本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。
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摘要
摘要
双链断裂（DSBs）是细胞可能遇到的最具危害性的DNA损伤。如果未被修复，DSBs极有可能导致突变和染色体畸变1。为了防止这种损伤引发基因组不稳定，细胞必须能够识别DSBs、激活DNA损伤反应（DDR），并修复受损DNA。当DDR被激活后，会通过触发细胞周期阻滞以允许修复发生，或促使细胞进入凋亡，从而维持基因组的完整性。DSB修复的主要机制包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HRR）（详见文献2）。DDR的正常功能依赖于多种蛋白质活动的精确协调。本文中，我们描述了一种用于对其中一种蛋白质53BP1进行二维和三维（D）可视化的方法。
p53结合蛋白1（53BP1）通过结合修饰后的组蛋白，定位于DNA双链断裂（DSB）区域3,4，并在5-15分钟内形成焦点结构5。组蛋白的修饰以及53BP1和其他DNA损伤应答（DDR）蛋白在DSB位点的募集，被认为有助于损伤区域周围染色质的结构重排，并参与DNA修复过程6。除了直接参与修复外，53BP1在DDR中还具有其他功能，例如调控S期内的检查点、G2/M期检查点，以及激活下游DDR蛋白7-9。最近研究发现，53BP1在有丝分裂期间由DNA损伤诱导时并不会形成焦点，而是等待细胞进入G1期后才定位于DSB附近6。此外，已发现包括53BP1在内的DDR蛋白在有丝分裂进程中会与有丝分裂结构（如动粒）相关联10。
在本实验方案中，我们描述了利用二维和三维活细胞成像技术，观察在DNA损伤剂喜树碱（CPT）作用下53BP1焦点的形成，以及53BP1在有丝分裂期间的行为。喜树碱是一种拓扑异构酶I抑制剂，主要在DNA复制过程中引发双链断裂（DSBs）。为实现这一目的，我们使用了一种先前报道的53BP1-mCherry荧光融合蛋白构建体，该构建体包含能够结合DSBs的53BP1蛋白结构域11。此外，我们还使用了组蛋白H2B-GFP荧光融合蛋白构建体，用于监测整个细胞周期中、尤其是有丝分裂期间的染色质动态12。多维度活细胞成像是深入理解真核细胞中DNA损伤应答（DDR）蛋白功能的有力工具。
方案
A. 细胞制备
- 正常人原代成纤维细胞（GM02270）购自新泽西州卡姆登的科里尔细胞库（Coriell Cell Repository），并使用hTERT进行永生化6。细胞在CellStar 6 cm培养皿中培养扩增，培养基（4 ml）为MEM，添加20%胎牛血清（GIBCO）、非必需/必需氨基酸、维生素、丙酮酸钠以及青霉素/链霉素（HyClone）。
- 人胚胎肾293（HEK293）细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），在CellStar 6 cm培养皿中培养扩增。细胞培养于含4 ml培养基的培养皿中，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素。
- 分别表达嘌呤霉素或G418抗性基因的53BP1-mCherry（N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro；Addgene质粒19836）和H2B-GFP（pCLNR-H2BG；Addgene质粒17735）融合基因构建体，通过SuperFect（Qiagene）转导（成纤维细胞）或转染（HEK293）进入细胞，并在药物筛选条件下维持培养。定期检测荧光表达情况。
- 在图像采集前24–48小时，将细胞用胰酶消化为单细胞悬液，并以低密度接种至3.5 cm FluoroDish玻璃底培养皿中。
B. 显微镜设置与图像采集
