蛋白质–DNA 复合物的晶体结构可为蛋白质的功能、作用机制以及特异性相互作用的性质提供深入见解。本文中，我们报道了如何优化双链 DNA 的长度、序列和末端，以实现与大肠杆菌（Escherichia coli）复制起始负调控因子 SeqA 的共结晶。
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本文内容
摘要
摘要
大肠杆菌（Escherichia coli）SeqA 是 DNA 复制的负调控因子，通过结合复制起点内半甲基化的 GATC 位点簇，阻止复制的过早重新起始1。在复制起点之外，SeqA 也存在于复制叉处，可将新复制的 DNA 组织成更高阶的结构2。SeqA 与单个 GATC 序列的结合较弱，但能与包含多个 GATC 位点的 DNA 双链形成高亲和力复合物。SeqA 的最小功能与结构单元是二聚体，这解释了其与半甲基化 DNA 形成高亲和力复合物至少需要两个 GATC 序列的原因3。此外，SeqA 的结构包含通过柔性连接区分开的寡聚化结构域和 DNA 结合结构域，使其能够结合相隔最多三个螺旋周期的 GATC 重复序列。因此，要在分子水平上理解 SeqA 的功能，必须对 SeqA 与多个 GATC 序列结合的结构进行分析。在蛋白质-DNA 共结晶过程中，DNA 对晶体堆积相互作用的影响可从无到显著，具体取决于蛋白质与 DNA 的相对大小及结构。若蛋白质大于 DNA 或几乎覆盖整个 DNA，则晶体堆积主要由蛋白质-蛋白质相互作用介导。相反，当蛋白质与 DNA 大小相近或更小，或仅覆盖 DNA 的一部分时，晶体堆积则主要由 DNA-DNA 和 DNA-蛋白质相互作用主导。因此，蛋白质-DNA 复合物的结晶需要系统地筛选 DNA 长度4以及 DNA 末端类型（平末端或突出末端）5-7。本报告中，我们描述了如何设计、优化、纯化并结晶包含串联 GATC 重复序列的半甲基化 DNA 双链，使其与一种二聚体形式的 SeqA 变体（SeqAΔ(41-59)-A25R）形成复合物，以获得适用于结构解析的晶体。
方案
1. 蛋白质纯化
SeqA蛋白的N端（寡聚化结构域）与C端（DNA结合结构域）之间由一段柔性连接区相连，有助于识别DNA上相隔一到三个螺旋圈的半甲基化GATC重复序列。在本研究中，我们使用了一种SeqA的二聚体变体（SeqAΔ(41-59)-A25R），其N端结构域含有一个点突变，可阻止进一步的寡聚化，同时连接区较短，使得该蛋白仅能结合DNA上恰好相隔一个螺旋圈的串联GATC重复序列（图1）2,8。
- 将带有T7启动子控制的SeqA编码质粒转化至BL21 (DE3)感受态细胞中，
- 将转化产物涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，
- 挑取混合菌落接种至含100 μg/ml氨苄青霉素的小规模LB培养基中，过夜培养，
- 次日用过夜培养物以1:100的比例接种1 L新鲜培养基，
- 将细胞培养至OD600约为0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM以诱导蛋白表达，
- 在37 °C下继续振荡培养3小时，随后通过离心（3,300 g，10分钟）收集细胞，
- 用纯化缓冲液A重悬菌体沉淀，并通过超声破碎细胞，
- 将裂解液离心（39,000 g，40分钟）澄清后，上清液上样至已用纯化缓冲液平衡的肝素柱，
- 采用线性梯度洗脱至1 M NaCl（SeqA在约0.7 M NaCl时洗脱），
- 合并含SeqA的洗脱组分，稀释以降低样品离子强度，然后上样至已用纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱，
- 通过线性盐梯度洗脱，纯化的SeqA在约0.4 M NaCl时洗脱，
- 合并含SeqA的组分，浓缩至3 mg/ml，并储存于储存缓冲液中。
2. DNA 纯化
- 从您常用公司订购互补的未甲基化和甲基化寡核苷酸，
- 将每种冻干的单链DNA 1 μmol溶解于800 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，涡旋混匀并静置10–20分钟，
- 向每种寡核苷酸中加入800 μl预热的2×上样缓冲液，
- 对于长度为20–30个核苷酸的寡核苷酸，制备一块较大的10%变性凝胶（160 × 250 × 1 mm）：
* 每块凝胶中充分混合80 ml 10% PAGE混合液、80 μl TEMED和800 μl过硫酸铵，混匀后灌胶，
