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方法文章

粒细胞依赖性自身抗体诱导的皮肤水疱形成

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DOI：

10.3791/4250

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2012年10月12日

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Freiburg , 2Kepler High School Freiburg, 3Centre for Biological Signalling Studies (BIOSS), University of Freiburg

本文内容

摘要

在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白一段200个氨基酸（aa 757-967）区域的纯化IgG抗体反复注射到小鼠体内，可复制出水疱表型以及组织学和免疫病理学特征，这些特征与人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）的特征相似1。

摘要

自身免疫现象可发生于健康个体，但当自身耐受失效时，自身免疫反应可能导致特定病理改变。根据Witebsky准则，将疾病诊断为自身免疫性疾病的依据之一，是通过被动转移自身抗体在实验动物中复制出该疾病。对于获得性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa acquisita, EBA）——一种典型的累及皮肤和黏膜的器官特异性自身免疫病——近年来已建立多种实验模型。在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白第757至967位氨基酸（200个氨基酸片段）的纯化IgG抗体反复注射入小鼠体内，可复制出与人类EBA相似的大疱表型以及组织病理学和免疫病理学特征。 1全面发作的广泛性病变通常在首次注射后5-6天出现，疾病严重程度与给予的VII型胶原特异性IgG剂量相关。实验性获得性大疱性表皮松解症（EBA）中的组织损伤（水疱形成）依赖于组织结合的自身抗体对粒细胞的募集和激活 2,-4因此，该模型可用于解析粒细胞依赖性炎症通路在自身免疫性组织损伤中的作用，因为该模型仅重现了效应性自身免疫反应中T细胞非依赖的阶段。此外，多项研究证实了自身抗体具有诱导水疱形成的能力，进一步凸显了该模型的价值。 体内 并研究EBA中水疱形成的机制 1,3,-6最后，该模型将极大地促进针对自身抗体介导疾病的新抗炎疗法的开发。总体而言，大疱性类天疱疮（EBA）的被动转移动物模型是一种易于建立且具有教学意义的疾病模型，不仅有助于研究人员分析EBA的发病机制，还将帮助回答生物学和临床免疫学中一系列基础而关键的自身免疫问题。

方案

1. 致病性抗体的制备

注意：抗体的纯化和浓缩应在同一天内完成，因为抗体不能在0.1 M甘氨酸pH 2.5-3（洗脱缓冲液）中过夜（ON）保存。

IgG 的亲和纯化：使用 25 ml 免疫兔血清：

  1. 在4 °C条件下过夜解冻兔血清，按1:1比例加入1×PBS（运行缓冲液），在20 °C下以1260 × g离心10分钟。若血清含脂肪较多，离心后可选择使用滤纸进行过滤。
  2. 同时，用10倍柱床体积（柱床体积 = 填料体积）的1×PBS（运行缓冲液）清洗蛋白G填料柱。
  3. 将稀释并过滤后的血清上样至柱中，在室温（RT）下于摇床上孵育1小时。
  4. 用50 ml Falcon管收集穿流液（FT）。在确定纯化后的IgG浓度和效价之前，请勿丢弃该穿流液。
  5. 用5倍柱床体积的1×PBS洗涤填料，同时准备50 ml Falcon管用于收集洗脱的IgG组分。每管中加入1 ml pH中和缓冲液：1 M TRIS，pH 10（或按洗脱液体积的1:20比例加入TRIS缓冲液）。
  6. 向柱中加入100–150 ml洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.5–3，收集50 ml洗脱组分。将收集管翻转混匀2–3次，测定pH值，并加入中和缓冲液调节至pH 7.2–7.4。
  7. 取少量IgG洗脱液，以洗脱缓冲液作为空白对照，在280 nm处测定OD值。若OD值<0.1，则停止收集。
  8. 按照生产商说明书对蛋白G填料进行再生并储存。

使用 Amicon 管进行超滤浓缩：

  1. 用 1×PBS 清洗 Amicon Ultra（15 ml /30KDa）超滤管，在 4 °C 条件下以 3,220 × g 离心 15–20 分钟。弃去 Amicon 中的穿滤液（FT）。
  2. 将洗脱的 IgG 组分加至 Amicon 中，体积为 15 ml，在 4 °C 条件下以 3,220 × g 离心 25–30 分钟；离心时间需根据洗脱液中的蛋白含量进行调整。
  3. 弃去穿滤液（FT），重复超滤操作，直至无洗脱组分残留。
  4. 用 1×PBS 对浓缩后的 IgG 进行充分洗涤，共洗涤两次，每次离心 25–30 分钟。
  5. 从 Amicon 滤器中收集呈“黏稠状”的黄褐色抗体溶液，最终体积为 1,500–2,000 μl 的 1×PBS 溶液。
  6. 使用分光光度计或 NanoDrop 测定 IgG 制品的浓度：
    浓度（mg/ml）= A(280 nm) × 稀释倍数 /1.4
  7. 按照生产商的说明对 Amicon 进行清洗并储存。

