成功使用细胞示踪染料来监测免疫细胞功能和增殖涉及多个关键步骤。我们描述了以下方法：1）使用膜染料获得明亮、均一且可重复的标记；2）选择荧光染料及数据采集条件；3）选择基于染料稀释的细胞增殖定量模型。
本文内容
摘要
摘要
荧光细胞示踪染料结合流式细胞术和成像细胞术，是研究不同类型细胞间相互作用及其命运的有力工具 体外 和 体内.1-5 尽管使用此类染料的出版物实际上已有数千篇，但一些最常见的细胞示踪应用包括对以下方面的监测：
- 干细胞与祖细胞的静息、增殖和/或分化6-8
- 抗原驱动的膜转移9 和/或前体细胞增殖3,4,10-18 以及
- 免疫调节与效应细胞功能1,18-21。
市面上可购得的细胞示踪染料在化学性质和荧光特性上差异较大，但绝大多数根据其细胞标记机制可分为两类。“膜染料”以PKH26为代表，是一类高度亲脂性的染料，能够稳定地但以非共价方式分配进入细胞膜1,2,11。“蛋白染料”以CFSE为代表，是一类可与氨基反应的染料，能与细胞蛋白形成稳定的共价键4,16,18。这两类染料各有其优势与局限性。因此，成功使用这些染料的关键——尤其是在多色实验中需同时使用多种染料追踪不同细胞类型时——在于理解影响每类染料最佳应用的核心问题2-4,16,18,24。
本文所述方案强调了使用细胞示踪染料时导致结果不佳或不一致的三个常见原因。这些原因是：
- 无法实现明亮、均匀且可重复的标记。这是任何细胞示踪研究的必要起点，但在使用膜染料时，需关注的变量与使用蛋白染料或抗体等平衡结合试剂时有所不同。
- 荧光染料组合次优和/或未包含关键的补偿对照。示踪染料的荧光强度通常比抗体荧光强 102 - 103 倍。因此，必须验证示踪染料的存在不会影响对其他探针信号的检测能力。
- 无法获得峰拟合软件的良好拟合结果。此类软件可基于前体细胞频率或其他指标，对不同细胞群体或刺激条件下的增殖反应进行定量比较。然而，获得良好拟合需要排除可能扭曲染料稀释曲线的死亡/将死细胞，并确保模型的假设与实际观察到的染料稀释曲线特征相匹配。
此处给出的示例说明了在使用膜染料和/或蛋白质染料监测细胞增殖时，这些变量如何影响实验结果。
方案
1. 使用PKH26细胞示踪染料进行细胞膜的一般性标记（参考文献25；图1）
- 在步骤 1.1 至 1.9 中使用无菌操作技术。采用实验室常规方法制备约 107 个人外周血单个核细胞或淋巴细胞（hPBMC、hPBL），并在最后一步增加 300 × g 离心，以最大限度减少血小板污染。将细胞重悬于 HBSS + 1% BSA 中，浓度为 107/ml，置于冰上，并保留 500 μl 分装样本（5 × 106 个细胞）用于步骤 2。
- 将 5 × 106 个细胞（500 μl）转移至一支 12 × 75 mm 的锥形聚丙烯管中。用 3.5 ml HBSS 洗涤一次。小心吸除上清液，残留液体不超过 15–25 μl，注意勿吸走细胞。将此管用于步骤 1.4 中制备 2 倍浓度的细胞悬液。
- 在步骤 1.2 的细胞洗涤过程中，向另一支 12 × 75 mm 锥形聚丙烯管中加入 0.5 ml 稀释剂 C 标记载体（来自 PKH26GL 试剂盒）。将此管用于步骤 1.5 中制备 2 倍浓度的 PKH26 溶液。
- 向步骤 1.2 中洗涤后的细胞沉淀中加入 0.5 ml 稀释剂 C 标记载体，反复吹打 3–4 次以获得单细胞悬液（2 倍浓度细胞）。避免产生气泡和过度混匀，以免降低细胞活力和回收率。
