本文描述了从重组大肠杆菌（E. coli）中纯化胆固醇结合毒素链球菌溶素O的方法，以及该毒素与活体真核细胞结合的可视化技术。局部递送毒素可诱导靶向细胞发生快速而复杂的改变，揭示了毒素生物学的新特征。
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本文内容
摘要
摘要
细菌毒素与细胞膜中的胆固醇结合，形成孔道，导致细胞内容物泄漏以及胞外物质内流。细胞可能通过主动的膜修复过程从这种损伤中恢复，也可能死亡，具体结果取决于毒素暴露量和细胞类型1。此外，这些毒素通过激活免疫细胞（包括巨噬细胞）在感染宿主中引发强烈的炎症反应，巨噬细胞会释放多种促炎性细胞因子2。许多革兰氏阳性菌可产生结合胆固醇的毒素，已被证实可通过尚不明确的机制增强其毒力。
细胞暴露于这些毒素后，其质膜会发生形态学改变，包括被隔离到富含胆固醇的细胞表面突起中，这些突起可被释放到细胞外空间，提示存在一种内在的细胞防御机制3,4。该过程在无代谢活性的情况下即可发生于所有细胞，可通过化学固定后的电镜观察进行可视化4。在响应毒素暴露而介导炎症反应的免疫细胞（如巨噬细胞）中，诱导产生的膜性小泡可能含有IL-1家族的细胞因子，或同时参与毒素的清除以及这些促炎性细胞因子的扩散5,6,7。已有研究提示IL-1β的释放与一种特定类型的细胞死亡（称为焦亡）之间存在关联，因为二者均为依赖caspase-1的过程8。为了阐明巨噬细胞这一复杂反应（包括毒素结合、膜性小泡脱落、细胞因子释放以及潜在的细胞死亡）的机制，我们开发了标记技术及荧光显微镜方法，可实现对毒素与细胞相互作用的实时可视化观察，包括细胞功能障碍和死亡的检测（图1）。由于其他技术存在局限性，活细胞成像的使用尤为必要。生化方法无法解析单个细胞内的效应，而流式细胞术则不能提供对单个细胞的高分辨率、实时可视化观察。本文所述方法亦可用于分析其他刺激物诱导的、涉及复杂细胞表型变化的动态响应过程。
方案
1. 链球菌溶素O（SLO）的纯化
- 将含有 pBADgIII-SLOhis 质粒9 的 BL21 GOLD 细菌的 20 ml 过夜培养物接种至 0.5 L LB 液体培养基中，并加入 500 μl 50 mg/ml 氨苄青霉素。在 37 °C、225 rpm 条件下振荡培养，直至 OD600 = 0.6（通常约 1.5 小时）。取 1 ml 细菌（记为 T0）在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟，将沉淀溶解于 140 μl 1× SDS 样品缓冲液/1 OD 中，并进行超声处理以剪切 DNA，用于蛋白质纯度分析。
- 向培养物中加入 5 ml 20% 阿拉伯糖以诱导表达，在室温下以 225 rpm 振荡培养 3 小时。收集 1 ml 细菌，离心后按上述方法溶解于 1× SDS 样品缓冲液中，作为 T3 时间点样品用于纯度分析。
- 将剩余细菌收集至 500 ml 离心瓶中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 12 分钟（Sorvall GS-3 转子，8,500 rpm）。弃去上清液，如需可将沉淀在 -80 °C 保存过夜或更长时间。
- 将冷冻的沉淀在冰上用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）重悬，并加入 400 μl 2....
