组织抗原提取用于功能分析

摘要

一种用于制备人组织提取物的简单方案被描述，该提取物可作为功能性T细胞检测中抗原的来源。该方法可用于检测T细胞对组织来源抗原的反应。 体外.

摘要

许多适应性免疫应答中由B细胞和T细胞识别的抗原靶点尚未被明确¹。这一情况在自身免疫性疾病和癌症中尤为突出²。我们的目标是研究人类T细胞在1型糖尿病这一自身免疫性疾病中所识别的抗原^1,3,4,5。为了分析人类T细胞对那些尚未明确T细胞识别抗原的组织所产生的免疫应答，我们开发了一种从人体组织中提取蛋白质抗原的方法，所获得的抗原形式可直接用于功能性检测⁶。以往，由于提取方法所得裂解物中含有对人外周血单个核细胞具有毒性的去垢剂，因此无法检测T细胞对未纯化组织提取物的应答。本文描述了一种提取人体组织蛋白的方法，所得产物对人T细胞无毒性。该方法将组织在正丁醇、乙腈和水（BAW）的混合液中进行匀浆。测定组织提取物中的蛋白质浓度后，将已知质量的蛋白质分装至各管中。提取后，通过冷冻干燥去除有机溶剂。冻干后的组织提取物可长期保存，待需要时使用。在免疫功能检测中，可将免疫细胞悬液直接加入冻干提取物中，使用适当培养基进行培养。采用本方法制备的提取物，可轻松检测外周血单个核细胞的细胞因子产生和增殖反应。因此，本方法可快速制备适用于T细胞应答分析中抗原来源的人体组织裂解物。我们建议，该方法将有助于在器官移植、癌症和自身免疫等研究中分析适应性免疫应答对组织的识别。

方案

1. 脾脏组织的制备

1. 注意——所有人体组织均应视为具有潜在传染性，所有操作均须在II级生物安全柜中进行。使用无菌剪刀和镊子去除脾脏组织块（约1-2 cm大小）中的脂肪和纤维组织，并尽可能剪除外层的被膜组织。
2. 剪取一小段（1-2 cm）³脾组织的组织块，并将每块放入无菌的50 ml Falcon管中。
3. 将组织块浸入液氮中进行速冻₂.
4. -20°C 保存80 °C类似的方案适用于其他组织。

2. 准备人胰岛用于储存

1. 在CMRL培养基中培养胰岛。将胰岛收集至10 ml锥底试管中，用PBS洗涤两次，每次以1,500 rpm离心5分钟。倒去PBS，并将倒置的试管短暂置于纸巾上以吸除残留缓冲液。注意避免胰岛脱落。
2. 吸除残留液体后，重新盖紧试管，于液氮中速冻，随后在-80 °C保存。

3. 准备提取物

1. 配制 BAW 混合液（10:30:60 %v/v），并于 4 °C 保存。
2. 从 -80 °C 取出试管，在室温下解冻。
3. 加入足量的预冷 BAW 溶液以浸没组织样本。对于胰岛组织，使用 3–5 ml；对于脾脏组织，根据组织块大小使用 10–20 ml。
4. 组装组织....

讨论

本方案的开发旨在制备不含去垢剂等有毒化学物质的人体组织提取物。具体而言，我们已应用该方法制备可用于人体免疫功能检测的人体组织提取物。 体外采用本方案制备的提取物可用任意缓冲液重新溶解，并适用于多种生物化学分析，如蛋白质印迹或液相色谱。这使得该技术可广泛应用于多种后续实验。

采用我们的方案，对组织提取物的反应较弱。这是预料之中的，因为我们正在寻找针对“自身”抗原的反应；在本研究中，针对胰岛抗原的T细胞反应通常较弱¹。此前我们发现，使用基于CFSE的增殖实验可检测到人CD4⁺ T细胞对重组前胰岛素和谷氨酸脱羧酶（GAD）的反应，这两种抗原是1型糖尿病的自身抗原^7,8。我们选择使用组织提取物，以避免使用合成肽⁹和重组蛋白¹⁰时可能遇到的问题。

我们通常不在提取过程中添加蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的存在可能会抑制抗原的加工和提呈¹¹，从而抑制T细胞反应。相反，我们会在冰上进行提取，以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 ml 12 x 75 mm 无菌聚苯乙烯管	BD Falcon	352054
聚苯乙烯管盖（上图）	BD Falcon	352032
50 ml 无菌管	Becton Dickinson	352070
乙腈	马林克罗特化学公司	2856-10
正丁醇	Sigma Aldrich	537993-IL
均质器：PRO200	生物策略	01-01200	10 x 115 毫米锯齿形发生器
冻干机			Virtis，台式 4K
无菌针头 18-20 号	Becton Dickinson	REF 302032
CMRL-1066培养基	Sigma	C0422
PBS	Sigma	D8537
<强>表1. 特定试剂与设备