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方法文章

通过流式细胞术检测胸腺阳性与阴性选择

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DOI：

10.3791/4269

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2012年10月8日

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种基于流式细胞术的方法来检测T细胞发育 体内 使用遗传修饰小鼠，其背景为野生型或T细胞受体转基因型。

摘要

健康的免疫系统需要T细胞对外源性抗原产生应答，同时对自身抗原保持耐受。T细胞受体（TCR）α和β基因座的随机重排，产生出具有广泛抗原特异性的T细胞库，能够识别自身和外源抗原。在胸腺发育过程中对这一T细胞库进行选择，对于生成安全且具有功能的T细胞至关重要。胸腺选择过程中的缺陷可导致自身免疫性疾病和免疫缺陷病的发生1-4。

T细胞前体以不表达CD4或CD8共受体的双阴性（DN）胸腺细胞形式进入胸腺。αβTCR及两种共受体的表达发生在双阳性（DP）阶段。DP胸腺细胞的αβTCR与胸腺细胞所呈递的自身肽-MHC（pMHC）复合物之间的相互作用决定了其命运。高亲和力的相互作用导致阴性选择，从而清除自身反应性胸腺细胞；低亲和力的相互作用则引发阳性选择，促进发育为能够识别由自身MHC呈递的外来抗原的CD4或CD8单阳性（SP）T细胞5。

可通过观察成熟T细胞的生成来在具有多克隆（野生型）TCR库的小鼠中研究阳性选择。然而，由于阴性选择涉及抗原特异性细胞亚群的删除，这些小鼠并非研究阴性选择的理想模型。尽管已有多种模型系统被用于研究阴性选择，但它们在模拟生理过程方面的能力各不相同。6例如， 体外 胸腺细胞的刺激缺乏与选择过程密切相关的胸腺微环境，而外源性抗原的给予可能导致胸腺细胞的非特异性清除7-9目前，研究的最佳工具是 体内 阴性选择是指表达针对内源性自身抗原的转基因T细胞受体（TCR）的小鼠。然而，许多经典的TCR转基因模型在双阴性（DN）阶段即过早表达转基因TCRα链，导致过早发生阴性选择。本实验室已开发出HYcd4 模型中，转基因HY TCRα在双阳性（DP）阶段条件性表达，使得阴性选择可在DP向单阳性（SP）过渡期间发生，如同在野生型小鼠中所见10.

本文介绍了一种基于流式细胞术的实验方案，用于检测HYcd4小鼠模型中的胸腺阳性选择和阴性选择。尽管HYcd4小鼠中的阴性选择具有高度生理相关性，但这些方法也可应用于其他TCR转基因模型。我们还将介绍适用于任何基因修饰小鼠的、针对多克隆T细胞受体库中阳性选择的一般分析策略。

方案

请参见图1，了解实验方案的整体示意图。

1. 解剖

  1. 将无菌钢网筛放入60 × 15 mm的培养皿中。每个组织样本需使用一个单位。
  2. 向每个培养皿中加入5 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）。将培养皿置于冰上保存。
  3. 用CO2处死小鼠。
  4. 将小鼠固定在解剖台上，腹面朝上。用70%乙醇喷洒小鼠体表以进行消毒，并确保毛发贴服。
  5. 使用手术剪，从腹部生殖器上方开始，沿腹中线做一纵向切口，向上延伸至下颌。
  6. 从腹中线开始，将切口沿四肢方向向下延伸。将松动的皮肤向后拉开，并用针固定在解剖台上。
  7. 取材胸腺：
    1. 提起胸骨底部末端，进行切开。
    2. 避开肝脏，剪断膈肌以分离胸廓，然后向两侧剪开肋骨。沿两侧向上剪开胸廓时，注意避免损伤肺和心脏。
    3. 用镊子轻轻向后拉开肋骨。胸腺为位于心脏上方的白色双叶状器官。用镊子的平边夹住叶状结构的底部，轻轻取出胸腺并置于网筛上。
  8. 取材脾脏：
    1. 脾脏为红色、冲浪板状的器官，位于小鼠腹腔左侧，肝脏下方。
    2. 切开腹腔，用一对镊子轻轻拉出脾脏，同时用另一对镊子分离周围结缔组织。将脾脏置于另一个独立的网筛上。

2. 细胞制备

  1. 使用3 ml注射器的推杆，将器官在滤网筛上研磨，直至仅剩结缔组织和脂肪。用培养皿中的HBSS冲洗滤网三次。每个组织样本均需使用新的推杆。
    1. 也可采用其他组织匀浆方法替代本方法。
  2. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  3. 在4 °C条件下，以335 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
  4. 将脾细胞重悬于500 μl ACK裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2）中，室温孵育10分钟。将胸腺细胞以20 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于FACS缓冲液（PBS, 1% FCS, 0.02%叠氮化钠）中，并置于冰上备用。
  5. 加入5 ml HBSS以恢复脾细胞的等渗环境。离心使脾细胞沉淀，然后以20 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于FACS缓冲液中。若需保持细胞无菌，可使用无菌RPMI + 10% FCS。