本实验方案采用配备 AxioObserver Z1 显微镜支架、双通道 Yokagawa CSU-X1A 5000 转盘共聚焦单元、2 台 Photometrics QuantEM 512SC emCCD 相机、HXP 120C 光纤光源、4 种激光器（Lasos 100 mW 多线氩离子激光器 [458、488、514 nm]、50 mW 405 nm 激光二极管、40 mW 561 nm 激光二极管和 30 mW 635 nm 激光二极管）、声光可调滤光器（AOTF）、Pecon XL multiS1 显微镜载物台培养系统、蔡司培养模块（O2 Module S、CO2 Module S、TempModule S、Heating Unit XL S）以及配备 NanoScanZ 压电 Z 轴插入件的 Prior 电动 XY 载物台的蔡司 Cell Observer SD 转盘共聚焦显微镜完成。为在水性介质中成像活细胞时最大限度减少球面像差，使用了 C-Apochromat 63x/1.20 Water/Corr 水镜物镜和蔡司 Immersol W 浸没液（折射率 n = 1.334）。进行双通道共聚焦成像时，采用 RQFT 405/488/568/647 二向色镜以及 BP525/50（绿色）和 BP629/62（红色）发射滤光片。系统软件为蔡司 Axiovision（版本 4.8.2.0），并配备 AV4 多通道/Z/T、快速成像、生理学、MosaiX、Mark & Find、双相机、Inside 4D、自动对焦和三维去卷积模块。
- 确保 CO2 气体正在通入 CO2 孵育系统的模块。如果显微镜由防震气浮台支撑，请打开气源（或N2 气）作为空气台的气源。
- 打开显微镜支架、转盘装置、相机、培养模块、HXP 光源、电动载物台、氩离子激光器及计算机的电源。
- 预热1分钟后，将氩离子激光器的点火钥匙转至“开启”位置。
- 在蔡司激光控制面板上，打开将要使用的激光线路的开关。
- 将Lasos氩离子激光器控制器的拨动开关从“待机”切换至“激光运行”，并调节光源控制器至最佳水平（即 绿指示灯变为红色之前的位置下方
- 启动 AxioVision 软件。 注意：AxioVision 的用户界面可根据其所控制的特定显微镜及组件，自定义配置相应的窗口和下拉菜单。因此，每个系统的界面可能各不相同。后续步骤中仅提供关于软件操作的通用说明，而不针对特定的软件窗口、选项卡或下拉菜单进行详细指引。
- 成像前约1小时，在软件中找到培养箱的控制选项，开启上腔和载物台的加热功能，将温度设置为 37 °C. 打开CO₂培养箱2 对照并设定水平为5%。
- 选择用于成像的物镜。本研究中使用了63x/1.20 N.A. C-Apochromat Water/Corr水镜。 注意：该物镜需要使用折射率与水相近的浸没介质（Zeiss Immersol W 浸没液）。
- 若需在较长时间内对多个不同位置进行采样，务必加入足量的浸没介质，以确保其能够从一个位置传递到另一个位置。
- 将培养皿置于载物台上，使物镜上升并与底部接触。
- 使用显微镜控制装置或软件，将发射光引导至目镜，并选择与目标荧光信号相匹配的宽场滤光片组（本研究中，53BP1 选用“Red”滤光片组，H2B 选用“GFP”滤光片组）。
- 通过目镜观察，调节焦距以清晰成像，并找到一个合适的细胞视野。
- 使用软件或显微镜控制装置，将发射光引导至装有共聚焦转盘装置的端口，避开目镜。
- 在软件中打开相应的激光器（本研究中，53BP1 使用 561 nm 激光，H2B 使用氩离子激光的 488 nm 线）。
- 针对每个通道，通过调节声光可调滤波器（AOTF）控制将激光强度调整至适当水平。
- 选择合适的二向色镜（RQFT 405/488/568/647）和发射滤光片（53BP1 使用 BP 629/62，H2B 使用 BP 525/50）。打开转盘单元的快门。
- 选择“实时”窗口以显示当前视野。
- 在软件中打开“Camera”控制，选择要使用的相机（如果是双相机系统），并将曝光时间设置为约 100 ms。根据需要调整 % 增益和 EM 增益。 注意： 53BP1-mCherry 构建体的荧光信号相对较弱。我们发现提高EM增益会有所帮助。
