一种用于定向进化耐热性溶菌酶的新筛选方法

摘要

开发了一种针对热稳定性工程领域的新型定向进化方法，并在溶菌酶上得到了验证。经过仅一轮的随机诱变，获得的进化型溶菌酶PlyC 29C3在高温孵育后，其残余活性超过野生型蛋白的两倍。

摘要

定向进化被定义为一种利用自然选择的方法，以改造蛋白质并使其获得自然界中该蛋白质所不具备的特定性质。文献中已提供了大量成功应用定向进化的实例，用以改变分子的特异性和催化性能。¹相较于基于理性设计的分子工程方法，利用定向进化的首要优势在于能够筛选出更大数量和更丰富的变异体²一种定向进化的可能应用是提高溶菌酶（如内溶素）的结构稳定性。噬菌体编码并表达内溶素，以水解肽聚糖中的一个关键共价键。即 细胞壁），导致宿主细胞裂解并释放子代病毒颗粒。值得注意的是，这些酶能够在无噬菌体存在的情况下外源性地诱导敏感细菌发生裂解，并且已在体内外被证实具有该功能。 体外 和 体内 因其治疗潜力^3-5本项定向进化研究的对象是PlyC溶菌酶，该酶由PlyCA和PlyCB两个亚基组成⁶当被纯化并外源添加时，PlyC 全酶可在数秒内裂解A族链球菌（GAS）以及其他链球菌群，且其有效性已得到验证 体内 抗 GAS⁷值得注意的是，在升温孵育后监测残余酶动力学可提供明确证据，表明PlyC在45 °C时溶菌活性突然丧失，提示其治疗用途的货架期较短，这可能限制该酶的进一步开发。进一步研究表明，热不稳定性仅出现在PlyCA亚基中，而PlyCB亚基在高达约90 °C时仍保持稳定（未发表观察结果）。除PlyC外，文献中还存在多个描述内溶素具有热不稳定性的实例。例如， Staphylococcus aureus 内溶素 LysK 和 肺炎链球菌 内溶素 Cpl-1 和 Pal 分别在 42 °C、43.5 °C 和 50.2 °C 时自发失去活性^8-10根据阿伦尼乌斯方程，化学反应速率与特定系统中的温度相关，热稳定性提高将与保质期预期延长呈正相关。¹¹为此，定向进化已被证明是改造自然界中多种分子热活性的有效工具，但该技术此前从未被成功应用于溶菌酶的研究。同样，有关提升此类抗菌酶结构稳定性的成功报道也尚付阙如。本视频中，我们采用一种新颖的方法，利用易错DNA聚合酶引入突变，随后结合基于96孔微孔板的优化筛选流程，以鉴定PlyC链球菌胞内溶素PlyCA亚基中的突变位点，这些突变与酶动力学稳定性的提高相关图1经过一轮随机突变后，结果表明该方法产生的 PlyC 变体在高温处理后保留的残余活性超过野生型（WT）PlyC 的两倍。

方案

1. 确定最佳加热条件

首先，必须通过实验确定在检测中加热步骤所使用的最佳孵育温度和时间。对于我们的PlyC模型，需要注意的是，分别携带表达质粒上的 plyCA 和 plyCB 基因的 E. coli 共转化菌株已被证明能够形成完全有功能的PlyC全酶⁶。96孔微孔板的制备、细胞培养条件以及后续的复制平板技术均借鉴了文献中提供的示例^12-16。根据此前热失活实验的结果，在超过生理温度的环境中短期孵育会导致酶活性迅速丧失（未发表观察结果），因此本实验采用30分钟的孵育时间是合适的。PlyC的最佳孵育温度通过以下步骤确定：

