介绍了一种追踪突触连接神经元的方法。我们利用上游细胞中TVA的特异性，检测目标细胞群体是否接收来自基因定义细胞类型的突触输入。
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摘要
摘要
研究神经环路的经典方法通量较低。跨突触病毒，特别是伪狂犬病病毒（PRV）和狂犬病毒（RABV），以及近期的水疱性口炎病毒（VSV），在环路研究中的应用正日益广泛。这些高通量方法利用可在神经元之间以顺行或逆行方向传播的病毒。
最近开发了一种用于单突触逆向示踪的改良型狂犬病毒（RABV）。（图1A）。该方法中，病毒基因组中的糖蛋白（G）基因被删除，仅在目标神经元中重新提供。通过使用一种嵌合糖蛋白G（由ASLV-A糖蛋白的胞外域和RABV-G的胞内域组成的A/RG）替代正常的RABV-G1，实现感染的特异性。这种嵌合G蛋白可特异性感染表达TVA受体的细胞1。编码TVA的基因可通过多种方法递送2-8。当RABV感染表达TVA的神经元后，由于与TVA受体共递送的RABV-G的存在，该病毒能够以逆向方式跨突触传播至其他存在突触连接的神经元。该技术可标记出投射到特定细胞类型的相对大量输入神经元（5–10%）2，从而对某一特定起始细胞类型的所有输入通路进行取样分析。
我们最近改进了该技术，使用VSV作为跨突触示踪剂9。VSV具有多项优势，包括基因表达速度快。本文详细描述了一种新的基于VSV的病毒示踪系统，可用于以更高分辨率探究神经微环路。Wickersham 等4 和 Beier 等9 最初发表的策略允许标记所有投射到初始感染的TVA表达细胞上的神经元，而本文中VSV被改造为仅能传播至TVA表达细胞（图1B）。该病毒首先被假型化为携带RABV-G，以感染TVA表达神经元下游的神经元。在感染第一群细胞后，所释放的病毒只能感染TVA表达细胞。由于病毒的跨突触传播仅限于TVA表达细胞，因此可以高分辨率地探究特定细胞类型之间是否存在连接。这些实验的流程图见图2。本文展示了一个模型环路，即小鼠视网膜中的方向选择性环路。我们研究了星形无长突细胞（SACs）与视网膜神经节细胞（RGCs）之间的连接性。
方案
1. 从cDNA制备病毒：利用痘苗病毒T7系统从cDNA中拯救VSV10
- 实验前一天，将BsrT7细胞接种至含有DMEM + 10% FBS的60 mm培养皿中，每皿接种2E6个细胞。BsrT7细胞源自BHK21（幼年仓鼠肾）细胞。
- 将含1 mM镁离子和1 mM钙离子的PBS预热至37 °C。
- 取少量vTF7-3（一种表达T7聚合酶的痘苗病毒），室温融化。vTF7-3是一种表达T7聚合酶的感染性痘苗病毒11，仅可在生物安全二级防护条件下使用。该表达系统用于在第1.9步转染的质粒中产生最大量的目标转录本。涡旋振荡病毒30秒（最大速度），随后在室温水浴中使用台式超声仪超声处理2分钟，再次涡旋30秒以打散病毒团块。
- 移除BSRT7细胞的培养基。
- 将11.7 μl vTF7-3加入600 μl含镁和钙的PBS中，混匀后加至细胞上。
- 将培养皿放入34 °C、5% CO2的培养箱中，每10分钟轻轻摇动一次培养皿。
- 45分钟后开始转染。将20 μl Lipofectamine 2000加入1 ml DMEM中混匀，静置5分钟。
- 将5.25 μg pN、2.3 μg pP、1.2 μg pl、1 μg pCAG RABV-G和6 μg VSV基因组cDNA加入500 μl DMEM中。pN、pP和pl是驱动VSV病毒基因在T7启动子下表达的质粒10，其用量经经验确定，以实现病毒的最佳拯救效果。
- 将上述两管液体混合并混匀，在室温下静置15分钟。
- 移除PBS，用1.5 ml DMEM洗涤培养皿一次。
- 吸除洗涤液，将转染混合物加入培养皿中，放入34 °C培养箱。