* 待凝胶聚合后，取出梳子，并用ddH2O彻底冲洗加样孔，
* 将凝胶安装至凝胶模具中（含冷却板），然后向上下储液槽中加入电泳缓冲液（1× TBE），
* 以700–750 V预电泳，使凝胶温度升至55 °C，
* 停止电泳，并用运行缓冲液彻底冲洗加样孔。 - 将寡核苷酸在90 °C加热2分钟，
- 涡旋混匀样品并短暂离心，立即上样至凝胶，
- 以约700 V电压进行电泳，当寡核苷酸迁移至凝胶中部时停止（注意：在10%聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝与约20个碱基长的寡核苷酸共迁移，二甲苯青FF与约60个碱基长的寡核苷酸共迁移），
- 停止电泳，从电泳槽中拆下凝胶并移除间隔条，
- 在平坦表面上取下一块玻璃板，用保鲜膜覆盖凝胶，
- 将凝胶翻转，取下另一块玻璃板，并用保鲜膜覆盖，
- 使用紫外灯和凝胶后方的荧光板标记条带，以观察DNA阴影，
- 用剃刀将目标条带切下并切成小块，转移至无菌15 ml离心管中，
- 加入9 ml洗脱缓冲液，于37 °C振荡过夜洗脱，
- 用移液枪尖小心将溶液转移至灭菌离心管中，避免转移丙烯酰胺碎片，然后加入1 ml pH 7的3 M醋酸钠（1:10稀释）和25 ml预冷的100%乙醇（2.5倍体积），
- 于-20 °C孵育至少3小时，
- 离心后将上清液转移至另一管中，
- 在中等加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀，
- 将沉淀重悬于400 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，并转移至新离心管，
- 加入40 μl pH 7的3 M醋酸钠和1 ml 100%乙醇；充分混匀（涡旋），室温孵育30分钟，随后于-20 °C孵育30分钟，
- 在18,000 g下离心15分钟，弃去上清液，
- 用100 μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀，以去除残留盐分，在18,000 g下离心6分钟，弃去乙醇，并用真空浓缩仪干燥沉淀，
- 将沉淀重悬于总共100 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，测定寡核苷酸浓度，
- 为退火半甲基化DNA双链，将互补单链以等摩尔浓度混合，在水浴中95 °C加热5分钟，随后让混合物在水浴中缓慢冷却至室温。
3. 蛋白质-DNA 复合物的形成与分析
- 取等体积的纯化 SeqAΔ(41-59)-A25（81 μM）与半甲基化 DNA（81 μM）混合，
- 室温孵育 15 分钟，随后于 4 °C 保存，直至准备使用，
- 使用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒筛选结晶条件，
- 在获得初步结晶苗头后，优化条件以获得可用于衍射的优质晶体，
- 通过将结晶溶液中 PEG 400 的终浓度提高至 25%（v/v），或向结晶溶液中添加 20% 甘油（v/v），对所得的 SeqA-DNA 晶体进行冷冻保护，
- 用尼龙环捞取单个晶体，并在液氮中快速冷冻，
- 在 100 K 条件下检测每颗晶体的衍射能力。
4. 代表性结果
为了获得SeqAΔ(41-59)-A25R与半甲基化DNA结合的晶体结构，我们依次优化了DNA的三个参数：（i）半甲基化GATC序列之间的间隔；（ii）双链的长度；（iii）5'突出端的有无。
电泳迁移率偏移实验表明，SeqAΔ(41-59)-A25R 优先结合间隔为 9-10 个碱基对的 GATC 重复序列（图 1）。因此，我们最初筛选了长度为 23-24 个碱基对（bps）的双链 DNA，其中包含两个半甲基化的 GATC 序列，且两者之间间隔为 9 或 10 个 bps。三种双链产生了形态良好的晶体（图 2）。尽管这些晶体均未达到高分辨率衍射，但长度为 23 个 bps 且两个 GATC 位点间隔为 9 个 bps 的双链衍射 X 射线的效果优于其他样品，表明 9 个 bps 的 GATC 间隔更有利于结晶。因此，我们在后续所有筛选中固定 GATC 位点间的间隔为 9 个 bps。
通常，当双链DNA的长度恰好对应于完整的螺旋圈数时，更有利于其结晶，因为多个DNA分子能够首尾堆叠，从而在晶体中形成连续的B型DNA结构9因此，我们将双链的整体长度缩短至21 bp（即 两个螺旋周期）。尽管具有平末端的21个碱基对（bps）双链未能获得可用于衍射的晶体（数据未显示），但两端各带有一个5'突出核苷酸的21 bps双链却成功获得了晶体，且在我们的实验室X射线源下衍射至5 Å分辨率。衍射极限的改善表明，双链末端之间的相互连接确实在促进晶体堆积。
