Method Article

考试流式细胞仪检测胸腺阳性和阴性选择

DOI:

10.3791/4269

⸱

October 8th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一种基于流式细胞仪的方法来研究T细胞发育

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

健康的免疫系统需要对外来抗原的T细胞反应，而其余的宽容，以自身抗原。随机重排的T细胞受体（TCR）的α和β位点产生一个具有丰富的多样性，在抗原特异性T细胞库，无论是对自己和国外。安全和有用的T细胞在胸腺发育过程中的曲目的选择是至关重要的。胸腺选择的缺陷的发展，自身免疫性疾病和免疫缺陷病的1-4。

T细胞祖细胞进入胸腺双阴性（DN）胸腺细胞不表达CD4或CD8共受体。 αβTCR和两个共受体的表达发生在双阳性（DP）阶段。互动的自我肽-MHC（住房抵押贷款公司）提出的胸腺细胞的αβTCR确定DP胸腺细胞的命运。高亲和力相互作用导致负选择和消元重刑自反应的胸腺细胞。在积极的选择和发展的CD4或CD8单阳性（SP）T细胞能够识别外来抗原的自我MHC 5低亲和力相互作用的结果。

的阳性筛选可以研究在小鼠的多克隆（野生型）的TCR剧目通过观察成熟T细胞的产生。然而，他们研究的阴性选择，这涉及到删除的小抗原特定人群的理想选择。许多模型系统已被用于研究的阴性选择，但不同的能力复述的生理活动6。例如， 在体外刺激的胸腺细胞缺乏选择是密切参与胸腺环境，而施用外源性抗原可导致非特异性缺失胸腺细胞7-9。目前，最好的工具，研究在体内的负选择，表达一个transg的有老鼠ENIC TCR特异的内源性自身抗原。然而，许多经典的TCR转基因模型的特点是在DN阶段的过早表达的转基因TCRα链，导致过早的负选择。我们的实验室已经开发出了HY的CD4模型，其中转基因HY，TCRα是有条件表示在自行分配学位阶段，让阴性选择过程中发生的DP，SP转型发生在野生型小鼠10。

在这里，我们描述了一个基于流式细胞仪的协议在HY CD4小鼠模型，研究胸腺的阳性和阴性选择。虽然负选择HY CD4小鼠中是高度生理，这些方法还可以被应用到其他的TCR转基因模型。我们也将目前的一般策略分析正选择一个适用于任何转基因操作的小鼠多克隆剧目。

Protocol

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请参阅图1为实验方案的总体方案。

1。解剖

  1. 地方无菌钢丝网屏幕为60 x 15 mm的培养皿中。需要一个单元的每个组织样本。
  2. 每个培养皿中加入5ml的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）。保持在冰上菜。
  3. 安乐死小鼠与CO 2。
  4. 安全小鼠剥离面，腹一面朝上。用70％乙醇进行杀菌，并确保皮草纠结向下喷雾鼠标。
  5. 用手术剪，开始清扫腹切口在腹部以上的生殖器皮肤。向上延长切口到下巴。
  6. 从中线，延长切口，沿四肢。将松弛的皮肤和针剥离面。
  7. 收获的胸腺:
    1. 做一个切口胸骨抬起底尖。
    2. 避免肝脏，切取下的肋骨，然后切肋骨两侧各隔膜。在每边，切肋骨向上照顾，以避免肺和心脏。
    3. 轻轻地拉钳胸腔回来。胸腺是白色的，双叶器官的心脏上方。使用的钳子抓住底部的叶平边，轻轻一拉，胸腺，并把它放在丝网的目数。
  8. 收获脾:
    1. 脾是一个红色，冲浪板形器官位于左侧的老鼠的腹腔内，下面的肝脏上。
    2. 做一个切口进入腹腔。一个钳子轻轻拉出脾，使用第二对逗结缔组织的。放置在一个单独的目筛脾。

2。细胞制备

  1. 使用从3毫升注射器的柱塞，研磨成网状屏幕上，直到只有结缔组织和脂肪的遗体器官。冲洗啮合HBSS中从盘三次。每个组织样本，使用一个新的柱塞。
    1. 代替这种方法可以用在其他可供选择的均质组织。
  2. 使用血球计数仪计数细胞。
  3. 通过离心沉淀细胞在335×g离心5分钟，在4℃下
  4. 重悬浮的脾细胞在500μl的ACK裂解缓冲液（0.15M NH 4 Cl的 ，10 mM的KHCO 3，0.1mM的的Na 2 EDTA，pH7.2）中，在室温下的10分钟。重悬的胸腺细胞，在20×10 6细胞/ ml在FACS缓冲液（PBS，1％FCS，0.02％叠氮化钠），并设置预留在冰上。
  5. 返回通过加入5毫升的HBSS中的脾细胞对等渗。佩莱脾细胞通过离心分离和重新悬浮在20×10 6细胞/ ml在FACS缓冲液中。如果细胞需要保持无菌状态，您可以使用无菌RPMI + 10％FCS。