1. 将表达载体 pBAD24:plyCA (Amp^r) 转化至感受态 E. coli 菌株 DH5α pBAD33:plyCB (Cm^r) 中。
2. 将转化子涂布于添加氨苄青霉素（100 μg/ml）和氯霉素（35 μg/ml）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
3. 用无菌牙签将单个菌落分别接种至无菌、透明、平底、带盖的96孔微孔板的每一排孔中（图2a），每孔含200 μl添加氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基。
4. 将96孔微孔板牢固地置于37 °C摇床培养箱中，以300 rpm转速过夜培养细菌。
5. 从37 °C摇床培养箱中取出96孔微孔板，进行复制接种至新的96孔微孔板，操作如下：
   1. 在复制板的每孔中加入180 μl添加氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基。
   2. 将原始板中每孔的20 μl菌液转移至复制板对应孔中。此操作应使初始OD₆₀₀约为0.5。
6. 将复制板牢固地置于37 °C摇床培养箱中，以300 rpm转速孵育1小时，然后加入诱导剂。对于pBAD表达系统，诱导剂为0.25%阿拉伯糖。其他表达系统可能需要不同的诱导剂。将板重新放回37 °C摇床培养箱，以300 rpm继续震荡4小时以实现蛋白表达。PlyC的表达水平通常在10–20 μg之间。
7. 蛋白表达完成后，取出复制板，通过将96孔微孔板放入配备可适配96孔板的摆动桶转子的冷藏离心机中，离心收集细菌沉淀。在室温下以3,000 rpm离心10分钟。
8. 通过缓慢倒置微孔板并轻轻倾倒，移除上清培养基。
9. 每孔加入50 μl B-PER II 细菌蛋白提取试剂，裂解细胞。室温孵育20分钟。
10. 每孔加入70 μl pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS），使每孔总体积增至120 μl。
11. 在4 °C下，以3,000 rpm离心10分钟，沉淀不溶性细胞碎片。
12. 将110 μl可溶性粗裂解液转移至96孔PCR板的对应孔中。
13. 以30分钟作为预设孵育时间，将目前位于96孔PCR板中的可溶性裂解液暴露于15–20 °C的宽范围温度梯度中。注意：本步骤的目标是确定特定酶失去>95%催化活性的温度。
14. 孵育后，将96孔PCR板在4 °C下孵育5分钟，然后将100 μl可溶性裂解液转移至最终的96孔微孔板中对应位置。
15. 使用12通道多通道移液器，向每孔加入100 μl GAS菌株D471。注意：D471细胞最初由过夜培养物冻干后重悬于pH 7.2的PBS中，使其OD₆₀₀约为2.0。
16. 立即将96孔板放入微孔板分光光度计中，每15秒测量一次OD₆₀₀，持续20分钟，以监测酶动力学。孵育温度最低且对应孔中光密度无明显变化（ΔOD ≤ 0.1）的条件即定义为非许可温度。

在通过宽范围温度筛选确定非许可温度后，可将上述步骤在更窄的温度范围（5 °-10 °C）内重复进行，以明确目标酶的精确非许可温度。需要注意的是，本实验所确定的非许可温度可能与其他方法测得的熔解温度有所不同，这是由于反应体积、浓度等因素的差异所致。

2. 构建突变文库

构建待筛选的突变文库时，使用GeneMorph II随机突变试剂盒，通过具有最小核苷酸偏倚的易错DNA聚合酶在plyCA基因中随机引入突变，具体步骤如下：

1. 设计核苷酸引物，其熔解温度（T_m）在55–72 °C之间，并在plyCA基因的5'和3'端引入选定的限制性酶切位点。
2. 由于目标突变率为每plyCA（1.4 kb）2–3个核苷酸，因此使用制造商推荐的适用于低突变频率（0–4.5个/kb）的PCR反应组分浓度及热循环仪反应条件。
3. 将发生突变的plyCA基因克隆至表达载体pBAD24中。
4. 将构建好的质粒转化至DH5α pBAD33:plyCB菌株中，并将转化子涂布于添加了氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上。
5. 此外，将含有野生型（WT）plyCA基因的表达载体pBAD24转化至DH5α pBAD33:plyCB菌株并涂布平板。该平板上生长的菌落将作为筛选过程中的对照。

3. 96 孔微孔板制备与细胞培养条件

1. 在96孔微量滴定板的每个孔中加入200 μl添加了氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基。
2. 根据微量滴定板示意图（图2b），使用灭菌牙签从过夜培养的琼脂平板上小心挑取单个菌落，并接种到96孔微量滴定板的指定孔中。必须确保每个孔仅接种一个菌落。
3. 将固定好的96孔微量滴定板在37 °C下以300 rpm振荡培养过夜。

4. 影印培养、蛋白表达诱导及裂解液制备

1. 按照标题为“确定最佳加热条件”部分中的步骤1.5-1.11进行操作，仅作一项修改：在完成复制平板接种步骤后，将原始平板储存于4 °C。
2. 在步骤1.11之后，除阳性对照孔A1-D1外，将110 μl可溶性粗裂解液转移至96孔PCR板中对应的孔内。对于阳性对照裂解液（i.e. 未经加热处理的裂解液），将100 μl裂解液转移至新的96孔微孔板中对应的孔内，该微孔板将作为本实验的最终检测板，并置于冰上保存。

