软骨细胞合成软骨细胞外基质的过程可受到机械刺激的影响。本方法描述了对包埋于三维结构中的软骨细胞施加动态压缩应变的技术，以及评估软骨细胞代谢变化的方法。
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本文内容
摘要
摘要
关节软骨在受到机械性损伤或因骨关节炎等疾病发生退变时，其自我修复能力十分有限。为弥补这一缺陷，目前已开发出多种医学干预手段。其中一种方法是利用组织工程软骨对受损区域进行表面重建；然而，工程化组织通常缺乏天然软骨所具有的生化特性和耐久性，因而其长期存活性受到质疑。这使得组织工程软骨的应用局限于小范围局灶性缺损的修复，依赖周围正常组织对植入材料提供保护。为改善所构建组织的性能，机械刺激是一种常用手段，可促进软骨样细胞外基质的合成，并提升工程化组织的力学性能。机械刺激向组织构建物施加的力，类似于软骨在生理条件下所承受的力 体内这基于以下前提：机械环境在一定程度上调控着天然组织的发育与维持1,2在软骨组织工程中，最常用的机械刺激形式是在1 Hz频率下施加约5-20%生理应变的动态压缩1,3多项研究已探讨了动态压缩的影响，表明其对软骨细胞的代谢和生物合成具有积极影响，最终影响所形成组织的功能特性4-8本文阐述了对软骨细胞-琼脂糖水凝胶构建物施加动态压缩以进行机械刺激的方法，并通过生物化学和放射性同位素测定分析其生物合成变化。该方法亦可便捷地修改，用于评估机械刺激所可能引发的细胞反应的任何变化。
方案
1. 原代关节软骨细胞的分离
从动物关节的关节面获取10–15片全层软骨组织切片（例如 来自当地屠宰场的骨骼成熟奶牛的掌指关节。
- 将软骨切片置于100 mm培养皿中，加入20 ml含0.5%蛋白酶（w/v）的Ham's F-12培养基，37 °C孵育2小时。用Ham's F-12培养基冲洗三次，再加入20 ml含0.15%胶原酶A的Ham's F-12培养基，37 °C过夜孵育。
- 将细胞悬液通过200目筛网过滤至洁净培养皿中。用5 ml Ham's F-12培养基冲洗滤网，并将冲洗液加入培养皿。将细胞悬液转移至50 ml锥形管中。用10 ml Ham's F-12培养基冲洗培养皿，并将冲洗液加入锥形管。
- 室温下以600–800 rcf离心6–8分钟。
- 吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用40 ml Ham's F-12培养基重悬细胞沉淀。
- 以600–800 rcf离心6–8分钟。
- 重复步骤1.4和1.5，共进行三次。第三次离心前，通过振荡重悬细胞沉淀，并取500 μl样品用于细胞计数。
- 使用台盼蓝排斥法9，在血细胞计数板和倒置光学显微镜下计数活细胞。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于一定体积的Ham's F-12培养基中，使细胞密度为所需接种密度的两倍（例如，包封前细胞浓度为20 × 106 cells/ml，以获得包封后10 × 106 cells/ml的终浓度）。
2. 软骨细胞-琼脂糖水凝胶包埋
- 将0.8 g经高压灭菌的VII型琼脂糖加入20 ml无菌1×PBS（pH 7.4）中，在设定为120 °C的加热板上加热至完全溶解。溶解后，将温度降至60 °C，因更高温度会影响细胞活力。
- 在50 ml锥形管中，将细胞悬液与浓度为所需终浓度两倍的琼脂糖溶液等体积充分混合（e.g. 为获得终浓度2%的琼脂糖水凝胶，使用4%琼脂糖悬液）。避免产生大气泡，因其可能影响细胞活力及构建物的疲劳寿命。
- 小心地将10 ml软骨细胞-琼脂糖混合液分装至直径60 mm的培养皿中，注意避免产生大气泡。
