基因定义神经环路的病毒示踪

摘要

介绍了一种追踪突触连接神经元的方法。我们利用上游细胞中TVA的特异性，检测目标细胞群体是否接收来自基因定义细胞类型的突触输入。

摘要

研究神经环路的经典方法通量较低。跨突触病毒，特别是伪狂犬病病毒（PRV）和狂犬病毒（RABV），以及近期的水疱性口炎病毒（VSV），在环路研究中的应用正日益广泛。这些高通量方法利用可在神经元之间以顺行或逆行方向传播的病毒。

最近开发了一种用于单突触逆向示踪的改良型狂犬病毒（RABV）。（图1A）。该方法中，病毒基因组中的糖蛋白（G）基因被删除，仅在目标神经元中重新提供。通过使用一种嵌合糖蛋白G（由ASLV-A糖蛋白的胞外域和RABV-G的胞内域组成的A/RG）替代正常的RABV-G¹，实现感染的特异性。这种嵌合G蛋白可特异性感染表达TVA受体的细胞¹。编码TVA的基因可通过多种方法递送^2-8。当RABV感染表达TVA的神经元后，由于与TVA受体共递送的RABV-G的存在，该病毒能够以逆向方式跨突触传播至其他存在突触连接的神经元。该技术可标记出投射到特定细胞类型的相对大量输入神经元（5–10%）²，从而对某一特定起始细胞类型的所有输入通路进行取样分析。

我们最近改进了该技术，使用VSV作为跨突触示踪剂⁹。VSV具有多项优势，包括基因表达速度快。本文详细描述了一种新的基于VSV的病毒示踪系统，可用于以更高分辨率探究神经微环路。Wickersham 等⁴ 和 Beier 等⁹ 最初发表的策略允许标记所有投射到初始感染的TVA表达细胞上的神经元，而本文中VSV被改造为仅能传播至TVA表达细胞（图1B）。该病毒首先被假型化为携带RABV-G，以感染TVA表达神经元下游的神经元。在感染第一群细胞后，所释放的病毒只能感染TVA表达细胞。由于病毒的跨突触传播仅限于TVA表达细胞，因此可以高分辨率地探究特定细胞类型之间是否存在连接。这些实验的流程图见图2。本文展示了一个模型环路，即小鼠视网膜中的方向选择性环路。我们研究了星形无长突细胞（SACs）与视网膜神经节细胞（RGCs）之间的连接性。

方案

1. 从cDNA制备病毒：利用痘苗病毒T7系统从cDNA中拯救VSV¹⁰

1. 实验前一天，将BsrT7细胞接种至含有DMEM + 10% FBS的60 mm培养皿中，每皿接种2E6个细胞。BsrT7细胞源自BHK21（幼年仓鼠肾）细胞。
2. 将含1 mM镁离子和1 mM钙离子的PBS预热至37 °C。
3. 取少量vTF7-3（一种表达T7聚合酶的痘苗病毒），室温融化。vTF7-3是一种表达T7聚合酶的感染性痘苗病毒¹¹，仅可在生物安全二级防护条件下使用。该表达系统用于在第1.9步转染的质粒中产生最大量的目标转录本。涡旋振荡病毒30秒（最大速度），随后在室温水浴中使用台式超声仪超声处理2分钟，再次涡旋30秒以打散病毒团块。
4. 移除BSRT7细胞的培养基。
5. 将11.7 μl vTF7-3加入600 μl含镁和钙的PBS中，混匀后加至细胞上。
6. 将培养皿放入34 °C、5% CO₂的培养箱中，每10分钟轻轻摇动一次培养皿。
7. 45分钟后开始转染。将20 μl Lipofectamine 2000加入1 ml DMEM中混匀，静置5分钟。
8. 将5.25 μg pN、2.3 μg pP、1.2 μg pl、1 μg pCAG RABV-G和6 μg VSV基因组cDNA加入500 μl DMEM中。pN、pP和pl是驱动VSV病毒基因....