- 在软件中，打开共聚焦转盘装置的控制界面，通过输入用于获取合适图像的相机曝光时间，来调节转盘转速。例如 ~100 毫秒）。单击“Set”以锁定更改。
- 打开“多维采集”功能。选择通道选项卡，并加载或选择适当的通道。本研究中使用的通道针对dsRed（561 nm激光激发，发射滤光片为BP 629/62）和GFP（488 nm激光激发，发射滤光片为BP525/50）进行定义。
- 为确保图像配准，两个通道均使用同一块二向色镜（RQFT 405/488/568/647）。将软件设置为“自动对焦”。 注意：转至“工具”→“设置编辑器”以调整 MDA 设置。确保设置适当的激光功率（“适当的激光功率”指能够激发相应荧光染料的同时尽量减少光漂白的设置）。
- 在 MDA 窗口中，选择 z-stack 选项卡。选择“在当前焦平面位置进行 z-stack 扫描”。设置范围为 ~10 μm z-堆栈，并在步数设置中选择“最优”，以确保z轴方向满足奈奎斯特采样定理。 注意： z-stack 的精确尺寸取决于细胞的高度，请相应调整。
- 23. 点击“开始”，分析生成的z轴层扫图像，以确保设置适合您所研究的内容（例如 在本研究中，对整个细胞核进行成像至关重要。
- 选择“T”（时间）选项卡。在喜树碱实验中，我们设置成像时间点之间的间隔为5 min，对照组（未处理细胞）视频的总持续时间为1 hr。 注意： 为尽量减少细胞的光漂白，实验应设置为在成像时间点之间通过声光可调滤波器（AOTF）关闭激光。
- 对于培养皿中多个细胞的多点成像，在 MDA 窗口中选择“位置”选项卡。确保勾选“为每个位置应用‘时间点前/后设置’”。选择“Mark_Find”。使用“实时”视图移动培养皿，选择合适的视野。
- 在多维采集菜单中点击“开始”以启动实验，并录制对照视频（未处理细胞的视频）。
- 在对照视频之后，加入相应的处理（在此情况下， 10 μM 喜树碱）。我们以5-10分钟为间隔，对实验组（药物处理的细胞）进行2-4小时的录像记录。 注意： 需要考虑的一个重要问题是治疗后特定效应出现的速度。如视频所示，在加入CPT约5分钟后，53BP1焦点便开始形成。尽管手动向培养皿中加药并重新校准显微镜的操作相对简单，但仍需耗费一定时间。在实验设计时必须充分考虑这一因素。
- 为监测有丝分裂，我们将时间间隔设为7.5分钟，记录时长为4–5小时（具体设置取决于所用细胞系及其细胞周期长度）。在较长时间的记录过程中，可能需要进行调整以防止光漂白。
C. 图像处理与分析
本方案采用 Volocity 软件（PerkinElmer）开发。用于获取该数据的软件（AxioVision）也具备图像处理与分析功能。建议用户充分利用自身可获取的软件资源，并查阅与其应用相关的适当文献。
- 打开 Volocity 软件。创建并命名一个新的库，然后导入您的视频文件。
- 在查看文件时，我们通常发现使用“Extended Focus”设置最为有效。该设置可叠加 z-stack 层切图像，在本实验方案中，使我们能够观察细胞核不同区域中的 53BP1 焦点结构。
- 根据需要调整视频。Volocity 配备了多种工具以提高所获取图像的质量。通过确保显微镜的设置恰当，可在后续编辑中节省大量时间。通常，对图像进行去卷积处理并调整亮度/对比度会有所帮助。具体的编辑需求将根据实验情况而有所不同。
- 添加相对时间戳和比例尺。
- 要以三维方式观察细胞，请切换至“3-D Opacity”设置。此功能允许在空间中旋转三维渲染的细胞，从而从多个角度观察细胞内感兴趣结构。注意：通过在不同平面上可视化细胞，有助于确定感兴趣结构的移动路径。例如，在“Extended Focus”设置下，很难察觉 53BP1 实际上在有丝分裂期间从 DNA 上解离；但在三维视图中，这一现象则清晰可见。
- 可根据用户偏好将视频和静态图像导出为多种文件格式。
D. 代表性结果