5. 可溶性裂解物热处理

1. 将当前置于96孔热循环板中的阴性对照和突变体可溶性裂解液放入热循环仪中，在第一步确定的优化非许可孵育温度下加热30分钟。
2. 在非许可温度孵育后，将96孔热循环板在4 °C下孵育5分钟。
3. 用多通道移液器将100 μl可溶性裂解液从96孔热循环板转移至最终的96孔微孔检测板中对应位置的孔内，该检测板中已预先加入阳性对照可溶性裂解液。
4. 使用12通道多通道移液器，向每个孔中加入100 μl GAS菌株D471。立即把该板放入微孔板分光光度计中。
5. 监测酶动力学，每15秒测量一次OD₆₀₀，持续20分钟。
   1. 热稳定性提升的PlyC变体定义为：在非许可温度下，能在少于900秒内使初始光密度降低50%的构建体。此外，阳性对照（即未经加热的野生型PlyC）需表现出野生型催化活性（t_1/2 ≤ 100秒），而阴性对照（即经加热的野生型PlyC）应无活性。
6. 一旦鉴定出具有提升热稳定性的PlyC变体，取出原先储存在4 °C的原始板，从对应目标突变体的单个孔中接种细菌至新鲜的含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，在37 °C过夜培养。
7. 从该培养物中提取并纯化质粒DNA，随后送测序以确定赋予PlyCA增强热稳定性的核苷酸突变。同时，取少量过夜培养物加入10%甘油，保存于-80 °C以供后续使用。

结果

在第一轮随机诱变结束时，共筛选了6000多个PlyC突变体，鉴定、挑选并测序了35个可能具有增强热稳定性的突变体。基因组分析结果总结于表I，表明在35个候选突变体中，有7个构建体在翻译水平上含有野生型PlyCA序列，对应于检测方法识别出的假阳性。在剩余的28个候选突变体中，核苷酸突变数量范围为1至6个，平均每plyCA基因发生2.75个核苷酸突变，处于我们预期的2-3个核苷酸突变的目标范围内。在翻译水平上，该特定的核苷酸突变范围和频率导致每PlyCA多肽发生1至5个氨基酸突变，平均每个PlyCA多肽发生1.9个氨基酸突变。

在28个至少含有一个氨基酸突变的候选突变体中，随机选取其中4个突变体构建体进行进一步表征，以验证定向进化方法的广泛筛选过程确实正常运行。突变体PlyC酶经纯化后，根据SDS-PAGE分析，纯度达到> 95%，纯化方法如前所述^6-7。在将纯化的酶于不同高温条件下孵育后，以等摩尔浓度测定野生型PlyC及四个PlyC突变体的酶动力学。通过向反应体系中加入D471 GAS后，每隔15秒测定600 nm处的光密度，持续20分钟，以监测酶活性。活性定义为酶经热孵育后的残余最大反应速率。在随机选取的四个候选突变体中，突变体29C3表现出最显著增强的热稳定性。在PBS缓冲液（pH 7.2）中，分别以80 nM和40 nM的浓度，对野生型PlyC和29C3的热稳定性在不同温度下进行孵育和活性检测。45–50 °C的孵育实验（图3）在热循环仪中进行，样品置于薄壁96孔热循环仪板中，总体积为120 μl。35 °C、40 °C和45 °C的孵育实验（图4和图5）在加热金属块中进行，样品置于1.5 ml微量离心管中，总体积为1.3 ml。所有实验均设置三个重复。

如图3中第一组柱状图所示，WT PlyC 与 29C3 在室温（25 °C）下的动力学稳定性无显著差异。然而，在 45–50 °C 温度范围内短期孵育 30 分钟后，29C3 在每个温度点的活性均显著高于 WT 构建体的特异性活性。例如，WT PlyC 在 45.2 °C 时活性损失达 44%，而 29C3 在相同温度下的活性损失仅为 2%。

在35 °C和40 °C条件下，还额外进行了长期孵育实验，比较WT PlyC和29C3的残留活性，并在24小时和48小时时间点测定其残留活性。在35 °C时，29C3在24小时和48小时孵育时间点的活性分别比WT PlyC高出41%和176%（图4a）。在40 °C时，29C3在24小时和48小时孵育时间点的活性分别比WT PlyC高出28%和107%（图4b）。

在45 °C条件下，每隔20分钟监测一次WT PlyC和29C3的残余活性，共监测3小时。在此温度下孵育3小时后，WT PlyC仅能保留21%的活性，而29C3能保留46%的活性。WT PlyC和29C3的半衰期（t_1/2）分别为67分钟和147分钟，表明29C3在45 °C时的动力学稳定性提高了2.2倍（图5）。