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结果
通常，当蛋白浓度为 4 mg/ml 时，可获得 107-108 U/ml 的 SLO。不同细胞类型裂解所需的毒素量有所不同，但通常为 125–500 U/ml SLO（图 2B）。某些细胞类型（如巨噬细胞）可能更具抗性（4000 U/ml），而其他细胞（尤其是 T 细胞系）则更为敏感。这些敏感性与市售 SLO 的活性一致。每次冻融后，毒素活性大约下降 2 倍，因此需要对每批或每次解冻的毒素进行溶血活性检测，以确认其活性。此外，在缺乏含胆固醇膜的情况下，该毒素对热和氧化极为敏感10，因此操作该蛋白时需格外小心。
通过微递送毒素，可以在同一培养皿中比较未处理细胞与毒素处理细胞的情况。同时，由于从微移液管尖端会形成扩散梯度，该方法也为毒素活性提供了内部对照。靠近微移液管尖端的区域将出现细胞死亡，表现为钙黄素信号丢失和乙啶同二聚体摄取，而远离尖端的区域则无损伤表现（图3）。鉴于所用毒素的强效性，即使在施加反向压力的情况下，微移液管尖端渗漏的微量毒素也可能在移.......
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讨论
本文所述技术可用于检测免疫细胞对细菌毒素的反应。其中最关键的步骤是毒素的处理与给药。由于毒素性质脆弱，即使同一制备样品的不同等分试样之间，其活性也可能存在极大差异。因此，必须对每份毒素等分试样使用参考细胞系或红细胞进行活性测试，或采用毒素浓度梯度法。通过微量移液器施加的毒素浓度梯度可在实时观察中呈现毒素诱导的全部生物学效应，但该方法不适用于生化分析。
微量移液器递送毒素可能具有挑战性。然而，与标准的显微注射不同，本实验无需刺入细胞内部。事实上，必须注意避免针头本身损伤细胞，因为这会引发类似的膜修复反应12。特别是在免疫细胞中，针头接触所产生的钙信号会通过纳米管在培养物中的其他细胞间传播11。不刺入细胞还可延长针头的使用寿命。同样，使用伯特兰透镜（Bertrand lens）观察针头下降至细胞的过程，可减少微量移液器定位的不确定性。尽管受损的针头比完好的针头释放毒素更快，但仍可用于生成初步结果。微注射系统允许多次注射，以便获得更高的毒素梯度。或者，也可通过调整注射持续时间来改变递送剂量。该微注射系统还允许在同一培养皿内进行多个实验。此外，.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Richard Rest 慷慨提供炭疽溶素 O，感谢 Michael Caparon 慷慨提供 SLO 质粒，以及感谢 Jonathon Franks 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 T32CA82084（PAK）和 R01AI072083（RDS）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | |
| 多粘菌素-琼脂糖 | Sigma | P1411-5ML | |
| Zeba脱盐离心柱 | Fisher | PI-89891 | |
| 绵羊红细胞 | Fisher | 50-415-688 | |
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | 参见参考文献9 |
| Cy5单反应性染料 | GE Healthcare | PA25001 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |
| 钙黄绿素 AM / 碘化丙啶均聚物 | Life Technologies | L3224 | |
| 抗-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |
| 胶原蛋白包被的玻璃底培养皿 | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |
| 显微操作加样器 | Fisher | E5242956003 | |
| Alexa 555 葡聚糖 | Life Technologies | D34679 | |
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |
表1. 特定试剂与设备清单及来源。本方案中所使用的特定设备和试剂，包括公司名称和货号，均已列出。 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| 缓冲液 | 成分 | 步骤使用 | |
| 裂解/洗涤 | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM 咪唑，pH 8.0 | 1.4 | |
| Tris/盐 | 50 mM Tris，pH 8.0 300 mM NaCl | 1.7 | |
| 洗脱缓冲液 | 50 mM Tris，pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑 | 1.8 | |
| 红细胞检测缓冲液 | 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES，pH 7.4 | 2.1 | |
| 缓冲液 R/B | RPMI 细胞培养基 2 mM CaCl2 0.5% BSA | 3.1 |
表2. 本方案中所用缓冲液列表。列出了所使用的缓冲液、其组成成分以及在本方案中首次使用的步骤。
参考文献
- Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium....
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重印与许可