讨论

利用病毒研究神经环路是一种相对高通量的分析相连神经元的方法。然而，生成VSV和RABV病毒颗粒并非易事。尽管上述方案提供了从cDNA拯救病毒的步骤，但该过程仍属于低概率事件。N、P和L质粒各自的表达水平需要精细调整，并且必须进行多次试验和重复，以确保成功拯救病毒。包含完整VSV基因组RNA的核糖核蛋白颗粒的形成是一个低概率事件，因此可能需要多次尝试。该技术可能需要一段时间进行优化，但一旦优化完成，病毒拯救将变得容易得多。

当RGC树突树不重叠时，对单个RGC的病毒传播进行分析效果最佳（即 图4A）。注射病毒的剂量和注射坐标可根据最佳感染效果进行调整。此外，注射位置会影响被标记的RGCs的数量和类型（即 上丘或视交叉上核的标记将显示出与外侧膝状体注射不同数量和类型的视网膜神经节细胞（RGCs）。

与PRV和RABV相比，VSV具有多项优势。VSV的表达水平非常迅速，数小时内即可观察到^9,15，从而允许更短的孵育时间。在本实验中，A/R.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>组织培养
幼仓鼠肾（BSRT7）细胞	可根据要求提供
痘苗病毒（vTF7-3）	可根据要求提供
pN、pP、pl 质粒	可根据要求提供
氯化钙	Sigma	C1016
氯化镁	Sigma	M8266
HEK 293T 细胞	Open Biosystems	HCL4517
60 mm 细胞培养处理培养皿	康宁	430166
75 cm2 带通气盖的矩形斜颈细胞培养瓶	康宁	430641
培养基：DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）	Invitrogen	12491-015
1 M HEPES pH 7.4	Gibo	15630-080
FBS：胎牛血清	Gibco	10437-028
PKS	Invitrogen	15140-163
Lipofectamine 2,000 转染试剂	Invitrogen	11668-019
注射器：5 ml 鲁尔锁式注射器	Sigma	Z248010-1PAK
注射器滤器	Nalgene	190-2520
PEI：高效线性PEI	Polysciences	23966
<强>病毒离心
Corning 150 ml 带管顶真空滤器系统，0.45 μ微孔	康宁	430314
超薄管壁，超透明，38.5 ml，25 x 89 mm 超速离心管	贝克曼库尔特	344058
超速离心机	贝克曼库尔特	optima XL-80K
SW28 超速离心机转子	贝克曼库尔特	342207
<强>小鼠注射
毛细玻璃微管	Drummond	5-000-2005
立体定位	Narishige	SR-5M
显微操作仪	Narishige	SM-15
Ump 注射器	World Precision Instruments	Sys-Micro4
四通道微控制器	世界精密仪器公司	UMP3
M.TXB 台式电机配 C.EMX-1 旋钮控制器，115 伏特	Foredom	M.TXB-EM
H.10 手柄，快速更换	Foredom	H.10
阶梯钻，0.5 mm	Foredom	A-58005P
显微技术–电极夹	World Precision Instruments	MEH2S
氯胺酮	Henry Schein	995-2949
赛拉嗪	Henry Schein	4015809TV
布托啡诺	Henry Schein	1118217
1 ml 注射器	Becton-Dickinson	309628
30号注射针头	Becton-Dickinson	305106
保护性眼膏	福斯特与史密斯医生	9N-014748
乙醇	Sigma	493511
碘	Sigma	PVP1
<强>手术与解剖工具
剪刀	Fine Science Tools	91402-12
标准镊子	Fine Science Tools	11000-12
精细镊子	Fine Science Tools	11255-20
万纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	15000-00
手术刀柄	精细科学工具	10003-12
手术刀片	Fine Science Tools	10015-00
缝合线	罗宾斯仪器	20.SK640
<强>解剖与抗体染色
多聚甲醛	Sigma	P6148
磷酸盐缓冲液	Sigma	P4417
Triton X-100	Sigma	T9284
驴血清	杰克逊免疫研究实验室	017-000-121
<强>抗体
抗体	millipore	AB144P
抗gfp	Abcam	ab13970
驴抗鸡Dylight 488	杰克逊免疫研究	703-545-155
驴抗鸡 Alexa Fluor 647	杰克逊免疫研究	705-605-147
DAPI	Invitrogen	D1306
<强>组织固定
Superfrost plus 显微镜载玻片	Fisher	12-550-100
盖玻片 22 x 22，0 厚度	电子显微镜科学公司	72198-10
硅酮弹性体	罗杰斯公司	HT-6220
透明指甲油	电子显微镜科学公司	72180
Prolong Gold 抗荧光淬灭剂	Invitrogen	P36930