3。染色细胞流式细胞仪

此协议的目的是，勾勒战略的分析选择使用野生型（WT）和HY CD4小鼠的正面和负面的。流式细胞仪的实验设计，采集，和分析的一般注意事项，请读者一个很好的审查由东等人。

  1. 等分试样4×10 6个每流式细胞仪样品的胸腺细胞的96孔板的各孔，以及1×10 6个 WT脾细胞每补偿控制。如果使用转基因小鼠中，应该包括一个野生型小鼠作为对照在你的实验。
  2. 座和10分钟，在冰上孵育细胞与anti-CD16/32（克隆2.4G2）的Fc受体。
  3. 附带板上，在335×g离心5分钟，在4℃下。取下盖子，消除井液体从弹板后，面朝下放入水槽。重悬于200μl的FACS缓冲液中的各孔中。重复洗涤。
  4. 制备抗体鸡尾酒，列出如下，使用基于稀释于200μlFACS缓冲液，每孔各抗体的最佳浓度。每种抗体的最佳浓度是指，得到最大的分离阳性和阴性的人群所需的最低浓度。如果没有对于一个给定抗体的人口负，应包括合同种型抗体。每孔的总体积可以缩小（ 例如 ，以每孔100μl），如果需要的话。
    1. WT胸腺:抗-TCRβ，抗-CD4，抗-CD8，抗CD69或抗CD5，抗-CD24
    2. HY CD4胸腺:抗-HY TCR（T3.70），抗-CD4，抗-CD8，抗CD69或抗CD5，抗-CD24
      为了获得更好的分离的CD69 lo和CD69 您好种群在胸腺细胞，它是推荐的，可以使用生物素化的抗CD69初级抗体，随后的二次染色含有荧光标记的链霉抗生物素蛋白。我们üCD5染色本质上相同的策略。
  5. 培养细胞的抗体鸡尾酒用200μlFACS缓冲液在冰上30分钟，在黑暗中。
  6. 同时，抗体鸡尾酒染色，染色每个补偿控制一个单一的荧光标记的抗体。在理想的情况下，补偿染色涉及抗体缓冲液中所用的相同的抗体。然而，为每个单独的抗原染色可能不放大的实验中是可行的许多抗原时正在测定。因此，任一抗-CD4或抗-CD8染色建议由于这些抗原高表达，或使用的补偿珠。染色FACS缓冲30分钟冰在黑暗中。保持一个补偿控制不染。
  7. 用FACS缓冲液洗涤细胞两次。
  8. FACS缓冲液悬浮细胞在转移到FACS管。
  9. 流式细胞仪采集样品。包括收购的FSC-A和FSC-W到llow双重歧视。

4。流式细胞仪数据分析 - 非TCR转基因小鼠

我们使用FlowJo流式细胞仪数据分析。请参阅图2A为选通非TCR转基因小鼠的策略。

  1. 使用FSC-A，SSC，电子门上的"细胞"人口。
  2. 在"细胞"的人口，使用FSC-A由FSC-W到电子门的FSC-W LO人口，排除细胞的双峰和aggregrates的。这是"单"门。
  3. 使用"单"门的CD4 CD8，情节的事件。绘制门为DN DP，DP 沉闷 ， 明亮 ，CD4 + CD8 不料 ，CD4SP和的CD8SP人口为描绘在图2B。
  4. 根据CD4SP和CD8SP门，创造的TCRβCD24地块。使用的象限门控工具绘制图2C所示的门。
  5. 创建一个NE在瓦特情节从"单门:TCRβCD69。绘制门A，B，C，D，如在图2D中所示。
  6. 从"单门:TCRβCD5创建另一个情节。绘制门I，II，III，IV所示， 图2E，这是另一种战略研究正选择。
  7. 从"单"应用DN，DP 平淡 ，DP 明亮 ，CD4 诠释 ，CD4SP和CD8SP门门I，II，III，IV，A，B，C，D，E（图2D）。
  8. 计算细胞的数量乘以器官的细胞结构，后续的每一个门的频率，直到您达到您的目标人群中的特定子集。例如，TCRβ 喜 CD69-CD8SP胸腺细胞的数量将取决于胸腺细胞结构的x％TCR BHI CD69（部分D）x％的CD8SP。
    1. 计算已考虑到活细胞和死细胞，所以不包括"淋巴细胞>YTE"门在你的计算。

5。流式细胞仪数据分析 - TCR转基因小鼠

请参阅图3A为TCR转基因小鼠的选通战略。

  1. 在上一节，按照步骤4.1和4.2。
  2. 在"单"门"中，创建一个T3.70 SSC的情节和门上的T3.70 +细胞群体分析抗原特异性T细胞（ 图3B）。在某些情况下，它可能会感兴趣的比较人口非抗原特异性（T3.70-）T细胞群体。
  3. 在T3.70 +人口，抽奖DN，DP，CD4SP和CD8SP门（ 图3C）。
    1. WT对照样品，这些门画下的"单"门创建一个T3.70门，会有极少数T3.70 +细胞。
  4. 在的CD8SP门，创建一个T3.70的CD24情节。使用象限门控工具来将细胞分为四个群体（ 图3F）。
  5. 创建一个叠加的直方图描述CD69的表达野生型小鼠的DP盒和T3.70 + DP室HY CD4小鼠（ 图4A）。重复检查CD5的表达（ 图4B）。
  6. 计算在每个子集的兴趣细胞的绝对数量，如4.8。