3. 流式细胞术的细胞染色

本实验方案旨在概述利用野生型（WT）和HYcd4小鼠分析正向选择和负向选择的策略。关于流式细胞术实验设计、数据采集和分析的一般性考虑，我们推荐读者参考Tung et al.11撰写的一篇优秀综述。

  1. 将每份流式细胞术样品 4 × 106 个胸腺细胞分装至 96 孔板的各个孔中，同时每份补偿对照加入 1 × 106 个野生型（WT）脾细胞。若使用转基因小鼠，实验中应包含一只野生型小鼠作为对照。
  2. 在冰上用抗 CD16/32 抗体（克隆号 2.4G2）孵育细胞 10 分钟，以阻断 Fc 受体。
  3. 在 4 °C 下以 335 × g 离心 5 分钟。取下盖子，将板倒扣于水槽中轻弹一次，去除孔中液体。每孔用 200 μl FACS 缓冲液重悬细胞，重复洗涤一次。
  4. 按以下列表配制抗体混合液，根据每种抗体在每孔 200 μl FACS 缓冲液中的最佳稀释浓度进行添加。每种抗体的最佳浓度定义为能够使阳性与阴性细胞群分离最明显的最低浓度。若某抗体无明确的阴性细胞群，应包含同型对照抗体。如有需要，每孔总体积可按比例减少（例如减少至每孔 100 μl）。
    1. 野生型胸腺：抗 TCRβ、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD69 或抗 CD5、抗 CD24
    2. HYcd4 胸腺：抗 HY TCR（T3.70）、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD69 或抗 CD5、抗 CD24
      为更好地区分胸腺细胞中 CD69lo 与 CD69hi 细胞群，建议使用生物素标记的抗 CD69 一抗，随后用荧光染料偶联的链霉亲和素进行二抗染色。我们对 CD5 染色也采用相同策略。
  5. 在冰上避光条件下，用 200 μl 抗体混合液与细胞在 FACS 缓冲液中孵育 30 分钟。
  6. 在进行抗体混合液染色的同时，使用单一荧光染料偶联的抗体对每个补偿对照进行染色。理想情况下，补偿染色应使用与抗体混合液中相同的抗体。然而，在检测多个抗原的大规模实验中，对每个单独抗原进行染色可能不可行。因此，建议选择表达水平较高的抗 CD4 或抗 CD8 抗体进行补偿染色，或使用补偿微珠。在冰上避光条件下用 FACS 缓冲液染色 30 分钟。保留一份补偿对照不进行染色。
  7. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。
  8. 将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，并转移至流式管中。
  9. 在流式细胞仪上获取样品数据。应包含 FSC-A 和 FSC-W 参数，以便区分单细胞与双联体细胞。

4. 流式细胞术数据分析——非 TCR 转基因小鼠

我们使用 FlowJo 进行流式细胞术数据分析。有关非 TCR 转基因小鼠的设门策略，请参见图 2A。

  1. 使用FSC-A对SSC进行电子门控，圈出“淋巴细胞”群体。
  2. 在“淋巴细胞”群体内，使用FSC-A对FSC-W进行电子门控，圈出FSC-Wlo群体，以排除细胞双联体和聚集体。此为“单细胞”门控。
  3. 基于“单细胞”门控内的事件，绘制CD8对CD4的散点图。按照图2B所示，圈出DN、DP弱表达、DP强表达、CD4+CD8低表达、CD4SP和CD8SP群体。
  4. 在CD4SP和CD8SP门控下，创建TCRβ对CD24的图。使用象限门控工具，按照图2C所示绘制门控。
  5. 从“单细胞”门控创建一个新的图：TCRβ对CD69。按照图2D所示，绘制门控A、B、C、D。
  6. 从“单细胞”门控再创建一个图：TCRβ对CD5。按照图2E所示，绘制门控i、ii、iii、iv。这是另一种分析阳性选择的策略。
  7. 将来自“单细胞”门控下的DN、DP弱表达、DP强表达、CD4中等表达、CD4SP和CD8SP门控，应用于门控i、ii、iii、iv以及A、B、C、D（图2D, E）。
  8. 通过将器官细胞总数乘以各后续门控的频率，计算特定亚群中的细胞数量，直至达到目标群体。例如，TCRβ高表达CD69- CD8SP胸腺细胞的数量可通过胸腺细胞总数 × %TCRβ高表达CD69-（D组分）× %CD8SP计算得出。
    1. 计数时已考虑活细胞与死细胞比例，因此在计算中无需包含“淋巴细胞”门控。

5. 流式细胞术数据分析——TCR转基因小鼠

请参见图3A中的门控策略，适用于TCR转基因小鼠。

  1. 按照前一节中的步骤 4.1 和 4.2 操作。
  2. 在“单细胞”门内，创建一个基于 SSC 的 T3.70 图，并圈选 T3.70+ 细胞群以分析抗原特异性 T 细胞（图 3B）。在某些情况下，可能需要将该细胞群与非抗原特异性（T3.70-）T 细胞群进行比较。
  3. 在 T3.70+ 细胞群内，圈选 DN、DP、CD4SP 和 CD8SP 门（图 3C）。
    1. 对于野生型对照样本，可在“单细胞”门下圈选这些门，或创建一个 T3.70- 门，因为 T3.70+ 细胞数量极少。
  4. 在 CD8SP 门下，创建一个 T3.70 与 CD24 的散点图。使用象限圈门工具将细胞分为四个群体（图 3F）。
  5. 创建叠加直方图，显示野生型小鼠 DP 区室与 HYcd4 小鼠 T3.70+ DP 区室中 CD69 的表达情况（图 4A）。重复此操作以检测 CD5 的表达（图 4B）。
  6. 按照步骤 4.8 的方法，计算各目标亚群中细胞的绝对数量。

