本文描述了从重组大肠杆菌（E. coli）中纯化胆固醇结合毒素链球菌溶素O的方法，以及该毒素与活体真核细胞结合的可视化技术。局部递送毒素可诱导靶向细胞发生快速而复杂的改变，揭示了毒素生物学的新特征。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌毒素与细胞膜中的胆固醇结合，形成孔道，导致细胞内容物泄漏以及胞外物质内流。细胞可能通过主动的膜修复过程从这种损伤中恢复，也可能死亡，具体结果取决于毒素暴露量和细胞类型1。此外，这些毒素通过激活免疫细胞（包括巨噬细胞）在感染宿主中引发强烈的炎症反应，巨噬细胞会释放多种促炎性细胞因子2。许多革兰氏阳性菌可产生结合胆固醇的毒素，已被证实可通过尚不明确的机制增强其毒力。
细胞暴露于这些毒素后，其质膜会发生形态学改变，包括被隔离到富含胆固醇的细胞表面突起中，这些突起可被释放到细胞外空间，提示存在一种内在的细胞防御机制3,4。该过程在无代谢活性的情况下即可发生于所有细胞，可通过化学固定后的电镜观察进行可视化4。在响应毒素暴露而介导炎症反应的免疫细胞（如巨噬细胞）中，诱导产生的膜性小泡可能含有IL-1家族的细胞因子，或同时参与毒素的清除以及这些促炎性细胞因子的扩散5,6,7。已有研究提示IL-1β的释放与一种特定类型的细胞死亡（称为焦亡）之间存在关联，因为二者均为依赖caspase-1的过程8。为了阐明巨噬细胞这一复杂反应（包括毒素结合、膜性小泡脱落、细胞因子释放以及潜在的细胞死亡）的机制，我们开发了标记技术及荧光显微镜方法，可实现对毒素与细胞相互作用的实时可视化观察，包括细胞功能障碍和死亡的检测（图1）。由于其他技术存在局限性，活细胞成像的使用尤为必要。生化方法无法解析单个细胞内的效应，而流式细胞术则不能提供对单个细胞的高分辨率、实时可视化观察。本文所述方法亦可用于分析其他刺激物诱导的、涉及复杂细胞表型变化的动态响应过程。
方案
1. 链球菌溶素O（SLO）的纯化
- 将含有 pBADgIII-SLOhis 质粒9 的 BL21 GOLD 细菌的 20 ml 过夜培养物接种至 0.5 L LB 液体培养基中，并加入 500 μl 50 mg/ml 氨苄青霉素。在 37 °C、225 rpm 条件下振荡培养，直至 OD600 = 0.6（通常约 1.5 小时）。取 1 ml 细菌（记为 T0）在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟，将沉淀溶解于 140 μl 1× SDS 样品缓冲液/1 OD 中，并进行超声处理以剪切 DNA，用于蛋白质纯度分析。
- 向培养物中加入 5 ml 20% 阿拉伯糖以诱导表达，在室温下以 225 rpm 振荡培养 3 小时。收集 1 ml 细菌，离心后按上述方法溶解于 1× SDS 样品缓冲液中，作为 T3 时间点样品用于纯度分析。
- 将剩余细菌收集至 500 ml 离心瓶中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 12 分钟（Sorvall GS-3 转子，8,500 rpm）。弃去上清液，如需可将沉淀在 -80 °C 保存过夜或更长时间。
- 将冷冻的沉淀在冰上用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）重悬，并加入 400 μl 25% Triton X-100、100 μl 100 mg/ml 溶菌酶和 50 μl 200 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）。将重悬后的沉淀转移至 50 ml Oak Ridge 管中。
- 在冰上对裂解液进行 5 次超声处理，每次 30 秒，间隔 30 秒。将超声处理后的裂解液在 Oak Ridge 管中于 4 °C 以 39,000 × g 离心 20 分钟（Sorvall SS-34 转子，18,000 rpm）。
- 在裂解液离心的同时，用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液洗涤 1 ml Ni-NTA 琼脂糖，于 4 °C 以 1,200 rpm 离心 5 分钟（后续所有洗涤和洗脱步骤均采用此离心条件）。吸除洗涤液。
- 将步骤 1.5 中获得的细菌上清液加入 Ni-NTA 琼脂糖中，在 4 °C 轻柔振荡 2.5 小时。离心收集上清液。取 30 μl 上清液与 10 μl 4× SDS 样品缓冲液混合，保存用于纯度分析。用裂解/洗涤缓冲液洗涤琼脂糖珠 4 次，再用 Tris/盐缓冲液（50 mM Tris、300 mM NaCl，pH 8.0）洗涤 1 次。
- 每次加入 1 ml 洗脱缓冲液（Tris/盐缓冲液中含 250 mM 咪唑）和 5 μl 1 M 二硫苏糖醇（DTT）至琼脂糖珠中，冰上孵育 10 分钟，离心并收集上清液，共洗脱 3 次。SLO 是一种对氧化还原状态极为敏感的蛋白质，必须始终置于冰上。一旦被还原，即使短暂升温至 37 °C，蛋白质也会迅速失活。
- 用洗脱缓冲液洗涤 500 μl 多粘菌素偶联琼脂糖，在 4 °C 以 10,000 × g 离心 1 分钟，重悬于 500 μl 缓冲液中。为去除内毒素，向每次洗脱液中加入 200 μl 琼脂糖珠，在 4 °C 振荡 30 分钟。在 4 °C 以 10,000 × g 离心 1 分钟，保留上清液。取每次洗脱液 30 μl 与 10 μl 4× SDS 样品缓冲液混合，用于 SDS-PAGE 分析。
- 通过 SDS-PAGE 检测洗脱液的纯度。将用于凝胶分析的样品在 95 °C 煮沸 5 分钟，取 10 μl 上样至 10% 凝胶。用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质条带（图 2A）。SLO 分子量为 69 kDa。采用 Bradford 法测定蛋白浓度（前两次洗脱液的典型产量为 4 mg/ml，但可能因菌株和质粒不同而有所差异）。