由于SeqA与位于DNA同一面的GATC序列相互作用，因此DNA双链的另一面应暴露于溶剂中。为了进一步改善该复合物的晶体质量，我们随后修改了双链序列，在两个GATC位点之间引入一个CG二核苷酸，以通过双链的相反面促进相邻DNA分子之间的沟槽-骨架相互作用，该方法此前已被用于增强DNA结晶10。然而，含有CG二核苷酸的双链所生长出的晶体衍射极限与不含CG二核苷酸的类似DNA双链所生长出的晶体相同（图3）。该结果表明，在此情况下沟槽-骨架相互作用并不重要。随后，我们通过比较在每条5'端各增加两个核苷酸的DNA双链所生长的晶体，优化了突出端的长度。这一改变对晶体形态以及衍射极限均产生了显著影响，表明额外的核苷酸显著改变了分子间接触并增强了晶体的有序性（图3）。
SeqAΔ(41-59)-A25R 与最后一条 DNA 双链结合的晶体结构证实，DNA 双链的游离面未参与晶格接触，这与引入 CG 二核苷酸所产生的有限影响相符。尽管蛋白质与 DNA 的相对尺寸较大，但大多数对称相关分子间的相互作用均由蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 相互作用介导（图4）。有趣的是，在此特定情况下，5' 端二核苷酸突出端的有利作用并非源于形成拟连续 DNA 结构，而是因为甲基化链的 5' 端从 DNA 轴向外延伸，并与复合物中相邻的 SeqA 分子发生相互作用，这解释了为何严格需要两个核苷酸才能改变晶体堆积方式8,11。
图1. SeqAΔ(41-59)-A25R与半甲基化DNA的结合。(A) 介导SeqA蛋白寡聚化和DNA结合的结构域示意图。(B) SeqAΔ(41-59)-A25R与含有两个半甲基化GATC序列的DNA进行电泳迁移率变动分析，两个GATC序列之间的碱基对数目（X）逐渐增加。最左侧泳道（标记为Blank）包含等摩尔混合的DNA，其两个GATC序列之间的间隔分别为5、7、12、21、25和34个碱基对，且未加入SeqAΔ(41-59)-A25R。(C) 为获得可用于衍射的晶体，在DNA双链上优化的三个变量示意图。
图2. 改变GATC位点间距的影响。 总结了所使用的寡核苷酸以及通过含有两个半甲基化GATC位点、长度为23-24 bp的双链DNA获得的晶体，其中GATC位点之间相隔9或10个碱基对。所有晶体图像均在相同放大倍数下拍摄，比例尺表示100 μm。每个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA晶体的分辨率极限均基于在Rigaku RU-300 X射线发生器系统上收集的衍射图像确定。 点击此处查看高清大图。
图3. DNA末端变化的影响。 本图总结了所使用的寡核苷酸以及通过包含两个半甲基化GATC位点（相隔9个碱基对）且具有0、1或2个核苷酸5'端突出的21 bp双链DNA获得的晶体。所有晶体图像均在相同放大倍数下拍摄，比例尺表示100 μm。每个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA晶体的分辨率极限基于在NSLS（BNL）的X12C和X29线站收集的衍射图像确定。 点击此处查看高清大图。
图4. SeqAΔ(41-59)-A25R与带有二核苷酸突出端的DNA结合后的晶体堆积结构：从（A）顶部和（B）侧面观察。不对称单元包含两个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA复合物，其中蛋白质以灰色显示，DNA以橙色显示。对称相关的SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA分子中，蛋白质部分以白色显示，DNA部分以黄色显示。本图使用PyMOL12绘制。该图与视频1相关。 点击此处查看高清大图。
视频 1. 点击此处观看视频。
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讨论