- 孵育5小时后，移除培养基。
- 更换为4 ml DMEM + 2% FBS + 1×青霉素-链霉素 + 10 mM HEPES（pH 7.4）。添加青霉素-链霉素可防止污染，添加HEPES可维持培养基pH，这两者均非常重要。由于病毒将在数天内破坏细胞，因此FBS浓度可降至2%，无需维持10%。
- 将培养皿置于34 °C培养箱中培养48–72小时。
- 在转染后第3天和第6天收集培养上清，并立即使用0.20 μm滤器进行注射器过滤。该孔径可去除痘苗病毒，但不会阻留VSV。
- 由于我们需要在病毒包膜上提供RABV-G，而病毒基因组本身不编码RABV-G基因，因此必须以反式方式持续提供。为此，另准备一皿293T TVA800（TVA800）细胞。这些细胞组成性表达TVA受体，允许EnvA介导的病毒感染12。当细胞融合度达80%时，更换为仅含DMEM的培养基，随后每皿转染5 μg编码G蛋白的质粒（即 pCAG RABV-G）。我们使用PEI转染试剂，这是一种多阳离子聚合物，成本远低于类似的脂质转染方法。然而，Lipofectamine也可有效用于此目的。最佳PEI : DNA比例需通过实验经验确定。可在另一实验中使用荧光报告基因（即 pCAG GFP）进行优化。我们采用的比例为10 μl PEI : 4 μg DNA。
- 将第16步获得的上清液加入已转染的TVA800细胞培养皿中。
- 次日观察该培养皿，检测病毒表达荧光蛋白的迹象。病毒荧光最初表现为单个细胞发光，并随时间逐渐扩散（即 图3）。病毒通常在数小时内开始扩散。
2. VSV 的传代与浓缩
- 将TVA800细胞以DMEM + 10% FBS培养基进行分瓶，使次日获得四个约80%融合度的10 cm培养皿。由于293T细胞具有高转染效率，因此适用于本实验；使用表达TVA的细胞可提高培养皿中细胞的感染速度。其他高转染效率的细胞系也可达到类似效果。
- 当细胞融合度达到80%时，更换培养基为仅含DMEM的培养基，然后转染细胞 5 μg 编码所需G蛋白的质粒即 每孔加入 pCAG RABV-G。我们使用 PEI，但 FUGENE/Lipofectamine 也同样有效。
- 转染后等待一天，以待糖蛋白表达/在细胞表面累积。更换培养基（每孔5 ml）为DMEM + 10% FBS，随后以感染复数（MOI）0.01接种rVSV(A/RG)病毒 < x < 0.1.
- 24 小时后检查感染程度。此时应可见被感染的细胞（通过 GFP 荧光鉴定），部分细胞周围可见成片的被感染细胞即 图3）。通常只有在观察到的情况下，收集上清液才有意义 >50%的细胞被感染，否则浓缩后获得的病毒滴度将不理想。
- 如果 > 50%时，收集每孔5 ml培养基，并更换为5 ml新鲜培养基。若感染细胞数量过少，可再等待12–24小时后再次检查。将收集的上清液于-80 °C冻存。80 °C.
- 此后每隔24小时收集一次，持续3天，共4天。
- 总之，如果你最初使用了4个培养板，那么每天应获得20 ml培养基，总计80 ml，相当于2管超速离心管容量的上清液。将上清液在 37 °C 并过滤 0.45 μm 将滤器置于冰上。取36 ml病毒液分装至贝克曼离心管中。
- 浓缩上清液（使用SW28转子在21,000 rpm下离心90分钟，相当于80,000 × g） 4 °C将上清液倾倒至含有10%次氯酸钠的烧杯中，倒置离心管，同时用抽吸装置尽可能吸除管壁残留的培养基。
- 在盖好的情况下，振荡病毒管 4 °C 孵育1小时。使用转速约为120 rpm的标准摇床即可。
- 轻轻将沉淀物在剩余的培养基中吹打重悬，上下轻柔移液30次。注意避免产生气泡。剩余培养基的体积应约为 30 μl将该体积分装至多个试管中，以避免任何单一批次的反复冻融，因为这可能导致病毒滴度下降。这些分装样品可于 -80 °C.