- 检测每次洗脱液的溶血活性（见下文）。将纯度、浓度和溶血活性均达标的洗脱液合并。将 SLO 分装为单次使用量（通常为 5–10 μl），在干冰上速冻后于 -80 °C 保存。
2. 溶血实验
- 用RBC检测缓冲液（0.3% 牛血清白蛋白（BSA）、2 mM CaCl2、10 mM Hepes，pH 7.4）洗涤羊红细胞（RBCs），在1,200 rpm下离心5分钟，然后将红细胞重悬于10 ml RBC检测缓冲液中，终浓度为2.5%。
- 在冰上将96孔V型底板每孔加入10 μl RBC检测缓冲液。每个洗脱液样品做复孔并进行系列稀释，典型稀释范围为1:1,000至1:512,000。设置3个无毒素孔作为阴性对照，3个每孔加入10 μl 2% Triton X-100的孔作为最大裂解对照。
- 盖好板后于37 °C孵育30分钟，以1,200 rpm离心5分钟。将70 μl上清液转移至平底96孔板，测定A405。一个活性单位定义为引起50%红细胞裂解所需的毒素稀释度。毒素活性计算公式为：1单位×稀释倍数/0.01 ml。
3. 细胞裂解实验
- 收集细胞，计数，离心。用缓冲液 R/B（含 2 mM CaCl2 和 0.5% BSA 的 RPMI 培养基）重悬细胞至浓度为 2×106/ml，并加入 20 μg/ml 碘化丙啶。取 100 μl 细胞悬液加入 96 孔 V 型底板中。
- 用缓冲液 R/B 将 SLO 连续稀释至终浓度的 2 倍，然后向细胞中加入 100 μl 毒素溶液或 100 μl 缓冲液 R/B。37 °C 孵育 5 分钟。通常的终浓度范围为 2,000 U/ml 至 31.25 U/ml。
- 将细胞上流式细胞仪，使用藻红蛋白（PE）滤光片收集数据。一个对数级位移代表暂时性通透化的细胞，而三个对数级位移则表示死亡细胞4。通过从实验组的死亡细胞百分比（%PIhighexp）中减去对照组的死亡细胞百分比（%PIhighctl），计算细胞的特异性裂解率，公式如下：特异性裂解率 = (%PIhighexp - %PIhighctl) / (100 - %PIhighctl) × 100
4. 向培养皿中的细胞进行微量移液器递送毒素
- 实验前一天，将 2×105 个巨噬细胞接种于胶原包被的玻璃底 35 mm 培养皿中。
- 开启显微镜和显微注射仪。使加热载物台预热至 37 °C。显微镜的选择通常取决于本地可用设备。所需显微镜应具备倒置平台、可将培养皿加热至 37 °C 的载物台、适用于所选染料的激发/发射滤光片组，以及可物理连接显微注射仪的空间。配备伯特兰透镜（Bertrand lens）有助于显微注射操作，但非必需。驱动显微镜的计算机需具备足够的内存以采集和存储数据。
- 在 37 °C 条件下用染料对细胞标记 30 分钟。根据实验类型，可使用 5 μl Fura2 AM 加入 1 ml PBS 中，或 2 μl calcein AM 加入 1 ml 完全培养基中进行染色。对于 Fura2，采集 340/510 nm 和 380/510 nm 的激发/发射信号，340/380 信号的比值用于确定钙离子流。对于 calcein，激发/发射波长为 495/515 nm；ethidium homodimer 为 525/620 nm；APC 为 650/660 nm。也可选择其他标记物。
- 用 PBS 洗涤细胞后，加入 1 ml 含 2 mM CaCl2 的 RPMI 培养基。将培养皿置于显微镜载物台上。
- 将毒素和葡聚糖溶于水中，并在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。通常将 1 μl SLO 和 4 μl 10 mg/ml dextran-555 溶于 6 μl 水中。使用葡聚糖或其他荧光液相分子可验证飞秒移液尖端（femto-tip）未堵塞，并能按预期注射。
- 使用微量移液器（microloader）从后端向飞秒移液尖端加载 0.07 μl 稀释后的毒素。
- 将飞秒移液尖端安装到显微注射仪上。调整注射仪角度，使尖端位于细胞中心上方，并留有在各个方向移动的空间。清除 z 轴限位。注射参数应设置为：120 psi 压力下注射 0.5 秒，背压为 20 psi。降低尖端直至其进入培养液中。
- 使用伯特兰透镜将尖端居中，并在降低过程中追踪其位置。一旦失去焦点，切换回常规光学模式。针尖阴影应在视野中清晰可见。先对焦于细胞上方，再降低针头直至其进入焦点。重新对焦于细胞，小心地将针头移至细胞旁。设定注射的 z 轴限位。开始成像，将针尖移至目标位置，在预定时间点注射以释放毒素。注射后抬起针头，移至另一区域的细胞进行下一次注射。完成操作后将针头移回原位，防止毒素从针头意外泄漏。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通常，当蛋白浓度为 4 mg/ml 时，可获得 107-108 U/ml 的 SLO。不同细胞类型裂解所需的毒素量有所不同，但通常为 125–500 U/ml SLO（图 2B）。某些细胞类型（如巨噬细胞）可能更具抗性（4000 U/ml），而其他细胞（尤其是 T 细胞系）则更为敏感。这些敏感性与市售 SLO 的活性一致。每次冻融后，毒素活性大约下降 2 倍，因此需要对每批或每次解冻的毒素进行溶血活性检测，以确认其活性。此外，在缺乏含胆固醇膜的情况下，该毒素对热和氧化极为敏感10，因此操作该蛋白时需格外小心。
