滤筛（BD Biosciences）过滤。
- 在4 °C下，以700 × g离心10分钟，沉淀粗提的细胞核。
- 小心地将离心管倒置以去除上清液，并用纸巾擦拭管内壁。注意不要扰动细胞核沉淀。
- 用移液器反复吹打，将粗提的细胞核沉淀溶解于5 ml蔗糖缓冲液中。再向溶解后的沉淀中加入25 ml蔗糖缓冲液。
- 向已包被的超速离心管（见步骤1.1）中加入10 ml新配制的蔗糖缓冲液。
- 小心地将步骤1.9中溶解于蔗糖缓冲液的重悬细胞核沉淀液叠加在已加入的10 ml蔗糖缓冲液之上。
- 将离心管配平后放入JS13.1摆动转子中，并将转子装入高速离心机（Beckman Avanti S-25）。
- 在4 °C下以13,000 × g离心60分钟。
- 离心结束后，小心从转子中取出离心管，倒置离心管弃去上清液，并用纸巾擦去管内残留的杂质。
- 将细胞核沉淀溶解于1 ml核储存缓冲液（NSB plus缓冲液）中。注意：NSB plus含有1.5 mM亚精胺作为DNA稳定剂。
- 继续进行步骤2.1，即心肌细胞核的免疫染色。
2. 流式细胞术免疫染色
- 准备免疫染色的阴性对照。从细胞核样品中取出20 μl分装样品，加入980 μl NSB plus缓冲液。
- 向细胞核样品中加入抗中心粒周围物质1抗体（兔抗PCM-1，Atlas Antibodies），稀释比例为1:500，用于免疫标记心肌细胞核。将同型对照抗体以与抗PCM-1抗体相同的稀释比例加入第2.1步制备的阴性对照中。
- 将阴性对照和样品管在4 °C下孵育过夜。
- 用NSB plus缓冲液至少洗涤阴性对照和样品一次（在4 °C预冷的离心机中以700 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml NSB plus缓冲液中）。
- 向阴性对照和样品管中加入抗兔荧光二抗（FITC或APC），稀释比例为1:1000。
- 将阴性对照和样品管在4 °C下孵育1小时。
- 用NSB plus缓冲液至少洗涤阴性对照和样品一次（在4 °C预冷的离心机中以700 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml NSB plus缓冲液中）。
- 进行流式细胞术分析和分选。
3. 流式细胞术
- 在开始流式细胞分选前，按照步骤1.1所述，用1% BSA/PBS溶液对核收集管（Falcon 15 ml）进行包被处理。
- 将样品和阴性对照通过30 μm细胞筛过滤，然后先将阴性对照上样至流式细胞仪（BD Influx）。根据前向散射光（FSC）、前向散射光脉冲宽度（FS pulse width）和侧向散射光（SSC）设定第一和第二门，以确定细胞核及单核（单个细胞核）群体（图2a和b）。在样品中加入DNA染料（DRAQ5（1:500））有助于初步识别细胞核群体。
- 上样经免疫标记的样品，并设定第三门，以分离心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）。启动分选（图2c和d）。
可选： 为分析核DNA含量（倍性）并进行细胞周期分析，可向细胞核中加入适当的DNA染料（例如Hoechst 33342或DRAQ5）（图2e）。
- 流式细胞术分选后，将细胞核置于冰上，并重新分析以确定分选纯度（图 3a 和 3b）。
- 在4°C离心机中以1500 × g离心15分钟，收集分选后的细胞核。
- 用适合下游应用的缓冲液溶解细胞核沉淀。
4. 代表性结果
细胞核形态和完整性可通过DNA染色并在显微镜下观察来评估（图1）。PCM-1标记的成功与否可通过落射荧光显微镜和流式细胞术进行评估（图1、图2c和图2d）。PCM-1阳性与阴性细胞群应彼此明显分离（图2c和图2d）。在小鼠左心室中，所有细胞核中约有30%应为心肌细胞核（图2d）。分选纯度可通过重新分析已分选的细胞核来评估（图3a和图3b）。两个细胞核群体的分选纯度均应超过95%。
图1. PCM-1 鉴定心肌细胞核。 在成年小鼠心脏中，心脏细胞核（a）经 PCM-1 抗体（b）和 Nkx2.5 抗体（c）染色。（d）被 PCM-1 标记的细胞核周围环绕着心肌细胞胞质（肌球蛋白重链（MHC）），并表达转录因子 Nkx2.5，表明 PCM-1 染色可准确识别心肌细胞核（比例尺：20 μm 和 10 μm（d，插图））。（e）使用 DNA 染料 DRAQ5 观察分离的心脏细胞核。（f 和 g）使用抗 PCM-1 抗体标记心肌细胞核（比例尺：10 μm）。注意，在组织切片和分离的细胞核中，心肌细胞核呈现 PCM-1 的核周染色模式（箭头所示）。