第一轮候选总数	35
具有野生型 PlyCA 序列的候选数	7
具有 ≥1 个氨基酸突变的候选数	28
— 平均核苷酸突变率 (nt/plyCA)	2.75
— 核苷酸突变范围 (nt)	1-6
— 平均氨基酸突变率 (AA/PlyCA)	1.9
— 氨基酸突变范围 (AA)	1-5

表1. 候选群体基因组分析。

图1. 定向进化实验方法。 在定向进化过程中，首先从先导酶开始，第一轮的先导酶为野生型PlyC（WT PlyC）。通过使用易错DNA聚合酶，对plyCA基因引入随机且无偏倚的核苷酸突变，构建PlyC突变体文库，随后将该文库克隆至表达载体pBAD24中，并转化至已含有pBAD33:plyCB的E. coli DH5α菌株。单个转化子被接种至96孔微孔板的各自独立孔中。通过一系列广泛的筛选过程，筛选出在非允许温度下孵育后仍具有催化活性的单个PlyC突变体，这些突变体被归类为具有增强动力学稳定性的突变体。其中表现出最显著热稳定性提升的构建体将作为下一轮随机诱变的先导酶。总体而言，整个过程包括三轮完整的随机诱变，随后进行DNA洗牌，最终获得具有进化后热稳定特性的溶菌分子。 点击此处查看高清大图。

图 2. 定向进化实验用96孔微量滴定板模板。 在确定最佳加热条件期间的微量滴定板示意图（图 2a）包括将单个亲本野生型PlyC克隆接种至微量滴定板的每一行中。在突变体筛选期间的微量滴定板示意图（图 2b）包括在第1列的每个孔中接种一个独特的亲本野生型PlyC克隆，同时在第2–12列的每个孔中接种不同的PlyC突变体克隆。A1–D1孔用于阳性亲本对照，包含未暴露于非许可温度孵育的野生型PlyC构建体。E1–H1孔用于阴性亲本对照，包含暴露于非许可温度孵育的野生型PlyC构建体。

图3. WT PlyC 与 29C3 的残留活性动力学分析比较。 酶经纯化至均一后，在相同摩尔浓度下，于室温或45–50 °C的温度梯度条件下，在PCR仪中孵育30分钟。酶活性与特定温度孵育后所表现出的最大反应速率（Vmax）相关。除25 °C和47.7 °C外，WT与29C3在各温度下的活性差异均具有统计学意义（p值 < 0.05）。所有数据均表示为三次独立实验的平均值±标准误（SEM）。

图4. 在35 °C和40 °C下，野生型PlyC与29C3的残余酶活性动力学分析。 将纯化的野生型PlyC和29C3以等摩尔浓度置于金属浴中，在35 °C（图4a）或40 °C（图4b）下孵育。在24小时和48小时时间点测定残余酶活性。每种构建体的活性均相对于零时间点测得的最大反应速率进行归一化处理。在每个温度和时间点，野生型PlyC与29C3之间的活性差异具有统计学意义（p值< 0.05）。所有数据均表示为三次独立实验的平均值±标准误（SEM）。

图 5. 在 45 °C 下比较 WT PlyC 与 29C3 残余活性的动力学分析。将纯化的 WT PlyC 和 29C3 以等摩尔浓度在 45°C 的加热块中孵育，每 20 分钟测定一次残余酶活性，持续 3 小时。每种构建体的活性均标准化为零时间点所显示的最大反应速率。除 20 分钟时间点外，WT 与 29C3 在各时间点的活性差异对应的 p 值< 0.05。所有数据均表示为三次独立实验的平均值 ± 标准误（SEM）。

讨论

本方案如图1所示，介绍了一种96孔微孔板方法，可用于定向进化以提高任意一种溶菌酶的热稳定性。通过使用易错DNA聚合酶，可引入随机突变，从而提高目标溶菌分子整体的动力学稳定性，这种稳定性提升通常源于分子结构的重排，包括增强静电作用、二硫键桥和疏水相互作用，进而实现更优的分子堆积、表面电荷网络的改良或更高寡聚化状态的强化^17-18。在引入核苷酸突变后，需采用大规模筛选程序来鉴定具有热稳定优势的突变体。本文展示的代表性结果基于一轮随机诱变实验。实际上，已有研究建议，对于此类定向进化热行为研究，应至少连续进行三轮随机诱变，每轮均以最稳定的突变体作为起始酶，并在最后进行DNA改组²。