通过微递送毒素，可以在同一培养皿中比较未处理细胞与毒素处理细胞的情况。同时，由于从微移液管尖端会形成扩散梯度，该方法也为毒素活性提供了内部对照。靠近微移液管尖端的区域将出现细胞死亡，表现为钙黄素信号丢失和乙啶同二聚体摄取，而远离尖端的区域则无损伤表现（图3）。鉴于所用毒素的强效性，即使在施加反向压力的情况下，微移液管尖端渗漏的微量毒素也可能在移...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述技术可用于检测免疫细胞对细菌毒素的反应。其中最关键的步骤是毒素的处理与给药。由于毒素性质脆弱，即使同一制备样品的不同等分试样之间，其活性也可能存在极大差异。因此，必须对每份毒素等分试样使用参考细胞系或红细胞进行活性测试，或采用毒素浓度梯度法。通过微量移液器施加的毒素浓度梯度可在实时观察中呈现毒素诱导的全部生物学效应，但该方法不适用于生化分析。
微量移液器递送毒素可能具有挑战性。然而，与标准的显微注射不同，本实验无需刺入细胞内部。事实上，必须注意避免针头本身损伤细胞，因为这会引发类似的膜修复反应12。特别是在免疫细胞中，针头接触所产生的钙信号会通过纳米管在培养物中的其他细胞间传播11。不刺入细胞还可延长针头的使用寿命。同样，使用伯特兰透镜（Bertrand lens）观察针头下降至细胞的过程，可减少微量移液器定位的不确定性。尽管受损的针头比完好的针头释放毒素更快，但仍可用于生成初步结果。微注射系统允许多次注射，以便获得更高的毒素梯度。或者，也可通过调整注射持续时间来改变递送剂量。该微注射系统还允许在同一培养皿内进行多个实验。此外，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Richard Rest 慷慨提供炭疽溶素 O，感谢 Michael Caparon 慷慨提供 SLO 质粒，以及感谢 Jonathon Franks 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 T32CA82084（PAK）和 R01AI072083（RDS）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | |
| 多粘菌素-琼脂糖 | Sigma | P1411-5ML | |
| Zeba脱盐离心柱 | Fisher | PI-89891 | |
| 绵羊红细胞 | Fisher | 50-415-688 | |
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | 参见参考文献9 |
| Cy5单反应性染料 | GE Healthcare | PA25001 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |
| 钙黄绿素 AM / 碘化丙啶均聚物 | Life Technologies | L3224 | |
| 抗-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |
| 胶原蛋白包被的玻璃底培养皿 | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |
| 显微操作加样器 | Fisher | E5242956003 | |
| Alexa 555 葡聚糖 | Life Technologies | D34679 | |
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |
表1. 特定试剂与设备清单及来源。本方案中所使用的特定设备和试剂，包括公司名称和货号，均已列出。 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| 缓冲液 | 成分 | 步骤使用 | |
| 裂解/洗涤 | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM 咪唑，pH 8.0 | 1.4 | |
| Tris/盐 | 50 mM Tris，pH 8.0 300 mM NaCl | 1.7 | |
| 洗脱缓冲液 | 50 mM Tris，pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑 | 1.8 | |
| 红细胞检测缓冲液 | 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES，pH 7.4 | 2.1 | |
| 缓冲液 R/B | RPMI 细胞培养基 2 mM CaCl2 0.5% BSA | 3.1 |
表2. 本方案中所用缓冲液列表。列出了所使用的缓冲液、其组成成分以及在本方案中首次使用的步骤。
参考文献
- Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
- Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
- Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
- MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
- Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
- Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
- Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
- Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
- Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
- Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