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Results

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在生理TCR转基因模型和野生型小鼠，正开始选择在DP 明亮的舞台前，后移动到DP 沉闷的阶段抗原相遇。 DP 沉闷的胸腺细胞，然后进入一个过渡CD4 + CD8 罗的舞台前，成为CD4SP或CD8SP胸腺细胞（ 图2B）。成熟的SP胸腺细胞的特点是高的TCR表达和损失的CD24（ 图2C）。虽然CD8 CD4配置文件可以发现缺陷，积极的选择，检查TCRβCD69或CD5可以提供进一步的洞察的缺陷所在。这两个CD69和CD5 TCR刺激后上调，具有较强的相互作用，推动高表达这些标记。

TCRβCD69情节，门A（TCRβLO CD69-）代表的人口预选DP胸腺细胞，B门（TCRβ 诠释 CD69 +）代表一个transitional人口直接TCR订婚后，门C（TCRβ 喜 CD69 +）的细胞群后直...

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Discussion

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这里提出的协议可以被用来检查非TCR转基因和TCR转基因小鼠中的阳性和阴性选择。此协议描述了表面抗原染色。有关的分子机制的进一步的分析，这是经常需要进行细胞内染色。我们使用了BD Biosciences公司的Cytofix / Cytoperm工具包的大多数细胞内的蛋白质和BD Biosciences公司的Foxp3的染色试剂盒的转录因子。通常，我们获得了我们的样品后，立即染色。然而，样品可以被存储在FACS缓冲液中过夜用1％多聚甲醛在4℃下在黑暗中。要知道，一些荧光染料和抗体与固定可能不兼容。

对于正选择的分析，我们建议使用生物素标记的抗CD69或抗-CD5提供更好的分离人口负，中级和高表达（ 图2）。中所描述的代表结果，这门控战略将有助于区分正选择的缺陷，从血统的承诺，因为这两种可能需要不同的跟进。正选择在除了产生SP胸腺细胞成熟，可以确认通过上调IL-7Rα和CCR7。然而，这些标记物的表达相比，SP胸腺细胞15,16后选择DP胸腺细胞处于较低水平。对于成熟阶段内的DP舱室的详细分析，可以测定细胞内ZAP70表达

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Disclosures

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没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

的作者想感谢张冰，他的技术援助。这项工作是由加拿大卫生研究院的研究（MOP-86595）。 TAB是一个CIHR的新研究者和AHFMR学术。 QH的支持，一个CIHR加拿大研究生奖学金 - 博士和一个AIHS的全日制学籍。 SAN是由英国女王伊丽莎白二世研究生奖学金的支持。 AYWS支持由NSERC - 博士研究生奖学金。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
的试剂的名称 公司 目录编号 评论（可选）
HyClone公司的Hank平衡盐溶液 Thermo Scientific的 SH30030.02
金属网帘 CEDARLANE CX-0080-E-01
皮氏培养皿（60×15毫米） Fisher Scientific则 877221
注射器（3毫升） BD Biosciences公司 309657
锥形管（15毫升） 萨尔斯塔特 62.554.205
显微镜蔡司 - 普里莫之星 415500-00XX-000
血球计数仪豪塞尔科学的 3110
96 - 孔板萨尔斯塔特 82.1582.001
多道移液器 Fisherbrand 21-377-829
胎牛血清的 PAA A15-701
磷酸盐缓冲盐水 Fisher Scientific则 SH3025802
叠氮化钠 IT贝克化工有限公司 V015-05
Fc受体阻断剂克隆2.4G2
ANTI-MOUSE HY TCR eBioscience公司 XX-9930-YY * 克隆T3.70
抗小鼠CD4 eBioscience公司 XX-0042-YY * 克隆RM4-5
一NTI鼠标CD8α eBioscience公司 XX-0081-YY * 克隆53-6.7
ANTI-MOUSE CD24 eBioscience公司 XX-0242-YY * 克隆M1/69
抗鼠TCRβ eBioscience公司 XX-5961-YY * 克隆H57-597
ANTI-MOUSE CD69生物素 eBioscience公司 13-0691-YY * 克隆H1.2F3
抗鼠CD5生物素 eBioscience公司 13-0051-YY * 克隆53-7.3
链霉亲和素 eBioscience公司 XX-4217-YY *
流式细胞仪 BD Biosciences公司 - FACS坎托 338962
FACS管 BD Biosciences公司 352052
流式细胞仪分析软件 TreeStar - Flowjo FlowJo V7 / 9
胎牛血清RPMI - 1640 Thermo Scientific的 SH30027.01

* XX不同的荧光染料和YY的瓶大小的变化而变化。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23(2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

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