- 在完成步骤 1.4 的 2 倍浓度细胞悬液制备后，立即向步骤 1.3 准备的稀释剂 C 管中加入 2.0 μl 乙醇配制的 1.0 mM PKH26 染料储备液（来自 PKH26GL 试剂盒），涡旋混匀，使染料均匀分散，从而制备 2 倍浓度（4 μM）染料溶液。
- 在完成步骤 1.5 的 2 倍浓度染料溶液制备后，立即用移液器将步骤 1.4 中的 2 倍浓度细胞悬液快速加入染料溶液中，同时反复吹打 3–4 次，使细胞在染料中充分分散。切勿：将 1.0 mM 染料直接加入细胞；将 2 倍浓度细胞倾倒入染料溶液；或在涡旋过程中将 2 倍浓度细胞加入染料溶液。由于染色几乎瞬间完成，上述方法所得染色强度均匀性低于推荐方法（图 2）。
- 染色 1 分钟后，加入 1.0 ml 热灭活血清或 HBSS + 5% BSA 以终止染料对细胞膜的摄取。若蛋白用量不足，可能导致染料聚集，这些聚集物在洗涤过程中会随细胞沉淀，造成实验中其他细胞的非特异性标记。若使用含 10% 热灭活血清的培养基（CM）或 HBSS + 1% BSA 作为终止试剂，应在 15 ml 锥形聚丙烯管中进行染色，并加入至少 5.0 ml 终止试剂，以确保所有未结合染料被充分吸附。
- 将标记后的细胞在约 400 × g 条件下离心 5 分钟。小心吸除上清液，避免吸走细胞。用 4 ml CM 或 HBSS + 1% BSA 洗涤沉淀两次，每次重新离心前需充分重悬细胞。为最大限度减少管壁吸附染料的残留并提高洗涤效率，建议在第一次重悬后将细胞转移至新的聚丙烯管中。注意：染色充分的细胞沉淀会呈现明显的粉红色。
- 将洗涤后的细胞沉淀重悬于 1.0 ml HBSS + 1% BSA 中。计数细胞，计算细胞回收率，并调整体积使最终浓度为 107/ml。若操作得当，细胞回收率应 ≥85%。若细胞回收率 < 70%，应先查明原因再继续后续操作。取出 150 μl 分装样本（1.5 × 106 个细胞），置于冰上用于步骤 2。
2. 仪器准备及检测设置对照（表1）
- 从第1.1步保存的细胞悬液中，取50 μl（5×105）未染色细胞，分别加入五个1.8 ml Eppendorf管（编号1、3、4、5和7）中；从第1.9步中取50 μl（5×105）PKH26pos细胞，分别加入三个管（编号2、6和8）中。
- 向1–8号管中每管加入10 μl IgG封闭液（每管100 μg IgG；见试剂表），在室温（20–25 °C）孵育10分钟。
- 向4、5、7和8号管中加入表1所示的足量抗体，所有样品（1–8号管）在室温下避光孵育30分钟。
- 向所有样品中加入1.5 ml HBSS+1% BSA，通过离心（400 × g，5分钟）沉淀细胞，并用1.5 ml HBSS+1% BSA洗涤一次，小心吸弃上清以避免细胞丢失。
- 将每份样品重悬于500 μl HBSS+1% BSA中。如流式细胞仪检测需要，可转移至12 × 75 mm圆底管中。根据表1所示，向3、6、7和8号管中各加入10 μl 100 μg/ml 7-AAD日常工作液（见试剂表）。冰上孵育30分钟后，用于流式细胞仪设置和染色验证（第3步）。
3. 流式细胞仪设置与染色验证
- 验证流式细胞仪是否正常运行，使用实验室既定的每日质量控制程序。确认在将用于检测的每个光谱窗口中信号均能被清晰检测到，并确认检测器在用于增殖监测的光谱窗口中的响应与信号强度呈线性正比关系。14.