图1展示了CPT诱导53BP1焦点形成的示例。图1中，暴露于CPT的细胞在5–10分钟内形成焦点，并在整个记录期间维持这些焦点。如图2所示，53BP1在有丝分裂开始时从染色质上解离，在凝缩的染色体周围形成一层弥散的薄雾状结构。当细胞进入末期、有丝分裂接近结束时，53BP1再次聚集形成清晰可辨的焦点。尽管HEK293细胞未暴露于CPT，但仍形成了大量由内源性DNA损伤引发的自发性53BP1修复焦点。该观察结果使我们得出结论：53BP1在早期有丝分裂期间不会形成焦点，这与先前报道的结果一致——即细胞经电离辐射或放射模拟药物处理后也表现出类似现象5。
图 1. 在培养基中加入喜树碱（10 μM）后30分钟内，即可在增殖的成纤维细胞中诱导DNA双链断裂（DSBs）并形成53BP1焦点。
图 2. 在 HEK293 细胞中，53BP1 直到有丝分裂末期/ G1 期才形成焦点。
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讨论
维持基因组完整性对细胞存活至关重要。若无法保持基因组稳定，将导致早衰、癌变或细胞死亡8。由于DNA损伤应答（DDR）在基础研究和临床研究中均具有重要意义，人们对其功能机制表现出高度关注。多年来，已发展出多种技术以帮助研究细胞如何识别并修复DNA损伤。传统的研究方法如免疫细胞化学和蛋白质印迹法一直是该领域的核心技术，但随着技术的不断进步，更为精密的研究手段也逐步发展起来。本实验方案中详述的活细胞成像技术，使我们能够研究传统方法所忽略的DDR特征。
活细胞成像技术的核心在于创建荧光标记的蛋白质。本文中，我们描述了一种在DNA损伤应答（DDR）过程中发挥作用的mCherry标记蛋白53BP1，以及一种组蛋白H2B-GFP融合蛋白。荧光标记蛋白在分子与细胞生物学研究中被广泛应用；然而，其应用也存在一定的局限性。将新的结构连接到内源性蛋白上，显然存在改变其天然功能的风险。此外，某些构建体在不同细胞系中、在不同实验条件下，其表达水平可能各不相同。在本研究使用的所有基因工程细胞中，我们都观察到了荧光强度水平的差异。本实验方案中所用的53BP1构建体缺失了大部分功能结构域；但...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
部分由 R01NS064593 和 R21ES016636（K.V.）资助。显微成像在弗吉尼亚联邦大学神经生物学与解剖学系显微成像中心完成，该中心部分获得美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所中心核心基金（5P30NS047463）的支持。旋转盘共聚焦显微镜的购置得益于美国国立卫生研究院国家研究中心资源办公室的资助（1S10RR027957）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CellStar 培养皿 | Greiner Bio-one | ||
| FluroDish 玻璃底培养皿 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| MEM 培养基 | GIBCO | ||
| 非必需氨基酸 | GIBCO | ||
| 氨基酸 | GIBCO | ||
| 维生素 | GIBCO | ||
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | ||
| 青霉素/链霉素 | HyClone | ||
| 胎牛血清 | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 质粒 19836 | Addgene | ||
| pCLNR-H2BG；质粒 17735 | Addgene | ||
| SuperFect | Qiagen | ||
| Zeiss Cell Observer SD 成像系统 | Zeiss | ||
| AxioVision（版本 4.8.2） | Zeiss | ||
| Zeiss Immersol W 浸油 | Zeiss | ||
| Volocity 软件（版本 6.0） | PerkinElmer |
参考文献
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