使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

摘要

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4 mm临界尺寸颅骨缺损以评估骨骼再生的方法。

摘要

颅面骨骼修复与再生具有巨大的潜力 从头合成 通过基于细胞的方法利用干细胞实现组织形成。脂肪来源的基质细胞（ASCs）已被证实是多能干细胞的丰富来源，能够进行成骨、软骨、脂肪和肌源性分化。许多研究已探讨了这些细胞的成骨潜能 体内 通过使用多种用于细胞递送的支架生物材料，已有研究表明，采用负载脂肪来源干细胞（ASCs）的具有骨传导性的羟基磷灰石涂层聚乳酸-羟基乙酸共聚物（HA-PLGA）支架，可有效促进临界尺寸颅骨缺损的骨组织再生。临界尺寸颅骨缺损是指在动物生命周期内无法自发愈合的骨缺损。该方法可实现显著的骨再生效果。 体内 该模型展示了旨在再生骨组织的转化研究方法的基础——细胞组分与生物基质。该方法为祖细胞在修复特定组织缺损中的最终临床应用提供了模型。

方案

1. 细胞分离与扩增

1. 所有患者知情同意书和实验方案均经斯坦福大学机构审查委员会（Stanford University Institutional Review Board）审核并批准（方案编号 #2188 和 #9999）。
2. 在局部或全身麻醉下，通过择期负压吸脂术获取人皮下脂肪组织。
3. 吸脂产物中将出现两层（图1A）。上层为液相，含有绝大部分经处理的细胞成分；下层主要为注入的生理盐水。脂肪来源的基质细胞可从任一层中获取，但上层的细胞得率显著更高。
4. 为分离基质血管组分（SVF），先用等体积含2.5%聚维酮碘（betadine）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤吸脂物（洗涤两次），随后用等体积不含聚维酮碘的1×PBS再洗涤一次（洗涤一次），静置使沉淀析出。
5. 整个操作过程中需严格保持无菌技术，因处理的人体组织易受污染。
6. 每次洗涤后，小心吸除并弃去下层液体。
7. 将15 ml脂肪组织分装至50 ml BD Falcon圆锥形离心管中。
8. 加入等体积（15 ml）过滤后的0.075% II型胶原酶（Type II collagenase）于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，在37 °C水浴中消化60分钟，持续震荡（约180次/分钟），每15分钟通气一次。
9. 加入含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的15 ml PBS终止酶活性，随后在4 °C下以1,000 rpm离心5分钟，获得高密度的SVF沉淀。该沉淀为脂肪来源的基质细胞与红细胞的混合物。
10. 弃去上清液，注意勿扰动沉淀。
11. 将沉淀重悬于10 ml传统生长培养基（Dulbecco's改良Eagle培养基[DMEM]/10% FBS/1%青霉素-链霉素溶液）中。
12. 通过100 μm尼龙细胞滤器过滤悬液，以去除细胞碎片。
13. 将3支离心管的样品合并至一个洁净的50 ml离心管中，在4 °C下以1,000 rpm离心5分钟。
14. 弃去上清液，注意勿扰动沉淀。
15. 将沉淀重悬于5 ml传统生长培养基中。
16. 每1个10 cm培养皿使用2个50 ml离心管的样品，或每1个15 cm培养皿使用5个50 ml离心管的样品进行合并。
17. 在37 °C、21% O₂、5% CO₂条件下培养过夜，建立原代细胞培养。
18. 过夜孵育后，用PBS充分洗涤培养皿，以去除残留的非贴壁红细胞。所得细胞群体即为脂肪来源的基质细胞。
19. 在生长培养基中，于37 °C、21% O₂、5% CO₂条件下维持细胞在亚融合状态，以防止自发分化。当细胞以50%融合度接种时，通常每三至四天需在常规生长培养基中传代一次。