- 使用线性显示刻度采集第1管的FSC与SSC数据。调节每个检测器的放大倍数，使淋巴细胞群位于散点图的左下象限，且在任一参数上均未超出量程，同时避免因阈值设置导致信号中断。在步骤3.3至3.7中，对所有样本采集未设门控的FSC与SSC数据。
- 采集第1管数据，所有4个荧光检测器均不进行颜色补偿，并采用对数显示刻度。调节每个检测器的高压（HV），使未染色淋巴细胞的自发荧光位于刻度范围内，且极少或没有细胞聚集在第一通道。为每个直方图设定分析边界，对应于未染色细胞中最亮的2%细胞。
- 不进行颜色补偿，使用步骤 3.2 和 3.3 中设定的 HV 值，采集第 2 管的数据，收集 FSC、SSC 以及所有 4 个荧光检测器中的信号。对于用于检测 PKH26 荧光的检测器，确认所有 PKH26阳性 细胞在量表上呈现为一个单一的对称峰，位于3rd-4th 十年，最后一个通道中细胞极少或无细胞。如果出现多个峰或峰形偏斜，请仔细注意减少盐分和混匀技术，重复步骤1图2如有必要，调整染料浓度。
- 使用步骤 3.3 中设定的参数，采集第 3 管的数据，收集 FSC、SSC 以及所有 4 个荧光检测器中的信号。对于用于检测 7-AAD 荧光的检测器，确认 7-AAD阳性 细胞位于第3.3步设定的2%边界以上（即，非活细胞与活细胞的 7-AAD 能够很好地区分阴性 细胞）
- 使用第3.3步中设定的参数，采集第4管的数据，收集FSC、SSC以及所有4个荧光检测器中的信号。验证CD8阳性 细胞与未染色细胞能够清晰区分（即，落在第3.3步为FITC检测器设定的2%边界以上）。对第5管重复操作，并确认CD8位置 细胞与未染色细胞能够清晰区分（即 位于第3.3步为APC检测器设定的2%边界以上。
- 使用步骤 3.3 中设定的参数，对第 6、7 和 8 号管进行数据采集，收集 FSC、SSC 及所有 4 个荧光检测器中的信号。
- 使用为第1-5管收集的列表模式文件及您的颜色补偿软件，为每种荧光染料在用于检测其他三种荧光染料的检测器中建立颜色重叠矩阵。将该矩阵应用于样本6的列表模式文件，并验证PKH26标记的存在是否影响7-AAD的检测能力阳性 细胞
- 将第3.8步得到的颜色重叠矩阵应用于样本7的列表模式文件，并验证：a) 出现3个分辨良好的亚群（CD3阴性CD4阴性，CD3位置CD4阴性 和 CD3阳性CD4阳性) 可在FITC与APC散点图上进行鉴定；且b) 抗CD3-FITC与抗CD4-APC的存在不影响7-AAD的检测能力阳性 细胞。如果抗CD3-FITC的存在改变了PKH26检测器所采集数据的上边界2%阈值，则应根据需要重新调整该边界。
- 将第3.8步得到的颜色重叠矩阵应用于样本8的列表模式文件。如果PKH26标记的存在导致FITC、7-AAD或APC检测器的2%边界相较于第3.3步中使用自发荧光对照设定的边界发生变化，则根据需要使用第7管重新调整相应边界。 表1 并验证仍可区分 CD3阳性CD4阳性，CD3阳性CD4阴性和 CD3阴性CD4阴性 使用调整后的边界对细胞进行处理。
4. 通过染料稀释法监测细胞分裂的增殖模型选择
- 确定代际间距，该值取决于流式细胞仪的通道数和对数级数。对于数字仪器，此值通常为4或5个级数，由数字信号处理器中的分档数决定。对于模拟仪器，由于级数通常不是整数，因此需要通过实验精确测定级数以实现准确建模。为此，使用与实验相同的检测器高压设置，采集一组经校准的荧光微球混合物的数据，这些微球具有制造商指定的相对荧光强度。微球峰的位置可用于校准对数尺度，以确定每个对数级数对应的强度范围。具体方法是将每种微球类型的通道号对其制造商指定值的对数作图，通过微球数据点拟合一条最佳直线，其斜率即为每通道对应的相对强度单位数。将该斜率乘以总通道数，即可得到全量程范围内的对数级数，由此可进一步计算出对应荧光强度两倍下降的通道数（即，子代代际间隔）可以计算14.