- 滴定病毒。感染后约2天进行滴定效果最佳。最初感染可在数小时内观察到，但若仅等待1天，则会导致滴定结果偏低。为获得病毒滴度，将浓缩后的病毒在24孔板中对适当的细胞系（如293T细胞）进行连续稀释实验，病毒稀释倍数从1至1:1,000,000进行10倍梯度稀释。我们通常获得的滴度范围在108-1010 每毫升焦点形成单位（ffu/mL）
3. 病毒注射
- 我们通常使用6至10周龄的小鼠进行这些实验。只要神经环路已建立，任何年龄段的小鼠均可适用。我们将视网膜神经节细胞（RGCs）到星形无长突细胞（SACs）的突触传递作为示例。如图2所示，该实验需要使用三重转基因动物，并仅需单次病毒注射。（所示所有操作均经哈佛医学院动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并符合机构指南。）
- 首先，需要制备合适的实验动物。目标是通过病毒（即腺相关病毒，AAV）或转基因等位基因的方式，使目标细胞类型表达TVA。细胞类型的特异性通常通过Cre表达实现。在此，我们将条件性表达TVA的等位基因7与胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre等位基因13杂交，从而使所有具有Cre表达历史的细胞（即SACs）表达TVA。我们还引入了条件性表达tdTomato的等位基因（R26TdT），以可视化表达TVA的细胞。
- 需要确定注射位点的坐标。这些感兴趣的坐标可在脑图谱中查找，例如Franklin和Paxinos小鼠脑图谱14。这些坐标需相对于小鼠颅骨上的某一解剖标志进行记录。我们使用前囟（bregma）作为参考，但任何坐标系统均可适用。
- 准备立体定位装置。打开微量注射控制器，将活塞和电极夹调整至适当位置。然后用矿物油回填注射针头，以形成与病毒之间的界面。将针头安装到活塞上，确保针头内无气泡残留。
- 将病毒解冻后置于冰上，以防止病毒滴度下降。将微量注射器设置为“吸取”模式，并移动病毒管使其与微量注射器上的毛细管接触。吸取实验所需量的、以RABV-G假型化的rVSV(A/RG)病毒。
- 在手术开始前，给予动物术前剂量的丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg）。麻醉方式可选择异氟烷吸入，或腹腔注射氯胺酮（40–80 mg/kg）与赛拉嗪（5–10 mg/kg）混合物，两者均可满足需求。麻醉剂的选择取决于操作者。通过脚趾夹捏测试确认动物是否完全麻醉；若动物无反应，即可开始操作。使用这些药物前务必取得相应许可证。
- 将动物置于加热垫上，并将加热垫固定在可移动支架上以调整小鼠位置。在整个手术过程中，动物均保持在此位置。麻醉期间需涂抹眼膏，以防止角膜干燥。
- 需将小鼠头部固定在立体定位装置中。使用立体定位仪的耳杆确保头部被充分固定，使头部与地面平行且不发生侧向旋转。完成此步骤后，调整门齿杆以进一步稳定头部。
- 剃除头部切口区域的毛发。随后用乙醇清洗该区域三次，再用碘液清洗三次。使用手术刀在皮肤上做切口，暴露颅骨。
- 在小鼠和注射装置准备就绪后，需定位前囟（bregma）。前囟是位于头部中央、矢状缝与两条冠状缝交汇的区域。确定该区域后，可利用立体定位仪上的刻度盘将微量注射器调整至目标坐标。本实验中，我们注射外侧膝状体核（LGN），坐标为从前囟起A/P -2.46，L/M 2，D/V 2.75。
- 坐标设定完成后，需组装钻头。将钻头装入钻机，然后开启钻机。在已确定的注射位点钻出一个小孔。操作钻头时需格外轻柔，以避免损伤脑实质。当颅骨变得极薄时，硬脑膜上的血管会变得清晰可见。此时，使用细小（30号）针头和精细（#5）镊子小心地穿刺颅窗边缘，以移除剩余骨片。
- 将毛细管调整至刚位于脑表面背侧的位置，即刚钻出的孔处。针头应足够锋利，以便轻松穿透硬脑膜。随后将针头降至目标深度并开始注射。我们以100 nl/min的速率注射病毒。
- 至此，注射过程耗时约十分钟。注射完成后，针头需在脑内保留约七分钟。这一步骤至关重要，因为它允许病毒从注射位点扩散。若迅速拔出针头，会导致注射位点感染效率降低，并增加沿针道的非特异性感染。
- 针头需非常缓慢地从注射位点拔出，整个过程持续约两分钟。此举同样旨在减少沿针道的感染。
- 拔出针头后，缝合皮肤。持续监测动物直至其从麻醉中恢复。术后每12小时给予一次丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg），连续给药两天。
4. 组织收获/组织制备
- 收获目标组织的最佳时间取决于实验目的。通常，在注射后不到24小时即可首次观察到VSV跨突触传播。然而，等待更长时间将导致更广泛的传播。
- 为收获视网膜，首先通过吸入二氧化碳并实施颈椎脱位处死动物。随后取出眼球，并置于含有4%多聚甲醛（溶于PBS）的离心管中，在室温下固定1小时。
