小鼠模型中肠道的组织工程

摘要

本文及随附视频介绍了我们利用类器官单元-支架法在小鼠中生成组织工程化肠道的实验方案。

摘要

组织工程小肠（TESI）已成功用于挽救接受大段小肠切除术后的Lewis大鼠，使其在40天内恢复至术前体重。¹ 在人类中，大段小肠切除可导致短肠综合征，这是一种功能性吸收不良状态，伴随显著的发病率、死亡率以及医疗负担，包括依赖肠外营养、肝功能衰竭和肝硬化，以及多脏器移植的需求。² 本文中，我们描述并记录了在小鼠模型中采用“支架上多细胞类器官单元”方法构建组织工程肠的实验方案。类器官单元是由肠道组织来源的多细胞聚集体，包含黏膜和间充质成分，³ 二者之间的相互作用可维持肠干细胞微环境的稳定。⁴ 在持续及未来的研究中，将该技术转移至小鼠模型将有助于利用该物种中可用的转基因工具，深入探究TESI形成过程中的相关机制。⁵ 免疫缺陷小鼠品系的可获得性，也将使我们能够将该技术应用于人肠道组织，并在向临床转化之前，通过小鼠异种移植模型优化人源TESI的构建。本方法采用符合良好生产规范（GMP）且已获准用于人体患者的试剂和材料，因此相较于依赖脱细胞动物组织的方法具有显著优势。该技术的最终目标是将其转化为面向人类的再生医学治疗策略，用于治疗短肠综合征。

方案

1. 类器官单位的制备

1. 用于小鼠解剖的器械（剪刀和镊子）应通过高压灭菌器进行灭菌。
2. 根据当地IACUC规程人道处死供体小鼠。确保动物已死亡后再进行后续操作。
3. 沿中线做切口以进入腹腔。可根据需要翻转皮瓣以改善暴露视野。
4. 取出小肠并将其在屈氏韧带远端稍远处切断。使用锐性与轻柔的钝性分离法将小肠与其系膜分离。辨认回盲部连接处，并在此处近端5 mm位置切断小肠。
5. 用剪刀在含有10 ml 4 °C无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA）/1X抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti, Invitrogen）的培养皿中沿对系膜缘纵向切开肠道。通过轻柔振荡清除肠腔内的粪便物质，然后将打开的肠道转移至含有10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti的15 ml离心管中。
6. 在试管中用10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti对打开的肠道清洗三次，每次清洗可通过轻轻振荡15 ml离心管30秒完成。振荡后，肠组织会沉降至管底。弃去漂浮物（即间充质碎片），并用移液器小心移除洗涤液。
7. 在含有10 ml 4 °C无菌HBSS / 1X Anti-Anti的培养皿中，用剪刀将清洗后的肠道剪切成小于1 mm²的小块。使用自动移液器收集剪碎的组织，并将其转移至试管中。
8. 以500 rpm离心8分钟。弃去上清液（其中含有脂肪和间充质成分）。
9. 用10 ml无菌HBSS / 1X Anti-Anti，加入0.125 mg/ml分散酶（dispase, Invitrogen）和800 单位/ml I型胶原酶（collagenase type 1, Worthington, Lakewood NJ）消化剪碎并清洗过的组织。配制40 ml消化液时，称取5 mg分散酶和142 mg胶原酶，加无菌HBSS定容至40 ml。每次制备类器官单位时均需新鲜配制该溶液，并在使用前保持于4 °C。将消化液直接加入第1.8步所得沉淀中。
10. 将含有剪碎组织和消化液的试管在37 °C孵育20分钟。
11. 取出试管，使用10 ml移液器反复吹打20至50次，进一步破坏消化后的组织，直至获得均匀的悬液。
12. 以800 rpm离心5分钟。弃去上清液（其中含有单个细胞）。
13. 加入10 ml 4 °C无菌DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基, Invitrogen）并添加10% v/v热灭活胎牛血清（HI-FBS, Invitrogen）以终止消化反应。重悬沉淀并轻轻振荡试管。
14. 以800 rpm离心5分钟。用自动移液器小心吸除上清液，直至最后几滴。最后少量液体使用一次性塑料移液器移除，以避免重新悬浮沉淀。

2. 聚乙醇酸支架的加载

1. 制备长2 mm、外径5 mm的圆柱形支架，采用无纺聚乙醇酸材料（片材厚度2 mm，体密度60 mg cm⁻³，孔隙率 > 95%，Concordia Fibers，Coventry RI）如参考文献4所述。
2. 用经70%乙醇水溶液处理过的剪刀，修剪一次性1,000微升移液器吸头的远端2毫米。
3. 将支架放入4孔培养板中。使用1,000微升移液器将类器官单元接种到支架上，先注入管腔内，再接种至外表面。用镊子确保管腔内壁被充分覆盖。注意不要破坏或折断聚合物的圆柱形结构。