- 决定使用代际间的固定间距，还是允许间距浮动。 标准 （固定）设置将使用步骤4.5中确定的世代间距值来分配每个世代的位置，通常在直方图缺乏明显峰时使用。 漂浮 该设置允许根据直方图的形状确定每一代峰的位置，通常在可明显区分各代峰时使用。
- 决定使用固定峰宽还是浮动峰宽。固定峰宽采用未刺激对照样本计算的标准差（SD）来拟合所有代次，通常在样本缺乏可区分的代次峰时选用。浮动峰宽允许程序为每一代次独立调整标准差（SD），适用于具有可区分代次峰的情况。
- 运行包含增殖分析模块的程序（此处为 ModFit LT Version 3.3）。加载经刺激的 PKH26阳性 待分析数据集中的文件（例如，经刺激的96小时PKH26标记细胞培养阳性 细胞经与第8管相同的方式复染 表1).
- 选择分析参数，本例中为在活细胞（7-AAD阴性）门控内分析PKH26（585/42）阴性CD3阳性 淋巴细胞以及FSC与SSC以排除小碎片和大聚集体（图3）。在界定这些区域时，需注意包含前向散射光较高的区域（原始细胞通常位于此处），并注意在刺激培养中CD3的表达可能下调。
- 使用增殖向导创建新的增殖模型。使用 开放数据文件 （开始选项卡），加载未刺激的 PKH26位置 对照文件，并确定亲代分布中对应于未分裂细胞的峰道位置。
- 分析 未刺激的PKH26文件阳性 对照，记录亲本峰位置和峰宽（标准差）的数值。如果需要固定峰宽（SD），请勾选 锁相检测器 SD.
- 加载PKH26阴性 对照（例如，PKH26 的 96 小时培养阴性 细胞经与第7管相同的方式复染 表1）。通过将最微弱一代的峰值通道设置在PKH26以上，调整代数数量。阴性 对照。这决定了模型能够准确拟合的子代代数，通常为6-9代。
- 打开 刺激样本的数据文件（例如，经刺激的96小时PKH26标记细胞培养位置 细胞经与第8管相同的复染处理 表1）并确认第4.7步中定义的亲本峰位置及标准差（SD）区域保持不变。若需要固定的世代间距，请选择 标准 模型选项；否则选择 漂浮 选项。
- 分析 使用第4.9步中定义的相同模型，对数据集中的每个实验文件进行拟合。为了获得最佳拟合效果，可能需要对母峰位置进行微小调整，最佳拟合的判断依据包括目视效果和约化卡方值。RCS）值。
- 记录数据集中每个实验文件经最佳拟合后所得的所需增殖参数。有关可能参数的全面描述，请参见参考文献22。
结果
与CFSE的化学反应标记或抗体的平衡结合不同，PKH26等膜染料通过快速分配进入细胞膜进行染色。若忽视图1中列出的关键问题，可能导致染色微弱或不均一，如图2所示。相反，在优化的标记条件下（图1，表2），可获得明亮且均一的染色分布，适用于多种细胞示踪应用，包括基于染料稀释的细胞分裂监测（图3）。死亡或濒死细胞会丢失不同程度的示踪染料，这可能拓宽和/或偏移子代细胞的荧光强度，从而增加基于染料稀释的增殖建模复杂性3,4,16,18。因此，当在可能存在大量死细胞的条件下（如刺激培养物（图3）或较老的样本（图4））采集染料稀释数据时，建议使用活力染料。
由于示踪染料标记产生的荧光强度通常比免疫表型分析高出数个数量级，因此必须设置适当的补偿对照（表1），并验证示踪染料的存在不会影响区分抗体阳性和阴性细胞的能力（图4）。为避免需要过度的颜色补偿，最好将明亮的荧光染料，或一种在目标细胞中不存在的染料（例如活细胞排除的染料），置于与示踪染料相邻的光谱通道中（图4A&B 对比 4C&D）。当使用峰拟合软件量化增殖程度时，要获得良好的拟合效果，必须使模型中的假设与所分析的染料稀释曲线特征相匹配（图5 和 表3）。通过合理选择示踪染料和活力检测试剂，还可同时分析多个淋巴细胞亚群的增殖反应。例如，如图6所示，添加第二种示踪染料可简化调节性T细胞（用CellVue Claret标记）与高度增殖的效应T细胞（用CFSE标记）之间的区分，相较于使用3H-胸腺嘧啶标记，能够提供更详细的相互作用信息18,27。