2. 将Ⅶ型胶原特异性IgG注射入小鼠

在开始实际的实验操作之前，确保已撰写好实验方案，并准备好实验所需的所有材料。

  1. 准备用于疾病评分、ELISA、免疫荧光（IF）分析和髓过氧化物酶（MPO）检测的数据记录表4。
  2. 标记用于血液和器官、冷冻模具以及组织学处理和包埋盒的管子。
  3. 抗体溶液应新鲜配制或从库存中解冻，并通过反应性（通过免疫荧光显微镜和/或ELISA测定的滴度）进行表征。无菌过滤后的抗体溶液应使用PBS稀释，使注射所需剂量在250–1000 μl之间。确保有足够的IgG以完成整个实验。
  4. 新鲜配制抗凝剂：肝素20 U/ml，以及用于麻醉的8.7 mg/ml氯胺酮和1.3 mg/ml赛拉嗪混合液。在处死小鼠时，准备好标记好的含有3.7%甲醛的试管。
  5. 对手术器械（手术刀、剪刀、细头镊子和弯头镊子）进行灭菌，并准备注射器（胰岛素注射器、1 ml和2 ml注射器）、针头、数码相机及备用存储卡。

注意：所有操作均需在经氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷麻醉的小鼠上进行。异氟烷是日常皮肤检查的首选麻醉方式，因为小鼠恢复迅速。但在拍照时，通常需皮下注射 87 mg/kg 氯胺酮和 13 mg/kg 赛拉嗪。实施安乐死时，氯胺酮/赛拉嗪的剂量应增加至 130 mg/kg 氯胺酮和 20 mg/kg 赛拉嗪。

  1. 检查已标记动物的一般健康状况、皮肤和毛发外观，称量其体重并测量耳厚度（始终使用同一只耳朵）。
  2. 在临床评估表中记录观察到的数值和变化。
  3. 用含有等体积抗凝剂的注射器从尾静脉采集 20–30 μl（2–3 滴）血液。
  4. 使用 80% 乙醇对毛发和皮肤进行消毒。
  5. 使用胰岛素注射器将抗体溶液皮下注射至背部。（对于某些部位（例如，耳朵），仅可注射小体积（10–50 μl）溶液。）

应每两天重复注射一次，共注射4次。体重约为20 g的Balb/c和C57BL6小鼠在首次注射400-500至750 μg/g体重剂量的自身抗体后3-4天开始出现疾病症状。

完成实验时：

  1. 通过皮下注射130 mg/kg和20 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪，使小鼠进入深度麻醉状态，从后腔静脉放血并取出心脏。
  2. 采集皮肤、尾部、耳部、血液和食管等器官/组织样本，并放入预先标记并装有PBS或3.7%甲醛的试管中。

返回实验室后：

  1. 在室温下以 1,200 × g 离心血液 10 分钟，分离血浆，将血浆转移至正确标记的试管中，并按规定储存。
  2. 使用冷冻模具将皮肤活检组织包埋于最佳切割温度介质（Optimal Cut Temperature medium）中，正确标记后于 -80 °C 保存。
  3. 将用于组织学检查的组织样本置于标记好的包埋模具中，用 3.7% 甲醛固定，直至进行石蜡包埋。

3. 疾病严重程度的临床评估

应每天检查小鼠皮肤和黏膜的病变，并使用适当的表格记录检查结果。早期安乐死的标准是皮肤病变面积超过体表面积的20%，以及连续三天体重下降达到总体重的5-10%，上述情况对应的疾病评分为5（表1）。

  1. 将小鼠置于腹部位置。从头部区域开始检查，先检查右耳，观察内侧和外侧是否存在水疱、糜烂或结痂。以相同方式继续检查左耳。
  2. 检查左右眼是否存在红斑、脱毛、糜烂和/或结痂等表现。
  3. 接下来梳理前额和吻部区域，继续检查吻部腹侧、嘴唇以及口腔黏膜。
  4. 从右前肢的足垫开始向上检查；随后切换至左前肢。以相同方法检查右后肢和左后肢。
  5. 使用弯头精细镊子梳理颈部和背部区域的毛发。
  6. 将小鼠翻转至仰卧位，以同样方法检查腹部以及四肢的腹侧区域。
  7. 检查尾巴。
  8. 对小鼠出现病变的相关身体部位拍照。需特别注意照片的质量和数量。
  9. 计算临床疾病评分。