- 将眼球转移至含有PBS的培养皿中，随后将视网膜从其他组织中解剖分离。
- 对于整体装片分析，将视网膜剪开使其平铺，转移至载玻片上，用Prolong Gold封片介质封固，并加盖零厚度玻璃盖玻片。在载玻片与盖玻片之间放置硅胶垫片，以最小化对视网膜的压迫力。对于切片分析，将视网膜置于含30%蔗糖的PBS溶液中，直至视网膜完全沉底。随后将其转移至50% OCT与50% 30%蔗糖溶液的混合液中，浸泡3小时。之后进行速冻，并于-80 °C保存，直至准备切片。
5. 典型结果
从cDNA拯救出的病毒应能够感染TVA800细胞，但不能感染293T细胞（图3）。提供RABV-G后，可使包括293T在内的多种细胞类型被感染。然而，由于A/RG基因组被编码在基因组中，因此在表达TVA的细胞中，病毒的细胞间传播速率要高得多。
病毒浓缩后，其典型滴度通常介于 108 ffu/ml 和 1010 ffu/ml。这些滴度足以用于 体内.
在向小鼠外侧膝状体（LGN）注射时，我们不区分背侧LGN（dLGN）与腹侧LGN（vLGN），因为通常两者均会被感染。因此，多种视网膜神经节细胞（RGC）类型均被标记（图4），包括投射至vLGN的细胞类型，如黑视蛋白RGCs（图4D）和ON-DSGCs（图4E），以及投射至dLGN的细胞类型，如小树突RGCs（图4C）和ON-OFF-DSGCs（图4F）。尽管不止一种RGC类型可将病毒传递至星形无长突细胞（SACs）（如其他研究报道，Beier et al.，正在审稿中），但本文仅聚焦于ON-OFF-DSGCs与SACs之间已被广泛研究的连接。
当我们注射基因型为 cTVA(+)/ChAT-Cre(-) 的小鼠（该基因型不应表达TVA）时，仅有RGCs被标记（即 图4）。这是由于RGCs最初摄取了RABV-G假型病毒，但不会发生进一步传播。当将未以RABV-G假型化的rVSV(A/RG)病毒注入外侧膝状体核（LGN）时，由于此类病毒颗粒无法沿RGCs的长轴突逆向运输，因此不会感染RGCs。然而，当将cTVA(+)/ChATCre(+)（以及R26TdT(+)）小鼠的LGN注射病毒后，可观察到病毒传播，且仅传播至表达Cre报告基因的红色荧光细胞。即 图5）。这些细胞还与抗ChAT抗体共同标记，且仅分布于两个ChAT层中，从而证实其为SACs（星形细胞）。图5B'、C'每个DSGC上的病毒标记SAC数量从一到九个不等。
图 1. 我们的逆向跨突触示踪系统与最初开发方法的比较。(A) (i) 在Wickersham及其同事开发的方法中，“起始细胞”被转染了三个基因：TVA受体，用于特异性允许病毒感染仅限于被转染的细胞；RABV-G，用于弥补缺失G基因的狂犬病毒（RABV）；以及一种红色荧光蛋白，用于识别被转染的细胞。(ii) 一种由A/RG蛋白假型化的RABV感染表达TVA的细胞，使其呈现黄色。(iii) 发生向上游神经元的逆向跨突触传播。(B) (i) 在我们的方法中，表达TVA的细胞通过遗传方式定义，并用一种条件型红色荧光蛋白进行标记。(ii) “起始细胞”是那些被携带A/RG基因的VSV病毒感染的细胞，该基因位于病毒基因组中。这些起始细胞不表达TVA受体。(iii) 仅当这些细胞向起始神经元提供突触输入时，才会发生逆向跨突触传播至表达TVA的神经元。 点击此处查看大图。
图 2. 实验流程示意图。（A）首先，从 cDNA 中拯救病毒，随后进行传代并用 RABV-G 伪型化，再浓缩并测定滴度。该病毒随后被注射入脑内，并允许其在所需时间内孵育。孵育结束后，摘取眼球，分离视网膜并进行分析。（B）病毒与 RABV-G 伪型化的示意图。此步骤对于通过脑内注射感染视网膜神经节细胞是必需的。首先将 RABV-G 基因转染至表达 TVA 受体的组织培养细胞中，随后用 rVSV(A/RG) 病毒感染这些细胞。释放的病毒颗粒将在病毒包膜中含有 RABV-G，但其病毒基因组中不含有 RABV-G 基因。（C）构建三重转基因小鼠所需杂交策略的示意图。将条件性 TVA 和 tdTomato 等位基因与选定的 Cre 驱动品系杂交，使得 TVA 和 tdTomato 仅在具有 Cre 表达历史的细胞中表达。在本例中，我们使用了 ChAT-Cre。（D）视网膜感染示意图，用于追踪 DSGC-SAC 神经环路。ChAT 细胞被诱导表达 TVA 和 tdTomato，如图（C）所示。RGCs 通过外侧膝状体（LGN）注射在（B）中产生的病毒而被感染。由于该病毒表达 GFP，这些 RGCs 将呈现绿色。若被标记的 RGC 存在与之连接的 TVA 表达型 ChAT 无长突细胞，则病毒将仅传播至这些细胞，使其同时呈现红色与绿色，即黄色。 点击此处查看高清大图。