图1. PKH26、PKH67和CellVue染料的一般膜标记方案。 这些高度疏水性染料在无盐的稀释液C（Diluent C）中与细胞混合时，几乎可立即嵌入细胞膜中，该稀释液旨在最大化染料的溶解度和染色效率。如本图所示的PKH26一般膜标记过程，要获得明亮、均匀且可重复的染色效果，最有效的方法是：1）尽量减少染色步骤中存在的蛋白质和/或盐类；2）采用能够确保细胞在染料中快速均匀分散的混匀技术（i.e.，使所有细胞同时暴露于相同浓度的染料中）。
图2. 染色条件对PKH26荧光分布的影响 （转载自参考文献18）。 将对数生长期培养的U937细胞样品重复分组，用PKH26染色（终浓度：1 × 107 个细胞/ml，12–15 μM PKH26），在室温下孵育3分钟，染色过程中在将2倍浓度细胞加入2倍浓度染料时立即混匀或不混匀。洗涤后，使用贝克曼库尔特CyAn流式细胞仪并在恒定仪器设置下分析染色细胞。直方图1：未染色对照组，调整PKH26检测器电压，使所有细胞落在第一数量级范围内，且极少或无细胞聚集在第一个通道。直方图2：使用15 μM染料浓度，将2倍浓度细胞加入2倍浓度染料后立即混匀，结果获得明亮、均一染色且对称的细胞群体，位于第四数量级，极少或无细胞聚集在最后一个通道（gMFI = 2548，gCV = 26.2%）。直方图3：使用15 μM染料浓度，将2倍浓度细胞加入2倍浓度染料但未立即混匀，导致荧光强度降低、变异系数更宽（gMFI = 505，gCV = 116%），并出现弱染色的亚群，可能由于部分细胞滴加至管壁而非直接进入2倍染料溶液所致。直方图4：一次染色操作失误导致将3 μl浓缩的乙醇染料原液直接加入稀释液C中的2倍浓度细胞，而未先用稀释液C配制2倍染料溶液，且未进一步混匀。此操作最终染料浓度为12 μM，但染色极弱且不均一（gMFI = 32.9，gCV = 1020%）。所观察到的右偏分布最可能由以下因素共同导致：i）由于细胞悬液体积与染料体积差异较大，混合效果差；ii）靠近染料加样点的细胞暴露于更高染料浓度，而远离该点的细胞则暴露浓度较低。点击此处查看高清大图。
图 3. 使用活力探针简化 T 细胞增殖谱的门控分析。 人外周血单个核细胞（hPBMC）用 PKH26 标记（最终细胞浓度：3×107/ml；最终染料浓度：10 μM）。在存在（刺激）或不存在（未刺激）抗 CD3 抗体和 IL-2 的条件下培养 96 小时后，细胞用抗 CD3-FITC、抗 CD19-APC 和 7-AAD 进行复染，并在 FACSCalibur 流式细胞仪上进行分析（详见参考文献 13）。在数据采集时，使用硬件补偿电路进行颜色补偿。增殖程度的建模方法如步骤 4 所述，使用 ModFit LT3.3 中的增殖向导（Proliferation Wizard）完成。PKH26neg 对照组的数据（表 1，第 7 管）作为参考叠加显示（第 3 列中的灰色填充直方图）。未刺激和刺激培养物的细胞活力分别为 76% 和 62%（分别为图 A 和图 B 的未门控数据）。图 A. 将在培养基中培养 96 小时的 PKH26 染色细胞进行门控，以包含活的（7-AADneg）CD3pos 细胞（R1）。除抗体标记和 7-AAD 死细胞排除门控外，还使用前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）门控（R2）排除碎片和聚集体。请注意本图最后一张图中无死细胞。PKH26 增殖谱的最佳拟合模型（第 3 列）呈现单峰，残差平方和（RCS）为 2.1（供体 6，表 3），表明对称性良好，该模型用于定义本数据集中刺激样本分析的亲代峰位置和起始峰宽（图 B）。图 B. 