4. 皮肤和血浆样本的分析

  1. 根据计划准备、储存和/或处理所有采集的组织。
  2. 切取冷冻组织切片，用于检测兔抗体和小鼠补体系统组分的免疫荧光（IF）分析。
  3. 分析冷冻组织和/或器官提取物中不同蛋白质和酶的含量（MPO 检测）。
  4. 对石蜡包埋的组织进行切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色，以观察组织损伤程度。
  5. 通过 ELISA 和免疫印迹法（immunoblot）分析血浆。

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结果

抗原特异性抗体的被动转移可在小鼠中引发完全型疾病，在临床表现、组织学及免疫病理学水平上均类似于人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）。小鼠的耳朵、鼻吻部、足部、腿部、背部及眼周会出现水疱、结痂、糜烂和脱发。疾病的首发临床症状最常出现在耳朵和/或头部区域。通过直接免疫荧光法在病变周围皮肤冷冻切片的真皮-表皮交界处可检测到特异性兔IgG和小鼠补体C3的沉积。组织学检查可见病变皮肤存在表皮下水疱及炎性细胞浸润。

然而，如果停止注射致病性的VII型胶原特异性抗体，疾病活动会逐渐减弱，并在数周内病变愈合。尽管如此，一定程度的炎症后瘢痕性脱发可能会无限期持续存在。

重组自身抗原（及致病性 IgG）的表征

小鼠胶原特异性 IgG 结合于真皮-表皮连接处（图 2B）。通过免疫印迹评估其特异性（图 2C，泳道 3、4 和 7）。

评估疾病活动度

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讨论

将自身抗体被动转移至实验动物是证明其致病性的主要方法7, -12。通过该方法获得的动物模型，除了可作为自身免疫的间接证据13外，还可用于研究致病机制的效应阶段。抗体诱导中性粒细胞依赖性皮肤水疱形成的获得性大疱性表皮松解症（EBA）被动转移模型，已被用于解析自身免疫性皮肤病中的组织损伤机制。该模型还成为一种极具教学意义的疾病模型，可用于研究抗体介导的器官特异性自身免疫病中若干基础性、生物学及临床关键问题，其意义远超针对Ⅶ型胶原自身免疫的范畴。最后，该模型也可用于研究包括基底膜生物学、免疫复合物对粒细胞的激活以及补体激活在内的基本生物学与病理生理学过程。

尽管已有多种实验条件可用于研究自身免疫性皮肤疾病EBA，包括ex vivo模型和动物模型14，但迄今为止最适合研究粒细胞依赖性炎症通路的方法是将自身抗体被动转移至动物体内。与ex vivo模型相比，在后者中需将粒细胞添加至预先与自身抗体孵育的皮肤切片中15，而在此动物模型中，小鼠可自发重现白细胞的浸润过程。此外，...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢来自德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1）以及弗莱堡大学医学院BIOSS项目的资助（资助对象：CS）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
重组抗原 编码小鼠VII型胶原重组形式的质粒可向通讯作者索取。
免疫兔血清www.eurogentec.com我们使用200 μg抗原对新西兰白兔进行免疫，每两周一次，共三次。此项工作由比利时Eurogentec S.A.公司提供服务完成。
Protein G 琼脂糖Roche Applied Science11243233001
Balb/c 小鼠Charles River Laboratories
OCT包埋剂，Tissue-TekSakura Finetek4583OCT，最佳切削温度
标准冷冻模具Sakura Finetek455725 mm × 20 mm × 5 mm
中号冷冻模具Sakura Finetek456615 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link组织包埋盒R. Langenbrinck09-0503组织学处理与包埋用包埋盒
专用纹身墨水黑色H. Hauptner und Richard Herberholz GmbH & Co. KG71492000纹身糊
纹身钳 TZ1EBECO E. Becker & Co GmbH纹身装置
肝素Carl Roth GmbH & Co.7692.1
甲醛 37%Carl Roth GmbH & Co.7386
盐酸氯胺酮Sigma-Aldrich Chemie GmbHK2753-1G
盐酸赛拉嗪Sigma-Aldrich Chemie GmbHX1251-1G
无菌PBSBiochromL182-50
数码相机NikonCoolpix 5400
注射器驱动式滤器单元 0.45 μmMillipore
卡尺 Mitutoyo 73091667338Farnell（经销商）
疾病评分表附示例

参考文献

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