图3. rVSV(A/RG)病毒在293T细胞和TVA800细胞中的行为。这些细胞被低滴度、携带RABV-G包膜蛋白的rVSV(A/RG)假型病毒感染。如感染后6小时（HPI）、感染后1天和2天（DPI）所示，病毒在表达TVA受体的细胞之间数小时内即可扩散。然而，在不表达TVA受体的293T细胞中，尽管病毒仍可传播，但速度显著减慢。比例尺 = 100 μm。
图 4. 非表达TVA的小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的代表性感染情况。将携带RABV-G包膜的rVSV(A/RG)病毒注射至外侧膝状体核（LGN），并在感染后2天（2 dpi）取组织进行分析。(A) 根据病毒滴度和注射质量，可观察到稀疏（黄色箭头指示的RGCs）或(B) 密集的感染。基于形态学特征可识别多种不同类型的RGCs，包括(C) 小树突型RGCs、(D) 1型黑视蛋白RGCs、(E) ON型方向选择性RGCs（ON-DSGCs）以及(F) ON-OFF型方向选择性RGCs（ON-OFF-DSGCs）等。比例尺 = 50 μm。
图 5. rVSV(A/RG) 从 ON-OFF-DSGCs 向 SACs 的传播符合预期模式。（A）ON-OFF-DSGCs（绿色填充的白色箭头，white arrowhead with green fill）将病毒传递给多个 SACs（黄色箭头，yellow arrowheads）。（A'）除 DSGC 外，所有绿色细胞均与 Cre 报告基因共标记，表明它们是表达 TVA 的 SACs。（B-C）DSGC（绿色填充的白色箭头）和 SACs（黄色箭头）位于视网膜内丛状层（IPL）中正确的 ChAT 分层。病毒传播所及的细胞包括 ON-SACs 和 OFF-SACs。图 B' 和 C' 中的数字表示 IPL 的分层。为突出显示 SACs，图 C 中仅用箭头标示 DSGC 胞体的位置，未显示其完整形态。比例尺 = 50 μm。
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讨论
利用病毒研究神经环路是一种相对高通量的分析相连神经元的方法。然而，生成VSV和RABV病毒颗粒并非易事。尽管上述方案提供了从cDNA拯救病毒的步骤，但该过程仍属于低概率事件。N、P和L质粒各自的表达水平需要精细调整，并且必须进行多次试验和重复，以确保成功拯救病毒。包含完整VSV基因组RNA的核糖核蛋白颗粒的形成是一个低概率事件，因此可能需要多次尝试。该技术可能需要一段时间进行优化，但一旦优化完成，病毒拯救将变得容易得多。
当RGC树突树不重叠时，对单个RGC的病毒传播进行分析效果最佳（即 图4A）。注射病毒的剂量和注射坐标可根据最佳感染效果进行调整。此外，注射位置会影响被标记的RGCs的数量和类型（即 上丘或视交叉上核的标记将显示出与外侧膝状体注射不同数量和类型的视网膜神经节细胞（RGCs）。
与PRV和RABV相比，VSV具有多项优势。VSV的表达水平非常迅速，数小时内即可观察到9,15，从而允许更短的孵育时间。在本实验中，A/R...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Sean Whelan在拯救重组VSV变异体方面提供的帮助，以及Didem Goz和Ryan Chrenek提供的技术协助。本工作由HHMI（CLC）和#NS068012-01（KTB）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>组织培养 | |||
| 幼仓鼠肾（BSRT7）细胞 | 可根据要求提供 | ||
| 痘苗病毒（vTF7-3） | 可根据要求提供 | ||
| pN、pP、pl 质粒 | 可根据要求提供 | ||
| 氯化钙 | Sigma | C1016 | |
| 氯化镁 | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T 细胞 | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm 细胞培养处理培养皿 | 康宁 | 430166 | |
| 75 cm2 带通气盖的矩形斜颈细胞培养瓶 | 康宁 | 430641 | |
| 培养基：DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基） | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS：胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 注射器：5 ml 鲁尔锁式注射器 | Sigma | Z248010-1PAK | |
