一种微流体装置研究多个不同的菌株

Summary

我们提出了一种简单的方法来施加类似的动态条件下，以多个不同的菌株，能够产生的微流体装置，而不需要一个干净的房间或软光刻。

Abstract

细胞的反应，环境变化的研究，提出了许多实验的挑战:细胞需要将被成像在变化的条件下，往往在一个比较的方式。多孔板经常使用的比较多的不同株或细胞系，但允许有限的环境动态控制。微流体装置，在另一方面，在周围条件允许精致的动态控制，但它是具有挑战性的图像和区分超过在其中少数菌​​株。在这里，我们描述了一种方法，容易且迅速地制造的微流体装置，其能够应用动态地改变的条件下，在一个通道中的多个不同的酵母菌株。通过简单的装置，该装置的设计和制造，而不需要为软光刻技术。它是由一个Y形的流路连接到的第二层窝藏微孔。该菌株中被放置在单独的微孔，并且确切的相同的动态条件下成像。我们试玩nstrate测量蛋白定位的反应在不同的酵母菌株的养分的变化的脉冲的移动设备的使用。

Introduction

细胞不断动态变化的环境的反应，通过改变他们的新陈代谢，基因表达谱和细胞功能。为了研究这些现象，可以量化这种变化的方法是必要的。一种类型的读出这样的回答是本地化的压力相关的转录因子中的营养应激反应的变化。

微流体装置¹已被用来动态操作环境条件的细胞^2-4。他们提出活细胞成像的几个优点:细胞的环境，可以精确地控制和动态地改变，细胞可以是活成像在所有时间，包括操纵外部条件期间;及需要最小的试剂量。一个非常简单的微流体设备的设计，允许两个条件之间的交替，是一个Y形的装置^2。我们经常使用Y形微流体装置，让在通道中的细胞的动态变化的应用。我们使用该设备遵循荧光标记的压力相关的转录因子在酵母细胞中的定位变化。我们遵循这些变化在不断变化的营养条件下。例如，我们可以提供一个脉冲（或一系列脉冲）的期限内没有葡萄糖培养基含葡萄糖的介质，在一个非常良好的时间分辨率。通常在这样的实验中，一个是兴趣比较不同的细胞株（例如，不同的突变体，或不同的野生分离株）的响应。 Y形通道被限制在每个通道中的一个应变 - 如果使用不止一个应变，有没有简单的方法来区分菌株。为了克服这个问题，可以使用不同的渠道。如果我们要采用相同的动力条件下多株，我们希望与多渠道结合的Y-通道的概念。在实施这一解决方案有两个挑战:这是很难申请吨他相同的条件的所有信道在同一时间，并且有一个几何的，可以安装在一台设备中的Y通道的数目的限制。因此，我们在寻找一种方式来查看动态条件....

Protocol

1。创建苏格兰带硕士⁵

1. 绘制或打印出所需的微布局，扩大规模，在纸面上。在我们的例子中，设计是由两个Y形通道，每个通道3毫米宽（ 图2）。
2. 盖一个玻璃滑了一层层的透明胶带。层的数目，将确定的信道（每一层约60微米）的高度。我们用透明胶带层。
3. 放置在平坦表面上的布局设计。将滑过的设计模式。小心地切割胶带在载玻片上，用解剖刀，根据该布局来。
4. 从各地区的载玻片，但在布局的微取出透明胶带。
5. 滑动，在65℃的加热烘箱中放置2-3分钟。与乙醇，轻轻地擦拭。

2。 PDMS微流控芯片制造

1. 混合基料和固化组件的PDMS，如制造商推荐的。我们用一个10:1的碱与固化剂的比率。倒入约30毫升的PDMS混合物倒入一个Petri培养皿〜0.5厘米的高度。脱气PDMS在真空中，如果需要的话。被淹没的载玻片上，在PDMS与图案的透明胶带朝上。名次后的图案的PDMS，防止形成气泡之间的滑动和培养皿底部。在65°C固化48小时，确保菜是使用气泡水平仪水平。
2. 在一个新的90毫米陪替氏培养皿中倒入3毫升的PDMS混合，从而导致在约0.5mm深的层。 （如果旋涂机是可用的，它可以被用于这个阶段）。
3. 德加和治疗为2.1。
4. 轻轻切出的微流体装置，用手术刀到所需的大小。该层将被称为"流层"....

Results

为了说明不同菌株之间的分离，我们拍摄了两个区分的酵母菌株在备用井。成像的完整井没有显示出细胞的孔中（ 图5a，b）之间的泄漏。这两种菌株有的转录因子MSN2标记与YFP。要测试的同时动态地改变的条件的影响，我们在两个输入信道切换的流 ​​率，创建无葡萄糖培养基，导致本地化MSN2-YFP的核（ 图5c，四 ）的步骤。在所有的孔测量的响应发生在相同的时间，示出的移动设备可用于并发动态条件应用到多个井。

图1。移动设备设计，该装置是由一个盖玻片，薄的"井"层和"流"层管是conne反恐执行局。

Discussion

在本文中，我们提出了一个简单的台式的方法创建一个微流体装置，同时允许以下几个酵母菌株，在动态条件下。经过数株在一个通道中，提供了一个可靠的工具比较多株的单细胞反应的动力学。我们的方法的一个优点是能够用简单的技术来制造的移动设备，而不需要一个干净的房间。事实上，我们也进行了协议跳绳等离子处理操作（步骤2.9和3.6），并取得了良好的效果，所以没有任何等离子设备的实验室仍然可以执行协议。

通过播种每个在其自己的不同菌株以及我们避免细胞的移动设备的组装过程中的混合，同时仍然允许介质的流动，在实验过程中达到的细胞。在该协议中的一个关键点是不是让细胞变干，再回流介质对他们（步骤3.4 - 3.6）。 Dryin克了严重影响细胞的生存能力，而试图关闭的设备太多介质两者之间的PDMS层粘连问题在每一个较好的结果。这些约束迫使我们离开井层的设备，而不是把它剥开后的细胞定居在他们的斑点。井层，因此，具有足够深，包含最初的液滴接种细胞，但尽可能地薄，因此，各孔的纵横比允许介质的流动，以达到它们的底部和细胞得到通过直接流动的外部信号。

的装置，.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备	公司	目录编号
PDMS-SYLGARD 184	美国道康宁
真空干燥器	的Nalgene	5310-0250
活检打孔器	特德·佩拉公司	哈里斯Uni-CORE核心15076（2毫米），15074（1.2毫米）
注射泵	Chemyx	融合200
电晕处理机	电工艺产品	BD-20
聚乙烯管	聚乙烯	S-54-HL
伴刀豆球蛋白-A	西格玛	C7275
透明胶带	3M思高	透明胶带二分之一"