2. 支架制备

1. 支架由加州大学洛杉矶分校牙科学院的 Min Lee 博士制备。
2. PLGA 支架采用 85/15 聚（乳酸-共-乙醇酸）（固有黏度 = 0.61 dl/g，Birmingham Polymers）通过溶剂浇铸法和颗粒沥滤法制备。
3. 将 PLGA/氯仿溶液与直径为 200–300 μm 的蔗糖混合，以获得 92% 的孔隙率（体积分数），并在聚四氟乙烯模具中压制成薄片。
4. 经冷冻干燥过夜后，将支架浸入三次更换的双蒸馏水（ddH₂O）中以溶解蔗糖，并用细头刮刀轻轻从聚四氟乙烯板上取下。
5. 颗粒沥滤后，所有支架依次浸入 50%、60% 和 70% 乙醇中各 30 分钟进行消毒，随后用 ddH₂O 洗涤三次。
6. 所有支架均在层流罩下干燥。
7. 支架制备完成后，对其进行羟基磷灰石涂层处理。
   1. 配制模拟体液（SBF）溶液，其离子浓度为人体血浆的 5 倍。所有溶液均通过 0.22 μm 聚醚砜膜（Nalgene）无菌过滤。在涂层处理前立即对干燥的 PLGA 支架进行辉光放电和氩等离子体刻蚀（Harrick Scientific），以提高润湿性和涂层均匀性。
   2. 刻蚀后的 PLGA 支架随后在 37 °C 水套培养箱中于 SBF 中孵育 12 小时，接着在 37 °C 下轻轻搅拌条件下，于不含 Mg²⁺ 和 HCO₃^- 的 SBF2 中继续孵育 12 小时。
   3. 涂层后的 PLGA 支架用无菌双蒸水（ddH₂O）轻轻冲洗，以去除多余的氯化钠溶液，随后在层流罩中干燥并用 70% 乙醇消毒。
   4. 采用扫描电子显微镜（SEM）分析羟基磷灰石涂层的完整性。将涂层支架固定在 SEM 样品台（Ted Pella）上，并镀碳以提高导电性。在 SEM（FEI/Phillips XL-30）观察过程中采用二次电子模式，并获取能量色散 X 射线光谱以确认羟基磷灰石结构的元素组成。

3. 细胞接种

1. 当细胞达到亚汇合状态时，用 PBS 洗涤细胞（2 次），然后进行胰蛋白酶消化。
2. 计数细胞以确定接种数量
3. 接种于预先切割的直径为4.0 mm的支架上，细胞密度为1.5 × 10⁵ 细胞
   1. 将单个支架放入96孔板的孔中
   2. 在常规生长培养基中重悬细胞，浓度约为 1.5 x 10⁵ 细胞每 20 μl 培养基
   3. 移液 20 μl 直接接种到支架上，放入细胞培养箱中孵育30分钟。
   4. 30分钟后，加入 200 μl 培养基孵育，并在手术前使细胞在支架上孵育过夜
   5. 无需确保细胞完全黏附于支架上，因为接种足够数量的细胞可保证大部分细胞自行黏附至支架。该方法已在本实验室得到验证 体内 通过生物发光和组织学分析。

4. 颅骨缺损的制备与 体内 植入

1. 用麻醉剂混合物（氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪）以50%浓度（用0.9% NaCl 1:1稀释）或根据各机构推荐的麻醉方案对60日龄成年CD-1裸鼠进行麻醉。这些小鼠为无胸腺型，因此hASCs不会引起免疫反应。
   1. 剂量：盐酸氯胺酮（80 mg/kg）、赛拉嗪（2.5 mg/kg）、乙酰丙嗪（2.5 mg/kg）
   2. 作用持续时间：约 30 min
2. 手术时将动物进行无菌铺巾，使用碘伏和酒精对手术部位消毒三次，并在切开头皮前用眼膏覆盖小鼠眼睛以保护角膜。沿头皮正中矢状线做一 incision，暴露右侧顶骨。用钝性刮除法去除右侧顶骨表面的骨膜。图1B).
3. 使用无菌金刚石涂层环钻在右侧非缝合相关的顶骨上制备一个4毫米全层骨缺损。 必须极度小心，以免扰动下方的硬脑膜（图1B）因为小鼠颅顶骨的厚度是 <0.3 mm
4. 植入前，用无菌 PBS 冲洗支架，以防止培养基来源的生长因子转移。
5. 将支架植入缺损处。
6. 最后，缝合皮肤，并按照既定的术后护理方案对动物进行监测。
7. 根据动物护理方案的要求，在术后按需使用已确立的镇痛方法。 例如. 布托啡诺 0.1 mg/kg。

5. 类骨质形成量的定量分析

1. 在对小鼠进行 MicroCT 扫描后，使用 MicroView 软件按照先前所述方法重建三维图像¹.
2. 使用 Adobe Photoshop 将图像调整为标准高度。
3. 使用魔棒功能，测量了颅骨缺损区域的像素。
4. 通过后续CT扫描测量颅骨缺损区域，计算像素数量，并将其除以原始缺损区域的像素数量，以确定缺损的愈合百分比
5. 因此，如果无法使用MicroCT，可采用Adobe Photoshop，并在预定时间点取材颅骨进行组织学分析作为替代方法。
6. 使用可标记类骨质形成的组织学染色剂（如苯胺蓝和五色染色法），应对缺损区域沿跨度的多个切面进行染色
7. 使用 Adobe Photoshop 裁剪掉颅骨缺损区域以外的所有部分
8. 使用魔棒工具并确定像素数量 从头合成 在缺损区域观察骨形成情况，并与对照组或其他变量进行比较。

6. 代表性结果

脂肪组织在临床应用中具有作为前体细胞来源的重要潜力。其独特优势在于，脂肪组织来源丰富，可通过一种相对简单的手术 procedure 获取，且伴随的发病率和死亡率极低。在组织被采集并收集后，我们的实验方案如下所述： 图2脂肪来源的基质细胞通过一系列洗涤步骤、胶原酶消化和离心分离获得。细胞接种培养后可进行扩增，并进入各种诱导分化方案。 体外，或直接放置 体内.