图 2. 心肌细胞核的流式细胞分选。 (a) 通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）鉴定心脏细胞核。(b) 第二个门控根据FSC和FS脉冲宽度5识别单个细胞核。(c, d) 荧光门控可将心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）从心脏组织中分离。(e) 小鼠心肌细胞主要为二倍体（2n，>80%），仅一小部分为四倍体（4n）6。需注意，人类心肌细胞含有更高比例的多倍体细胞核（>2n）7,8。
图 3. 分选后心肌细胞与非心肌细胞核的纯度分析。 对分选后的非心肌细胞核（a）和心肌细胞核（b）进行再分析。两个细胞群的分选纯度均超过 99%。
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讨论
准确鉴定心肌细胞核对于心肌组织再生过程的分析至关重要2,3。从新鲜组织中分离心肌细胞的传统技术主要基于对细胞外基质蛋白的酶消化，随后通过低速离心从间质细胞中进行纯化。进一步纯化来自胚胎干细胞（ESC）的活心肌细胞可通过表面标志物（如SIRPA9）免疫标记或线粒体染料10实现；而固定后的心肌细胞则可通过胞质标志物（如肌球蛋白重链（MHC））或核蛋白（如GATA4或Nkx2.5）进行鉴定。然而，Nkx2.5和GATA4的表达不仅限于成熟心肌细胞，在发育过程中及心肌梗死后的心脏祖细胞中亦可检测到11,12。用于鉴定心肌细胞的遗传学策略具有最高的特异性，但无法应用于大型动物模型或人类1。现有策略的局限性导致了关于稀有事件（如增殖、凋亡和嵌合现象）定量分析的争议性结论1,13。因此，亟需建立一种准确的方法以鉴定并纯化成熟分化的心肌细胞核。
本文描述了一种基于中心粒周围物质1（PCM-1）的纯化技术。此前，我们通过显示三个独立的核标记物——PCM-1、心肌肌钙蛋白...
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致谢
我们感谢Marcelo Toro在流式细胞术方面提供的协助。本研究由瑞典心脏与肺基金会、欧盟委员会第七框架计划“CardioCell”、瑞典研究理事会、AFA保险公司和ALF项目资助。O.B. 得到德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. 裂解缓冲液 | |||
| 试剂名称 | |||
| 0.32 M 蔗糖 | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM 醋酸镁 | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. 蔗糖缓冲液 | |||
| 试剂名称 | |||
| 2.1 M 蔗糖 | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM 醋酸镁 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. 细胞核储存缓冲液（NSB plus） | |||
| 试剂名称 | |||
| 0.44 M 蔗糖 | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM 精胺 | |||
| 同型兔 IgG- ChIP 级，#ab37415 | Abcam | ||
| 兔抗 PCM-1 抗体，#HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| 驴二抗，抗兔 Alexa 488 荧光抗体，#A-21206 或等效荧光二抗 | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| 细胞筛，30 μm、70 μm 和 100 μm | BD Biosciences | ||
| 玻璃匀浆器（40 ml）及“L”型研杵"" | VWR（Wheaton Industries Inc.） | ||
| T-25 Ultra-Turrax 匀浆机 | IKA 德国 | ||
| 分散工具 S25 N-18 G | IKA 德国 | ||
| Beckman Avanti 离心机 | Beckman Coulter | ||
| Falcon 管，15 ml 和 50 ml | VWR | ||
| Beckman 离心管 #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 摆动转子 | Beckman Coulter | ||
| Influx 流式细胞仪 | Beckman Coulter | ||
| 管式旋转仪 | VWR |
参考文献
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