- 室温下静置30分钟，直至凝胶形成。
- 使用4 mm活检打孔器，制备所需数量的软骨细胞-琼脂糖水凝胶样品（通常为20–30个）。
- 使用千分尺测量并记录代表性样品的物理尺寸（直径和高度）。构建物高度应约为5 mm，剔除高度变异超过2%区域所获得的样品。
- 将样品转移至新的60 mm培养皿中，并加入10 ml完全培养基（e.g. 含20%胎牛血清、20 mM HEPES、100 μg/ml抗坏血酸及2×抗生素/抗真菌剂的Ham's F-12培养基）。
3. 软骨细胞-琼脂糖水凝胶的机械刺激与放射性标记
- 将压缩装置的金属部件进行高压灭菌。用70%乙醇（过夜）和紫外光（至少15分钟）对塑料部件进行消毒。
- 为防止构建物倾倒，使用镊子将12个无菌塑料固定环（内径大于构建物直径）（n=6，样品组和对照组）放入24孔培养板的孔中。
- 使用镊子小心地将软骨细胞-琼脂糖水凝胶从培养皿转移至24孔板中，并将其固定在每个固定环内。
- 向每个样品孔中加入400 μl完全培养基（例如，含20%胎牛血清的Ham's F-12培养基，添加20 mM HEPES、100 μg/ml抗坏血酸以及2倍抗生素/抗真菌剂）。
- 组装已灭菌的压缩装置（图1），并用紧定螺钉固定压头。将压缩装置连接到24孔培养板上。
- 松开并重新拧紧紧定螺钉，以确保压头与水凝胶接触（零应变状态）。
- 将组装好的压缩装置装入Mach-1微力学测试系统。通过定位销将装置固定在垂直平台上，并用紧定螺钉锁紧。移除间距夹具。
- 施加所需幅度（例如，基于样品原始高度的10%应变幅度）、频率（例如，1 Hz）和持续时间或循环次数（例如，最长60分钟的时间间隔）的动态压缩载荷。
- 机械刺激完成后，重新安装间距夹具，松开定位销的紧定螺钉，并将压缩装置和培养板从Mach-1微力学测试系统中取出。
- 通过在培养基中添加5 μCi所需同位素（例如，[3H]-脯氨酸蛋白标记用于软骨细胞特异性胶原合成，[35S]-硫用于蛋白聚糖合成）对细胞-水凝胶构建物进行放射性标记。
- 将放射性标记的构建物在37 °C、5% CO210条件下孵育24小时。
- 收集放射性标记的水凝胶构建物，并用1×PBS（pH 7.4）冲洗3次，以去除未掺入的同位素。使用木瓜蛋白酶（40 μg/ml溶于20 mM醋酸铵、1 mM乙二胺四乙酸和2 mM二硫苏糖醇，65 °C下消化72小时）对样品进行消化。
- 木瓜蛋白酶消化后立即采用PicoGreen染料法检测DNA含量11，并通过β-液体闪烁计数法12,13测定掺入的同位素活性，并归一化至DNA含量。
注意：放射性物质（包括废弃的同位素以及可能接触过放射性物质的物品）的采购和处置必须遵循相关机构（和/或政府）关于放射性物质安全操作与处置的政策和程序。
4. 代表性结果
将牛关节软骨细胞-琼脂糖水凝胶构建物（含 10 × 106 个细胞/ml 的 2% 琼脂糖）在 10% 压缩应变幅度和 1 Hz 频率下进行机械刺激，持续 20 至 60 分钟（或 1,200 至 3,600 个循环），并通过放射性同位素掺入法检测其 DNA 含量和细胞外基质合成情况。DNA 和细胞外基质的合成呈剂量依赖性变化。刺激 20 或 30 分钟后，DNA 含量显著降低 35%（p<0.01）；而刺激 60 分钟则未观察到显著影响（图 2）。通过 [3H]-脯氨酸和 [35S]-硫酸盐掺入法分别测定的软骨特异性胶原和蛋白聚糖合成，在刺激 20 或 30 分钟后显著增加约 60%（p<0.01），而刺激 60 分钟则未见明显效应（图 3）。
图1. 自制动态压缩装置的示意图，用于刺激软骨细胞-琼脂糖构建物。左图：组装好的装置。右图：爆炸图，显示各个组件。