4 mm临界尺寸颅骨缺损模型的建立提供了一种易于操作且可重复的 在体 用于检测我们所获得的脂肪源性基质细胞成骨分化能力的模型。通过使用MicroCT，我们能够追踪骨骼组织的形成过程 体内 并追踪我们干预措施的进展（图 3）。颅骨临界尺寸缺损在动物的整个生命周期内不会自行愈合，我们观察到大约8周时约有90%的缺损区域仍保持未愈合状态。支架材料本身（见讨论部分）具有成骨诱导特性，已显示出能够诱导一定程度的骨再生。典型的无细胞支架植入结果表明，缺损区域约有三分之一将出现骨组织再生 从头合成 8周时的骨形成情况。通过添加脂肪来源的基质细胞，大约8周时，缺损区域中完全有三分之二或更多的部分将显示出骨组织再生，尽管在不同动物及手术之间存在一定变异。骨骼组织的形成可通过组织学进行定量分析，典型结果表明，经阿尼林蓝和五色染色后，含有ASCs的样本中类骨质形成增加。图3C。此外，我们还表明，植入的人类细胞有助于底层组织的形成 从头合成 通过显示染色的GFP标记hASCs实现骨组织形成 体内 2周时，在该区域附近 从头合成 颅骨缺损中的骨形成（图 3D）此外，我们使用针对人类特异性抗体的免疫组织化学方法，以显示人源细胞在缺损区域的存活及其贡献图3E）。

图 1. A — 脂肪抽吸物分为两层。上层含有脂肪细胞及大部分细胞间质成分，下层为脂肪抽吸过程中使用的生理盐水。B — 通过颅骨骨膜上方正中切口暴露右侧顶骨，随后制作一个4 mm的临界尺寸颅骨缺损，且不损伤下方的硬脑膜。

图 2. 从脂肪来源基质细胞的分离到其扩增、分化及在体外和体内应用的脂肪抽吸物获取与利用概览。

图3. A -MicroCT 显示 体内 通过羟基磷灰石支架递送脂肪来源干细胞（ASCs）促进颅骨临界尺寸缺损的修复（底行）。对照组包括无支架且无缺损（顶行）以及仅植入支架但未接种细胞的缺损模型（中行）。B - MicroCT定量分析显示，ASC组骨愈合显著增加。C - 苦味酸-品红及苯胺蓝染色组织学结果，显示ASC组（底行）类骨质形成增多；苯胺蓝染色中类骨质呈深蓝色，五色染色（Pentachrome）中类骨质呈黄色。D - 将表达GFP的hASCs接种于支架后植入颅骨缺损区，术后2周处死动物；采用GFP标记的抗体进行染色，以显示人源细胞在缺损区域参与组织再生。E - 人源核抗原免疫组织化学染色显示，术后2周缺损区域存在大量人源细胞。 单击此处查看大图.

讨论

自从从脂肪抽吸物中分离出脂肪来源的基质细胞²以来，这些细胞已被诱导分化为多种细胞谱系。脂肪组织起源于中胚层，因此，多能性脂肪来源的基质细胞在应用于中胚层谱系时可能最为有效。鉴于自体移植供区的短缺以及合成材料固有的局限性（包括感染、排斥反应及随时间推移而降解等问题）³，生成骨骼组织的能力尤为重要。脂肪来源的基质细胞提供了一种潜在的自体多能细胞系，每次手术获取均可获得相对较高的细胞产量⁴。

在处理基质血管组分和脂肪细胞组织时，必须保持良好的无菌操作技术。由于脂肪抽吸物本身具有较大的体积，并且在细胞培养超净台外需经历多次洗涤、消化和离心等操作，因此原代培养过程中存在较高的污染风险。当细胞沉淀接种至培养皿后，所见的大部分可见细胞为红细胞。待脂肪来源的基质细胞贴壁后，可通过无菌 PBS 洗去红细胞，或使用红细胞裂解缓冲液进行处理。在初始接种步骤中，细胞应保持相对较高的汇合度，以确保其正常生长和分化能力。

关于如何准确定义脂肪来源的基质细胞，目前尚无统一共识。尽管已有研究尝...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂肪抽吸物采集
PBS	Gibco	10010-023
Hank's 平衡盐溶液	Cellgro	21-023-CV
胶原酶	Sigma	C6885-500MG
细胞滤筛 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm 滤器	Millipore	SCGPT05RE
颅骨缺损模型
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圆形刀 4.0 mm	Xemax 外科	CK40