需要明确的是，尽管本方案可鉴定出增强动力学稳定性的突变，但这些突变体并不一定具有更高的热稳定性。当一个分子能够在高温下保持其结构时，才被认为是热稳定的。然而，在本实验方法中，突变体裂解液的残余活性并非在热处理步骤所使用的相同温度下进行检测，因此所筛选出的突变可能促进的是蛋白质复性，而非真正增强热稳定性¹⁹。尽管我们通过推断热行为来作为热稳定性的指标，但真正的热稳定性必须通过圆二色光谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）和差示扫描荧光法（DSF）等生物物理方法进行实证测量。来自CD和DSF实验的初步数据显示，本方法所鉴定出的多个候选突变体确实表现出提升的热稳定性（数据未显示）。

尽管本文所述方法专门用于增强PlyC的热稳定性，但通过略微调整缓冲液、突变率、加热条件和表达系统等变量，该方法也可用于提高其他溶菌酶的热活性。本实验中的一个关键变量是易错DNA聚合酶的核苷酸突变率。在定向进化实验中，我们选择使用易错的Mutazyme II DNA聚合酶，因为已有实验证据表明，与其他随机诱变技术（如羟胺处理、突变型E. coli菌株及其他易错DNA聚合酶）相比，该酶在将核苷酸随机掺入目标基因时表现出最低的偏倚性²⁰。通常，较低的突变率更为理想，原因有二。首先，蛋白质热稳定性的改造通常仅需少数几个氨基酸替换；较高的突变率可能导致分子结构发生剧烈改变，最终引起结构错误折叠和功能异常。例如，甘氨酸和脯氨酸残基的引入可能破坏α螺旋二级结构²¹。其次，较高的核苷酸突变率会增加提前终止密码子被引入的概率，从而产生截短的、无生物活性的蛋白分子。总体而言，较低的突变率更受青睐，因为较低的错误率有助于积累适应性突变，而较高的突变率则更可能产生中性或有害突变²²。

在每一轮随机突变中，另一个需要优化的关键变量是筛选过程中所使用的孵育温度。选择实验中的非许可温度相对具有挑战性。我们最初采用的孵育温度比PlyC的非许可温度高10 °C，但在筛选了3,000个突变体后，未能鉴定出任何有利的突变。考虑到定向进化方法依赖于逐步识别具有累加效应的有益氨基酸替换，因此决定在筛选过程中采用较为宽松的温度，即使这可能会增加产生假阳性结果的风险。因此，我们改用仅比非许可温度高出几度的孵育条件，并对筛选出的候选突变体进行重新验证，以排除假阳性结果。

我们决定采用一个既不过于温和（不超过最低非许可温度1°C以上）、也非过于严苛（不低于最低非许可温度5°C以上）的孵育温度。在此特定实验中，我们选择的理想温度为比实验确定的最低非许可温度高2°C的适中温度。若选择过为温和的温度，会导致假阳性识别率远高于我们在使用适中孵育温度时观察到的约20%（表I）。此外，若孵育温度过高，最终可能导致无法识别出具有显著增强热稳定性的突变体。例如，若采用高于或等于最低非许可温度5°C的孵育温度，则将无法识别出具有良好潜力的29C3突变体，以及第一轮筛选中选出的大多数其他候选突变体。

综上所述，我们提供了一种用于改造溶菌酶以获得增强动力学稳定性的实验方案。此外，该检测方法在不进行加热步骤的情况下，也可用于筛选可提高催化活性的突变体。同时提升催化活性与热稳定性是任何治疗用酶在开发过程中面临的重要技术难题。尽管本方案的具体细节针对溶菌酶 PlyC 而设计，但该方法只需少量修改即可适用于其他任何溶菌酶。我们展示了仅通过第一轮诱变所获得的初步结果，验证了该检测方法的功能有效性，成功实施并鉴定出若干可显著提高分子热稳定性的突变体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-PER II 细菌蛋白提取试剂	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II 随机诱变试剂盒	Agilent Technologies	200500
透明 96 孔平底带盖微孔板	BD Vacutainer Labware Medical	353072
96 孔无裙边 PCR 板	Fisher Scientific	14-230-232
摆动桶转子	Eppendorf	A-2-DWP
氨苄青霉素钠盐	Fisher Scientific	BP1760
氯霉素	Fisher Scientific	BP904
阿拉伯糖	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 表达载体	ATCC	87399
pBAD33 表达载体	ATCC	87402