图 2. 软骨细胞-琼脂糖水凝胶在 1 Hz 频率、10% 压缩应变振幅下机械刺激 20 至 60 分钟后 DNA 含量的变化（均值 ± 标准误，n=6/组）。
图 3. 软骨细胞-琼脂糖水凝胶在 1 Hz 频率、10% 压缩应变幅度下机械刺激 20 至 60 分钟后，细胞外基质合成（胶原蛋白和蛋白聚糖）的变化（均值 ± 标准误，n=6/组）。
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讨论
所述将受控机械刺激施加于接种细胞的琼脂糖水凝胶的方法，可直接研究动态压缩力对软骨细胞代谢的影响。通过使用定制测试装置并配合限位环，可对构建物提供侧向约束，避免样品倾斜等潜在问题。采用由螺钉固定的重力加载压头，可确保与构建物保持直接接触，即使样品高度存在差异亦能实现。在刺激后进行放射性标记以测量细胞生物合成，可降低污染风险，从而允许单个测试装置用于多次动态机械刺激的应用。该方法可轻松调整，用于研究不同机械加载模式（例如 剪切1,4、拉伸1,2）的影响，或阐明特定的力传导通路。
代表性结果表明，由于施加动态刺激，可能会发生约 35% 的少量细胞死亡，而较长时间的机械刺激则不影响构建物的细胞数量15-17。通过放射性同位素掺入法测定的细胞外基质大分子的生物合成显示，其对动态压缩具有持续时间依赖性的响应。施加 20 至 30 分钟的动态压缩负荷可产生最大的合成代谢反应，而更长的持续时间似乎会引起细胞对施加的机械刺激产生脱敏效应。此前已有报道指出细胞对机械负荷存在脱敏现象1,2,5,13
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ham's F-12 | 赛默飞世尔科技公司 | SH3001002 | |
| 胶原酶A | 西格玛奥德里奇有限公司 | C0130 | |
| 蛋白酶 | 西格玛奥德里奇有限公司 | P5147 | |
| 胎牛血清 | 西格玛奥德里奇有限公司 | F1051 | |
| 抗坏血酸 | 西格玛奥德里奇有限公司 | A4034 | |
| 抗生素/抗真菌剂 | 西格玛奥德里奇有限公司 | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| 台盼蓝 | 西格玛奥德里奇有限公司 | 93595 | |
| Reichert Bright-Line 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | 英吉特公司 | P7589 | |
| 木瓜乳胶来源的木瓜蛋白酶 | 西格玛奥德里奇有限公司 | P3125 | |
| 乙酸铵 | 西格玛奥德里奇有限公司 | A1542 | |
| 乙二胺四乙酸 | 西格玛奥德里奇有限公司 | E9884 | |
| 二硫苏糖醇 | 西格玛奥德里奇有限公司 | 43819 | |
| 低熔点琼脂糖，VII型 | 西格玛奥德里奇有限公司 | A9045 | |
| 筛网滤器（200目） | 西格玛奥德里奇有限公司 | S4145 | |
| Mach-1 微型力学测试仪 | Biomomentum 公司 | V500cs | |
| 压缩加载夹具 | 定制 | 类似产品可由 Biomomentum 公司提供 | |
| Falcon 24孔培养板 | 赛默飞世尔科技公司 | B353047 | |
| β-液体闪烁计数器 | 贝克曼库尔特公司 | LS6500 | |
| [3H] 脯氨酸 | 珀金埃尔默公司 | NET323005MC | |
| [35S] 硫 | 珀金埃尔默公司 | NEX041005MC |
参考文献
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