另一份 PKH26 染色细胞等分试样在含抗 CD3 抗体和 IL-2 的条件下培养 96 小时，并以与图 A 相同的方式进行门控。采用峰位置和峰宽均浮动的模型对该数据拟合最佳，RCS 为 1.3（供体 6，表 3）。图 C. 使用与图 A 相同的数据文件，但未使用 7-AAD 数据。当使用初级 FSC 与 SSC 门控（R2）部分排除死细胞和聚集体，并使用次级门控选择 CD3 阳性事件（R3）时，仍残留少量死细胞（占门控事件的 0.2%）。最佳拟合模型为单峰，RCS 为 2.2。图 D. 使用与图 B 相同的数据文件，门控方式同图 C。请注意，采用此门控策略时，刺激样本中残留的死细胞比例更高（占门控事件的 1.29%）。最佳拟合模型为峰位置和峰宽均浮动的模型（RCS = 1.3）。点击此处查看大图。
图4. 荧光染料的选择和染料浓度对PKH26标记淋巴细胞免疫表型分析能力的影响。 从24小时的血液中分离hPBMC，并按照步骤1所述用PKH26标记，唯一区别是染色在12 × 75 mm圆底聚苯乙烯管中进行，而非12 × 75 mm锥形聚丙烯管。PKH26标记后立即用指定的免疫表型和活力检测试剂进行复染，并使用LSRFortessa流式细胞仪结合以下设门策略进行分析 图3A 以及以下光学配置：488 nm 激光：FSC-A（488 nm）；SSC-A（488/10 BP），FITC-A（530/30 BP）；PKH26-A（575/26 BP）；7-AAD-A 或 PerCP-A（695/40 BP）。640 nm 激光：APC-A 或 TOPRO-3-A（670/14 BP）。使用 BD DiVa 软件在数据采集时进行颜色补偿。“Auto”表示无抗体对照在相应光谱窗口中的自发荧光（图 A 和 B 为 APC，图 C 和 D 为 PerCP）。来自 PKH26 的数据阴性 对照（表1，第7管）作为参考进行叠加（灰色填充直方图，第5列）。所有样本染色后的存活率相似（88-92%）。 图A。 PKH26终浓度标记的细胞 2 μM 使用抗-CD3-FITC、抗-CD4-APC 和 7-AAD 复染（第8管） 表3）。在活细胞（7-AAD阴性CD3阳性 淋巴细胞（第1列）以及根据FSC和SSC排除碎片和聚集体（参见 图3A），PKH26 强度与 APC 标记的 CD4 联合检测（第 2 和第 3 列）。无论未补偿（第 2 列）或已补偿（第 3 列），该荧光染料组合均能实现 CD4 之间良好的分辨阳性 T细胞与CD4阴性 T细胞），这一点通过无抗体的自发荧光对照得到了验证（第6管） 表1；CD3 的双色图 与. CD4（第6列）。 图B. 采用与图A相同的荧光染料组合，但将PKH26的终浓度提高至 4 μM 未对分辨CD4的能力产生不利影响阳性 CD4 T细胞阴性 T细胞 图C。 用PKH26独立标记的细胞等分试样，终浓度为 2 μM 使用抗-CD3-FITC、抗-CD4-PerCP和TOPRO-3进行复染。在圈选活细胞（TOPRO-3阴性）后阴性CD3阳性 淋巴细胞（第1列）以及根据FSC和SSC排除碎片和聚集体（参见 图 3A），PKH26 强度与抗 CD4-PerCP 联合检测（第 2 和第 3 列）。在未补偿的数据中，PKH26 在 PerCP 通道中存在明显的光谱重叠（第 2 列），PKH26 之间的分辨阳性 CD4阳性 和 PKH26阳性 CD4阴性 补偿后，事件的差异变得微乎其微（将第3列与第4列所示的无抗体自发荧光对照进行比较）。 图 D。 当PKH26浓度增加至 4 μM，已无法继续使用 Panel C 的荧光染料组合。PKH26 在 PerCP 通道产生的光谱重叠强度超过了 CD4（第 2 列）和 CD4 的信号强度阳性PKH26阳性 CD4 上的事件不再可分辨阴性PKH26阳性 T 细胞（第 3 列） 与. 第4列）。 单击此处查看大图.
