本文及随附视频介绍了我们利用类器官单元-支架法在小鼠中生成组织工程化肠道的实验方案。
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本文内容
摘要
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组织工程小肠（TESI）已成功用于挽救接受大段小肠切除术后的Lewis大鼠，使其在40天内恢复至术前体重。1 在人类中，大段小肠切除可导致短肠综合征，这是一种功能性吸收不良状态，伴随显著的发病率、死亡率以及医疗负担，包括依赖肠外营养、肝功能衰竭和肝硬化，以及多脏器移植的需求。2 本文中，我们描述并记录了在小鼠模型中采用“支架上多细胞类器官单元”方法构建组织工程肠的实验方案。类器官单元是由肠道组织来源的多细胞聚集体，包含黏膜和间充质成分，3 二者之间的相互作用可维持肠干细胞微环境的稳定。4 在持续及未来的研究中，将该技术转移至小鼠模型将有助于利用该物种中可用的转基因工具，深入探究TESI形成过程中的相关机制。5 免疫缺陷小鼠品系的可获得性，也将使我们能够将该技术应用于人肠道组织，并在向临床转化之前，通过小鼠异种移植模型优化人源TESI的构建。本方法采用符合良好生产规范（GMP）且已获准用于人体患者的试剂和材料，因此相较于依赖脱细胞动物组织的方法具有显著优势。该技术的最终目标是将其转化为面向人类的再生医学治疗策略，用于治疗短肠综合征。
方案
1. 类器官单位的制备
- 用于小鼠解剖的器械（剪刀和镊子）应通过高压灭菌器进行灭菌。
- 根据当地IACUC规程人道处死供体小鼠。确保动物已死亡后再进行后续操作。
- 沿中线做切口以进入腹腔。可根据需要翻转皮瓣以改善暴露视野。
- 取出小肠并将其在屈氏韧带远端稍远处切断。使用锐性与轻柔的钝性分离法将小肠与其系膜分离。辨认回盲部连接处，并在此处近端5 mm位置切断小肠。
- 用剪刀在含有10 ml 4 °C无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA）/1X抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti, Invitrogen）的培养皿中沿对系膜缘纵向切开肠道。通过轻柔振荡清除肠腔内的粪便物质，然后将打开的肠道转移至含有10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti的15 ml离心管中。
- 在试管中用10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti对打开的肠道清洗三次，每次清洗可通过轻轻振荡15 ml离心管30秒完成。振荡后，肠组织会沉降至管底。弃去漂浮物（即间充质碎片），并用移液器小心移除洗涤液。
- 在含有10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti的培养皿中，用剪刀将清洗后的肠道剪切成小于1 mm²的小块。使用自动移液器收集剪碎的组织，并将其转移至试管中。
- 以500 rpm离心8分钟。弃去上清液（....
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结果
图1展示了本文所记录方案的整体示意图。该方案的最终结果是形成一种具有腔体、黏膜层、黏膜下层及周围肌层的组织工程小鼠肠道球状或类球形结构。图2A显示了一个典型的球状结构，与起始的聚合物支架进行对比。图2B展示了同一结构被精确地沿中线剖开，以暴露其内部腔体。图3展示了一个典型的成功构建物在培养4周后经苏木精/伊红染色的石蜡包埋横截面。在参考文献4中，我们成功构建组织工程肠道的比例达到89%（44个植入物中成功39个）。
失败的构建物是指未形成黏膜的组织。在收获时仅通过肉眼观察无法判断组织整体在最终的组织学分析中是否含有黏膜。因此，若对新鲜构建组织进行生化检测，应将每个组织球体的一半固定并包埋于石蜡中，用于组织学分析，以确认每个样本中均存在黏膜。失败的构建物在苏木精/伊红染色中仅显示间质和纤维化。
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讨论
我们介绍一种利用类器官单元-支架法在小鼠中制备组织工程化肠道的实验方案。其中最关键的步骤是类器官单元的制备。必须仔细彻底地清洗并进行机械处理组织，但在消化完成后（步骤1.11），同样需格外注意避免过度消化或过度吹打类器官单元。若操作过度，类器官单元可能被分解为单个细胞，这些细胞将在步骤1.12的上清液中丢失，且难以存活并形成组织工程化肠道，因为此时肠道干细胞微环境将无法得以保留。
小鼠体型较小，直接将组织工程构建物与宿主动物的肠道进行吻合以测试其功能具有挑战性 体内或者，大鼠可作为TESI生长的较大动物模型，有利于 体内 吻合术，且已因该原因完成1然而，小鼠的体型并非不可克服的障碍，已有研究者成功实施了小肠切除及吻合术。6 或肛肠手术，7 在这些动物中。为了解决这些问题，需开展实验以表征我们所构建的组织工程化肠道在体内的功能 体外 时尚领域正在进行中。该技术的其他局限性包括生成组织工程小肠（TESI）的成功率为89%4也就是说，89%.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
Tracy C. Grikscheit、Erik R. Barthel 和 Frédéric G. Sala 获加利福尼亚再生医学研究所（CIRM）资助，资助编号为 RN2-00946-1（TCG）和 TG2-01168（ERB、FGS）。Allison L. Speer 是大学外科医师学会 Ethicon 学者。Yashuhiro Torashima 由洛杉矶儿童医院 Saban 研究所研究职业发展奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| 抗生素-抗真菌素 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| 中性蛋白酶（Dispase） | Gibco | 17105-041 | |
| Ⅰ型胶原酶 | Worthington | LS004194 | |
| 高糖 DMEM 1X | Gibco | 11995-065 | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | 用于聚合物制备，参见参考文献4 |
| 聚-L-乳酸 | Durect | B6002-1 | 用于聚合物制备，参见参考文献4 |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | 用于聚合物制备，参见参考文献4 |
| 酮洛芬 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 啮齿类动物饲料 | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg 每 5 ml，USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| 异氟烷，USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
参考文献
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem....
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重印与许可