| 注射器滤器 | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI：高效线性PEI | Polysciences | 23966 | |
| <强>病毒离心 | |||
| Corning 150 ml 带管顶真空滤器系统，0.45 μ微孔 | 康宁 | 430314 | |
| 超薄管壁，超透明，38.5 ml，25 x 89 mm 超速离心管 | 贝克曼库尔特 | 344058 | |
| 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | optima XL-80K | |
| SW28 超速离心机转子 | 贝克曼库尔特 | 342207 | |
| <强>小鼠注射 | |||
| 毛细玻璃微管 | Drummond | 5-000-2005 | |
| 立体定位 | Narishige | SR-5M | |
| 显微操作仪 | Narishige | SM-15 | |
| Ump 注射器 | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| 四通道微控制器 | 世界精密仪器公司 | UMP3 | |
| M.TXB 台式电机配 C.EMX-1 旋钮控制器，115 伏特 | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 手柄，快速更换 | Foredom | H.10 | |
| 阶梯钻，0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| 显微技术–电极夹 | World Precision Instruments | MEH2S | |
| 氯胺酮 | Henry Schein | 995-2949 | |
| 赛拉嗪 | Henry Schein | 4015809TV | |
| 布托啡诺 | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml 注射器 | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30号注射针头 | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 保护性眼膏 | 福斯特与史密斯医生 | 9N-014748 | |
| 乙醇 | Sigma | 493511 | |
| 碘 | Sigma | PVP1 | |
| <强>手术与解剖工具 | |||
| 剪刀 | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| 标准镊子 | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 手术刀柄 | 精细科学工具 | 10003-12 | |
| 手术刀片 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| 缝合线 | 罗宾斯仪器 | 20.SK640 | |
| <强>解剖与抗体染色 | |||
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| 驴血清 | 杰克逊免疫研究实验室 | 017-000-121 | |
| <强>抗体 | |||
| 抗体 | millipore | AB144P | |
| 抗gfp | Abcam | ab13970 | |
| 驴抗鸡Dylight 488 | 杰克逊免疫研究 | 703-545-155 | |
| 驴抗鸡 Alexa Fluor 647 | 杰克逊免疫研究 | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| <强>组织固定 | |||
| Superfrost plus 显微镜载玻片 | Fisher | 12-550-100 | |
| 盖玻片 22 x 22，0 厚度 | 电子显微镜科学公司 | 72198-10 | |
| 硅酮弹性体 | 罗杰斯公司 | HT-6220 | |
| 透明指甲油 | 电子显微镜科学公司 | 72180 | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭剂 | Invitrogen | P36930 | |
|
参考文献
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
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