图5. 增殖模型选择对染料稀释曲线拟合优度的影响。 使用PKH26对hPBMC进行标记（终末细胞浓度：3×107/ml；终末染料浓度：10 μM）。在存在（刺激组）或不存在（未刺激组）抗CD3抗体和IL-2的条件下培养96小时后，收集细胞并用抗CD3-FITC、抗CD19-APC和7-AAD复染，随后在FACSCalibur流式细胞仪上进行分析（详细方法见参考文献13）。在数据采集时，使用硬件补偿电路进行颜色补偿。图A。来自供者5（中等应答者）未刺激的96小时培养样本的PKH26强度分布曲线，如图3A所示进行设门，用于为ModFit增殖向导提供未分裂亲代细胞峰位置和宽度的初始估计值。图B。来自平行刺激的96小时培养样本的PKH26强度分布曲线，采用图A提供的初始估计值，并结合4种不同的“增殖向导”设置组合进行分析，这些设置包括固定或浮动的峰强度，以及固定或浮动的子代峰宽度，如图所示。如表3所总结，对观测数据拟合最佳的模型（最低的约化卡方值，RCS）是“浮动/浮动”组合，即不仅允许子代峰的位置变化，也允许其标准差变化（RCS = 1.5）。该模型对供者6（强应答者）同样提供了最佳拟合（图3B和表3）。
图6. 在流式细胞术抑制实验中加入第二种细胞示踪染料可简化效应T细胞与调节性T细胞的区分 （改编自参考文献18）。 从TRIMA白细胞分离滤器中制备的单核细胞耗竭型淋巴细胞，使用抗CD127-PE、抗CD4-PE-Cy7和抗CD25-APC染色后，通过流式分选获得效应性T细胞（Teff；CD4pos CD127bright CD25dim）、调节性T细胞（Treg；CD4pos CD127dim CD25pos）以及辅助细胞（CD4neg）。分选后的Treg细胞用CellVue Claret标记（终细胞浓度：1×106/ml；终染料浓度：1 μM），分选后的Teff细胞用CFSE标记（终细胞浓度：5 × 107/ml；终染料浓度：5 μM），然后在抗CD3、抗CD28抗体及经辐照的辅助细胞存在下，以不同比例共培养。培养96小时后收集细胞，用抗CD4-PE-Cy7和LIVE/DEAD可固定紫染料复染，并在LSRII流式细胞仪上进行检测；数据采集时使用BD DiVa软件进行颜色补偿（详见参考文献18中的补偿对照设置）。Teff和Treg的增殖指数按步骤4所述方法，利用ModFit LT3.3中的增殖向导模块建模分析。图B和图C中的数据点表示三个重复样本的平均值±1个标准差。图A. 显示了Treg:Teff比例为0.25:1时三个重复样本之一的代表性数据。使用LIVE/DEAD可固定紫染料排除死细胞（R1，左上图；辅助细胞为红棕色，非活Teff为灰色，非活Treg为红色），所有其他数据图均基于此门控。CellVue Claret染色用于区分活Treg（R4，中右图；蓝色）与虽活但高度增殖的Teff（R5，中右图；绿色）。通过设门于CFSEpos（R5）、CD4pos（R3）、活细胞（非R1）且具有淋巴细胞散射特性的细胞（R2），生成Teff的单参数CFSE增殖谱（左下图）。同理，通过设门于CellVue Claretpos（R4）、CD4pos（R3）、活细胞（非R1）且具有淋巴细胞散射特性的细胞（R2），生成Treg的单参数CellVue Claret增殖谱。注意图中设定的淋巴细胞区域（R2）范围较宽，以包含淋巴母细胞。还需注意，所需采集的总细胞数取决于目标群体中频率最低的亚群。在细胞增殖实验中，若目标群体分布在代表多达七至八代的广泛荧光强度范围内，则应采集大量细胞，以便准确建模并计算每一代的细胞数量。当研究稀有细胞时，可能需要几乎将样本管运行至干涸，以收集尽可能多的事件数。对于本图所示样本，最终共采集约25,000个事件，其中Teff为11,923个（增殖指数3.85），Treg为1,380个（增殖指数1.83）。图B. 如预期，共培养体系中Treg比例增加导致Teff细胞增殖受到更强抑制。使用CellVue Claret标记（实线）或未标记（虚线）的Treg均获得相似结果，表明CellVue Claret示踪染料的标记不影响Treg的功能活性。图C. Treg通常呈相对无反应性，正如预期，在仅有抗CD3、抗CD28抗体和辅助细胞而无Teff细胞（Treg:Teff比例为1:0）的情况下，Treg不发生增殖。然而，随着共培养体系中Teff比例的增加（即 Treg:Teff比例降低），Treg的增殖程度也随之上升。这些数据中普遍较大的误差条至少部分反映了增殖程度有限，导致相对于Teff采集到的事件数较少，从而在建模每一代细胞数量时存在更大的不确定性。 点击此处查看高清大图。
