蛋白质–DNA 复合物的晶体结构可为蛋白质的功能、作用机制以及特异性相互作用的性质提供深入见解。本文中，我们报道了如何优化双链 DNA 的长度、序列和末端，以实现与大肠杆菌（Escherichia coli）复制起始负调控因子 SeqA 的共结晶。
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本文内容
摘要
摘要
大肠杆菌（Escherichia coli）SeqA 是 DNA 复制的负调控因子，通过结合复制起点内半甲基化的 GATC 位点簇，阻止复制的过早重新起始1。在复制起点之外，SeqA 也存在于复制叉处，可将新复制的 DNA 组织成更高阶的结构2。SeqA 与单个 GATC 序列的结合较弱，但能与包含多个 GATC 位点的 DNA 双链形成高亲和力复合物。SeqA 的最小功能与结构单元是二聚体，这解释了其与半甲基化 DNA 形成高亲和力复合物至少需要两个 GATC 序列的原因3。此外，SeqA 的结构包含通过柔性连接区分开的寡聚化结构域和 DNA 结合结构域，使其能够结合相隔最多三个螺旋周期的 GATC 重复序列。因此，要在分子水平上理解 SeqA 的功能，必须对 SeqA 与多个 GATC 序列结合的结构进行分析。在蛋白质-DNA 共结晶过程中，DNA 对晶体堆积相互作用的影响可从无到显著，具体取决于蛋白质与 DNA 的相对大小及结构。若蛋白质大于 DNA 或几乎覆盖整个 DNA，则晶体堆积主要由蛋白质-蛋白质相互作用介导。相反，当蛋白质与 DNA 大小相近或更小，或仅覆盖 DNA 的一部分时，晶体堆积则主要由 DNA-DNA 和 DNA-蛋白质相互作用主导。因此，蛋白质-DNA 复合物的结晶需要系统地筛选 DNA 长度4以及 DNA 末端类型（平末端或突出末端）5-7。本报告中，我们描述了如何设计、优化、纯化并结晶包含串联 GATC 重复序列的半甲基化 DNA 双链，使其与一种二聚体形式的 SeqA 变体（SeqAΔ(41-59)-A25R）形成复合物，以获得适用于结构解析的晶体。
方案
1. 蛋白质纯化
SeqA蛋白的N端（寡聚化结构域）与C端（DNA结合结构域）之间由一段柔性连接区相连，有助于识别DNA上相隔一到三个螺旋圈的半甲基化GATC重复序列。在本研究中，我们使用了一种SeqA的二聚体变体（SeqAΔ(41-59)-A25R），其N端结构域含有一个点突变，可阻止进一步的寡聚化，同时连接区较短，使得该蛋白仅能结合DNA上恰好相隔一个螺旋圈的串联GATC重复序列（图1）2,8。
- 将带有T7启动子控制的SeqA编码质粒转化至BL21 (DE3)感受态细胞中，
- 将转化产物涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，
- 挑取混合菌落接种至含100 μg/ml氨苄青霉素的小规模LB培养基中，过夜培养，
- 次日用过夜培养物以1:100的比例接种1 L新鲜培养基，
- 将细胞培养至OD600约为0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM以诱导蛋白表达，
- 在37 °C下继续振荡培养3小时，随后通过离心（3,300 g，10分钟）收集细胞，
- 用纯化缓冲液A重悬菌体沉淀，并通过超声破碎细胞，
- 将裂解液离心（39,000 g，40分钟）澄清后，上清液上样至已用纯化缓冲液平衡的肝素柱，
- 采....
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讨论
大分子X射线晶体学面临的最大挑战之一是获得可用于衍射的高质量晶体。对于蛋白质或蛋白质-DNA复合物而言，由于需要优化的变量更多，这一挑战尤为突出。人们普遍认为，DNA的长度以及是否存在黏性末端以促进相邻DNA分子形成更长的伪双链结构，是需要优化的主要参数。然而，我们已证明，这些黏性末端的性质和长度可能对蛋白质-DNA复合物的晶体堆积产生额外影响。尽管本实验方案最初是为结晶SeqA-DNA复合物而设计，但通过对DNA长度、序列及末端的优化，为任何DNA-蛋白质复合物结晶所用寡核苷酸的理性设计提供了一个通用框架。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢NSLS（布鲁克海文国家实验室）PXRR工作人员在数据收集过程中提供的帮助，以及Monica Pillon在DNA纯化方面的协助。本工作由加拿大卫生研究院（MOP 67189）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Fisher Scientific | E478-500 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| 甘油 | 卡利登 | 5350-1 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Bioshop | SDS001.500 | |
| 尿素 | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | 4°C 下保存 °C |
| 硼酸 | EMD | BX0865-1 | |
| 二甲苯青FF | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0423 | |
| 溴酚蓝 | Bioshop | BR0222 | |
| 双可调垂直电泳系统 | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| 索引结晶筛选 | Hampton Research | HR2-144 | 4°C 下保存 °C |
| Wizard I 结晶筛选试剂盒 | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | 4°C 保存 °C |
| Wizard II 结晶筛选试剂盒 | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | 4°C 下保存 °C |
| 经典结晶筛选实验板 | Qiagen | 130701 | 4°C 保存 °C |
| Intelliplate 培养板 | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
溶液 <强>蛋白纯化缓冲液： 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT 和 5% 甘油 <强>蛋白储存缓冲液： 20 mM TRIS（pH 8）、150 mM NaCl、5 mM DTT、0.5 mM EDTA 和 5% 甘油 <强>上样缓冲液： 加入20 g蔗糖、25 mg溴酚蓝、25 mg二甲苯蓝FF、1 ml 10% w/v SDS和10 ml 10X TBE至70 ml经高压灭菌的ddH₂O中2O. 轻轻加热搅拌，直至蔗糖完全溶解，并用灭菌去离子水定容至 100 ml。2O. 4℃保存 °C. <强>2X 上样缓冲液： 将11 g尿素加入10 ml上样缓冲液中，在加热板上搅拌至尿素完全溶解。分装至2 ml离心管中，4 ℃保存 °C. <强>10X PAGE 混合液： 将420.4 g尿素、100 ml 10× TBE（已高压灭菌）、250 ml 40% 29:1 Bis/丙烯酰胺溶于ddH₂O中2O. 搅拌至完全溶解，并定容至 1 升。4 ℃避光保存。 °C. <强>10X TBE： 溶解<强> 108 g<强> TRIS 55 g，硼酸 55 g，EDTA 9.3 g，溶于 1 升 ddH₂O 中2O. 高压灭菌并在室温下保存。 <强>洗脱缓冲液： 将 8 ml 5 M NaCl、2 ml 1 M TRIS（pH 7.5）、0.4 ml 0.5 M EDTA（pH 8）加入 200 ml ddH₂O 中稀释2O. 高压灭菌并在室温下保存。 |
参考文献
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A.
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