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结果

在生理性TCR转基因模型和野生型小鼠中，阳性选择始于DPbright阶段，在接触抗原后进入DPdull阶段。DPdull胸腺细胞随后进入一个过渡性的CD4+CD8lo阶段，之后分化为CD4SP或CD8SP胸腺细胞（图2B）。成熟的SP胸腺细胞的特征是TCR高表达并丢失CD24（图2C）。虽然CD8与CD4的表达谱可以揭示阳性选择中的缺陷，但分析TCRβ与CD69或CD5的表达关系可进一步明确缺陷发生的阶段。CD69和CD5均在TCR刺激后上调表达，较强的TCR相互作用会驱动这些标志物更高水平的表达。

在TCRβ与CD69图中，门控A（TCRβloCD69-）代表选择前的双阳性胸腺细胞群体，门控B（TCRβintCD69+）代表TCR结合后直接产生的过渡群体，门控C（TCRβhiCD69+）代表阳性选...

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讨论

本文所述方案可用于研究非 TCR 转基因小鼠和 TCR 转基因小鼠中的阳性与阴性选择。该方案描述了表面抗原的染色方法。若需进一步分析分子机制，通常需要进行细胞内染色。对于大多数细胞内蛋白，我们使用 BD Biosciences 的 Cytofix/Cytoperm 试剂盒；对于转录因子，则使用 BD Biosciences 的 Foxp3 染色试剂盒。我们通常在染色后立即上机获取样本。然而，样本也可在含有 1% 甲醛的 FACS 缓冲液中于 4 °C 避光保存过夜。需注意，某些荧光染料和抗体可能与固定步骤不兼容。

对于阳性选择的分析，我们建议使用生物素标记的抗CD69或抗CD5抗体，以更好地分离阴性、中等表达和高表达的细胞群体（图2）。如代表性结果所述，该设门策略有助于区分阳性选择缺陷与谱系承诺异常，因为这两者可能需要不同的后续分析。除了产生成熟的单阳性（SP）胸腺细胞外，阳性选择还可通过IL-7Rα和CCR7的上调来确认。然而，与单阳性胸腺细胞相比，这些标志物在经历阳性选择后的双阳性（DP）胸腺细胞上表达水平较低15,16。...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Bing Zhang 提供的技术支持。本工作由加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research，资助号：MOP-86595）资助。T.A.B. 为加拿大卫生研究院新研究员和阿尔伯塔健康基金会（AHFMR）学者。Q.H. 获加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金（博士）和阿尔伯塔创新健康科学基金会（AIHS）全日制学生奖学金资助。S.A.N. 获伊丽莎白二世女王研究生奖学金资助。A.Y.W.S. 获自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金（博士）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HyClone Hank's 平衡盐溶液Thermo ScientificSH30030.02
金属网筛CedarlaneCX-0080-E-01
培养皿（60 × 15 mm）Fisher Scientific877221
注射器（3 ml）BD Biosciences309657
锥形离心管（15 ml）Sarstedt62.554.205
显微镜Zeiss - Primo Star415500-00XX-000
血细胞计数板Hausser Scientific3110
96 孔板Sarstedt82.1582.001
多通道移液器Fisherbrand21-377-829
胎牛血清PAAA15-701
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificSH3025802
叠氮化钠IT Baker Chemical Co.V015-05
FcR 封闭试剂克隆号 2.4G2
抗小鼠 HY TCR 抗体eBioscienceXX-9930-YY*克隆号 T3.70
抗小鼠 CD4 抗体eBioscienceXX-0042-YY*克隆号 RM4-5
抗小鼠 CD8α 抗体eBioscienceXX-0081-YY*克隆号 53-6.7
抗小鼠 CD24 抗体eBioscienceXX-0242-YY*克隆号 M1/69
抗小鼠 TCRβ 抗体eBioscienceXX-5961-YY*克隆号 H57-597
生物素标记的抗小鼠 CD69 抗体eBioscience13-0691-YY*克隆号 H1.2F3
生物素标记的抗小鼠 CD5 抗体eBioscience13-0051-YY*克隆号 53-7.3
链霉亲和素eBioscienceXX-4217-YY*
流式细胞仪BD Biosciences - FACS Canto338962
FACS 管BD Biosciences352052
流式细胞术分析软件TreeStar - FlowjoFlowJo v7/9
HyClone RPMI - 1640 培养基Thermo ScientificSH30027.01

*XX 根据荧光染料不同而变化，YY 根据瓶装规格不同而变化。

参考文献

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