使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

摘要

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4 mm临界尺寸颅骨缺损以评估骨骼再生的方法。

摘要

颅面骨骼修复与再生具有巨大的潜力 从头合成 通过基于细胞的方法利用干细胞实现组织形成。脂肪来源的基质细胞（ASCs）已被证实是多能干细胞的丰富来源，能够进行成骨、软骨、脂肪和肌源性分化。许多研究已探讨了这些细胞的成骨潜能 体内 通过使用多种用于细胞递送的支架生物材料，已有研究表明，采用负载脂肪来源干细胞（ASCs）的具有骨传导性的羟基磷灰石涂层聚乳酸-羟基乙酸共聚物（HA-PLGA）支架，可有效促进临界尺寸颅骨缺损的骨组织再生。临界尺寸颅骨缺损是指在动物生命周期内无法自发愈合的骨缺损。该方法可实现显著的骨再生效果。 体内 该模型展示了旨在再生骨组织的转化研究方法的基础——细胞组分与生物基质。该方法为祖细胞在修复特定组织缺损中的最终临床应用提供了模型。

方案

1. 细胞分离与扩增

1. 所有患者知情同意书和实验方案均经斯坦福大学机构审查委员会（Stanford University Institutional Review Board）审核并批准（方案编号 #2188 和 #9999）。
2. 在局部或全身麻醉下，通过择期负压吸脂术获取人皮下脂肪组织。
3. 吸脂产物中将出现两层（图1A）。上层为液相，含有绝大部分经处理的细胞成分；下层主要为注入的生理盐水。脂肪来源的基质细胞可从任一层中获取，但上层的细胞得率显著更高。
4. 为分离基质血管组分（SVF），先用等体积含2.5%聚维酮碘（betadine）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤吸脂物（洗涤两次），随后用等体积不含聚维酮碘的1×PBS再洗涤一次（洗涤一次），静置使沉淀析出。
5. 整个操作过程中需严格保持无菌技术，因处理的人体组织易受污染。
6. 每次洗涤后，小心吸除并弃去下层液体。
7. 将15 ml脂肪组织分装至50 ml BD Falcon圆锥形离心管中。
8. 加入等体积（15 ml）过滤后的0.075% II型胶原酶（Type II collagenase）于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，在37 °C水浴中消化60分钟，持续震荡（约180次/分钟），每15分钟通气一次。
9. 加入含10%胎牛血清（Fetal Bo....

讨论

自从从脂肪抽吸物中分离出脂肪来源的基质细胞²以来，这些细胞已被诱导分化为多种细胞谱系。脂肪组织起源于中胚层，因此，多能性脂肪来源的基质细胞在应用于中胚层谱系时可能最为有效。鉴于自体移植供区的短缺以及合成材料固有的局限性（包括感染、排斥反应及随时间推移而降解等问题）³，生成骨骼组织的能力尤为重要。脂肪来源的基质细胞提供了一种潜在的自体多能细胞系，每次手术获取均可获得相对较高的细胞产量⁴。

在处理基质血管组分和脂肪细胞组织时，必须保持良好的无菌操作技术。由于脂肪抽吸物本身具有较大的体积，并且在细胞培养超净台外需经历多次洗涤、消化和离心等操作，因此原代培养过程中存在较高的污染风险。当细胞沉淀接种至培养皿后，所见的大部分可见细胞为红细胞。待脂肪来源的基质细胞贴壁后，可通过无菌 PBS 洗去红细胞，或使用红细胞裂解缓冲液进行处理。在初始接种步骤中，细胞应保持相对较高的汇合度，以确保其正常生长和分化能力。

关于如何准确定义脂肪来源的基质细胞，目前尚无统一共识。尽管已有研究尝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂肪抽吸物采集
PBS	Gibco	10010-023
Hank's 平衡盐溶液	Cellgro	21-023-CV
胶原酶	Sigma	C6885-500MG
细胞滤筛 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm 滤器	Millipore	SCGPT05RE
颅骨缺损模型
Z500 无刷微型电机 UM50C	NSK	NSKZ500
圆形刀 4.0 mm	Xemax 外科	CK40