3. 植入宿主小鼠

1. 若可获得，应使用与供体小鼠遗传背景相同的同源宿主小鼠；否则，采用免疫缺陷型非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠（Jackson Laboratories, Sacramento CA）。
2. 使用异氟烷诱导全身麻醉。剃除小鼠腹部毛发，进行术前消毒并铺巾。
3. 沿中线做5 mm切口，进入腹腔。辨认大网膜并小心将其移出腹腔外。将装载有聚合物的材料置于大网膜上，并用组织包裹。切勿撕裂大网膜。
4. 用5-0单丝缝线将聚合物固定于大网膜。轻柔地将包裹聚合物的大网膜复位至其解剖位置。
5. 逐层使用4-0薇乔缝线关闭腹部切口。缝合肌肉层时采用连续缝合，注意避免损伤切口下方的腹腔内脏器。皮肤采用间断缝合。
6. 术后镇痛使用2 mg/kg的酮洛芬（Ketofen，Fort Dodge Animal Health）溶于无菌水，于切口附近皮下注射形成皮丘。动物应每天评估，若出现疼痛或痛苦迹象，可在术后第2天追加一次酮洛芬剂量。至术后第3天，动物应完全恢复，无疼痛或痛苦表现。若术后第3天仍持续存在疼痛或痛苦，视为异常情况，应根据IACUC及动物护理机构的规程进行处理。
7. 让小鼠恢复并使组织工程化肠道生长四周。在此期间给予动物 随意 可自由获取啮齿类动物饲料（Lab Diet 5001，PMI Nutrition，St. Louis，MO）和水，水中加入复方新诺明（Septra 200 mg / 40 mg / 5 ml，Hi-Tech Pharmacal，Amityville，NY），按1:100稀释。

4. 收获

1. 植入后四周，人道处死宿主动物。
2. 重新打开原切口，将皮肤向头侧翻起，以方便进入腹腔。
3. 切开肌层，识别组织工程构建物为一团组织。
4. 使用锐性分离法解除腹腔内脏器与构建物之间的粘连。
5. 将构建物用福尔马林固定，用于后续石蜡包埋，或直接使用新鲜组织进行生化检测，如实时PCR或蛋白质提取。

结果

图1展示了本文所记录方案的整体示意图。该方案的最终结果是形成一种具有腔体、黏膜层、黏膜下层及周围肌层的组织工程小鼠肠道球状或类球形结构。图2A显示了一个典型的球状结构，与起始的聚合物支架进行对比。图2B展示了同一结构被精确地沿中线剖开，以暴露其内部腔体。图3展示了一个典型的成功构建物在培养4周后经苏木精/伊红染色的石蜡包埋横截面。在参考文献4中，我们成功构建组织工程肠道的比例达到89%（44个植入物中成功39个）。

失败的构建物是指未形成黏膜的组织。在收获时仅通过肉眼观察无法判断组织整体在最终的组织学分析中是否含有黏膜。因此，若对新鲜构建组织进行生化检测，应将每个组织球体的一半固定并包埋于石蜡中，用于组织学分析，以确认每个样本中均存在黏膜。失败的构建物在苏木精/伊红染色中仅显示间质和纤维化。

讨论

我们介绍一种利用类器官单元-支架法在小鼠中制备组织工程化肠道的实验方案。其中最关键的步骤是类器官单元的制备。必须仔细彻底地清洗并进行机械处理组织，但在消化完成后（步骤1.11），同样需格外注意避免过度消化或过度吹打类器官单元。若操作过度，类器官单元可能被分解为单个细胞，这些细胞将在步骤1.12的上清液中丢失，且难以存活并形成组织工程化肠道，因为此时肠道干细胞微环境将无法得以保留。

小鼠体型较小，直接将组织工程构建物与宿主动物的肠道进行吻合以测试其功能具有挑战性 体内或者，大鼠可作为TESI生长的较大动物模型，有利于 体内 吻合术，且已因该原因完成¹然而，小鼠的体型并非不可克服的障碍，已有研究者成功实施了小肠切除及吻合术。⁶ 或肛肠手术，⁷ 在这些动物中。为了解决这些问题，需开展实验以表征我们所构建的组织工程化肠道在体内的功能 体外 时尚领域正在进行中。该技术的其他局限性包括生成组织工程小肠（TESI）的成功率为89%⁴也就是说，89%...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HBSS	Gibco	114170-112
抗生素-抗真菌素 100X	Invitrogen	15240-062
中性蛋白酶（Dispase）	Gibco	17105-041
Ⅰ型胶原酶	Worthington	LS004194
高糖 DMEM 1X	Gibco	11995-065
热灭活胎牛血清（FBS）	Invitrogen	16140-071
Biofelt 100% PGA	Concordia Medical	FELT01-1005	用于聚合物制备，参见参考文献4
聚-L-乳酸	Durect	B6002-1	用于聚合物制备，参见参考文献4
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	用于聚合物制备，参见参考文献4
酮洛芬 100 mg/ml	Fort Dodge Animal Health	71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 啮齿类动物饲料	LabDiet	5001
Septra 200 mg / 40 mg 每 5 ml，USP	Hi-Tech Pharmacal	50383-824-16
异氟烷，USP	Phoenix Pharmaceuticals	57319-507-06