大分子X射线晶体学面临的最大挑战之一是获得可用于衍射的高质量晶体。对于蛋白质或蛋白质-DNA复合物而言，由于需要优化的变量更多，这一挑战尤为突出。人们普遍认为，DNA的长度以及是否存在黏性末端以促进相邻DNA分子形成更长的伪双链结构，是需要优化的主要参数。然而，我们已证明，这些黏性末端的性质和长度可能对蛋白质-DNA复合物的晶体堆积产生额外影响。尽管本实验方案最初是为结晶SeqA-DNA复合物而设计，但通过对DNA长度、序列及末端的优化，为任何DNA-蛋白质复合物结晶所用寡核苷酸的理性设计提供了一个通用框架。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢NSLS（布鲁克海文国家实验室）PXRR工作人员在数据收集过程中提供的帮助，以及Monica Pillon在DNA纯化方面的协助。本工作由加拿大卫生研究院（MOP 67189）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Fisher Scientific | E478-500 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| 甘油 | 卡利登 | 5350-1 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Bioshop | SDS001.500 | |
| 尿素 | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | 4°C 下保存 °C |
| 硼酸 | EMD | BX0865-1 | |
| 二甲苯青FF | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0423 | |
| 溴酚蓝 | Bioshop | BR0222 | |
| 双可调垂直电泳系统 | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| 索引结晶筛选 | Hampton Research | HR2-144 | 4°C 下保存 °C |
| Wizard I 结晶筛选试剂盒 | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | 4°C 保存 °C |
| Wizard II 结晶筛选试剂盒 | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | 4°C 下保存 °C |
| 经典结晶筛选实验板 | Qiagen | 130701 | 4°C 保存 °C |
| Intelliplate 培养板 | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
溶液 <强>蛋白纯化缓冲液： 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT 和 5% 甘油 <强>蛋白储存缓冲液： 20 mM TRIS（pH 8）、150 mM NaCl、5 mM DTT、0.5 mM EDTA 和 5% 甘油 <强>上样缓冲液： 加入20 g蔗糖、25 mg溴酚蓝、25 mg二甲苯蓝FF、1 ml 10% w/v SDS和10 ml 10X TBE至70 ml经高压灭菌的ddH₂O中2O. 轻轻加热搅拌，直至蔗糖完全溶解，并用灭菌去离子水定容至 100 ml。2O. 4℃保存 °C. <强>2X 上样缓冲液： 将11 g尿素加入10 ml上样缓冲液中，在加热板上搅拌至尿素完全溶解。分装至2 ml离心管中，4 ℃保存 °C. <强>10X PAGE 混合液： 将420.4 g尿素、100 ml 10× TBE（已高压灭菌）、250 ml 40% 29:1 Bis/丙烯酰胺溶于ddH₂O中2O. 搅拌至完全溶解，并定容至 1 升。4 ℃避光保存。 °C. <强>10X TBE： 溶解<强> 108 g<强> TRIS 55 g，硼酸 55 g，EDTA 9.3 g，溶于 1 升 ddH₂O 中2O. 高压灭菌并在室温下保存。 <强>洗脱缓冲液： 将 8 ml 5 M NaCl、2 ml 1 M TRIS（pH 7.5）、0.4 ml 0.5 M EDTA（pH 8）加入 200 ml ddH₂O 中稀释2O. 高压灭菌并在室温下保存。 |
参考文献
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- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
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