| 试管编号（用途） | PKH26 | 抗体 | 7-AAD |
| 1（设置与补偿） | - | - | - |
| 2（设置与补偿） | + | - | - |
| 3（设置与补偿） | - | - | + |
| 4（补偿） | - | CD8-FITCb | - |
| 5（补偿） | - | CD8-APCb | - |
| 6（无抗体对照） | + | - | + |
| 7（无示踪染料对照） | - | CD3-FITC CD4-APC 或 CD19-APCc | + |
| 8（T0对照） | + | CD3-FITC CD4-APC 或 CD19-APCc | + |
表1. 仪器设置对照a。a 所列对照适用于使用以下试剂的4色CD4 T细胞增殖监测实验：PKH26（增殖染料）、CD3-FITC（全T细胞标记物）、CD4-APC（辅助性T细胞标记物）、7-氨基放线菌素D（7-AAD；用于排除死细胞）。b CD3-FITC和CD4-APC的更亮替代标记物（更有利于检测补偿误差）。c 图3：CD3-FITC与CD19-APC。d 图4：CD3-FITC与CD4-APC。
| 细胞类型 | 终末细胞浓度 | 终末染料浓度 | 参考文献 |
| hPBMCb | 1 x 107/ml | 2 μM PKH67 | 10,17 |
| 5 x 106/ml | 2 μM PKH26 | 12 | |
| 3 x 107/ml | 10 μM PKH26 | 13 | |
| 5 x 107/ml | 30 μM PKH26 | 18 | |
| 1 x 106/ml | 1 μM CellVue Claretc | 18 | |
| 3 x 107/ml | 4 μM CellVue Claret | 13 | |
| 5 x 107/ml | 5 μM CellVue Claret | 18 | |
| 培养中的细胞 | 5 x 105/ml | 0.1 μM PKH26 (1°乳腺细胞) | 8 |
| 1 x 107/ml | 15 μM PKH26 (U937) | 18 | |
| 1 x 107/ml | 12.5 -15 μM PKH26 (U937) | 15 | |
| 1 x 107/ml | 1 μM PKH67 (K562) | 18 | |
| 1 x 107/ml | 1 μM PKH67 (T细胞系) | 9 | |
| 1 x 107/ml | 10 μM CellVue Claret (YAC-1) | 23 |
表2. 非干扰性膜染料染色条件a。a 改编并更新自参考文献18。b 采用低速离心洗涤（300 × g）以最大程度减少血小板污染。c 调节性T细胞（经流式分选的CD4posCD25posCD127neg淋巴细胞）。
| 模型设置 | 模型结果 | ||||||||
| 供体 | 处理方式 | 峰位置 | 标准差（SD） | 亲代位置 | 亲代标准差（SD） | 拟合峰数量 | RCS | PI | PF |
| 5 | 未刺激 | 浮动 | 浮动 | 209 | 4.5 | 1 | 5.1 | 1.0 | 0 |
| 5 | 刺激后 | 固定 | 固定 | 209 | 4.5 | 7 | 35 | 3.9 | 31 |
| 5 | 刺激后 | 浮动 | 固定 | 209 | 4.5 | 8 | 19 | 4.3 | 30 |
| 5 | 刺激后 | 固定 | 浮动 | 209 | 9.2 | 6 | 1.9 | 3.8 | 30 |
| 5 | 刺激后 | 浮动 | 浮动 | 209 | 9.0 | 7 | 1.5 | 3.7 | 29 |
| 6 | 未刺激 | 浮动 | 浮动 | 205 | 4.0 | 1 | 2.1 | 1.0 | 0 |
| 6 | 刺激后 | 固定 | 固定 | 205 | 4.0 | 6 | 42 | 6.6 | 60 |
| 6 | 刺激后 | 浮动 | 固定 | 205 | 4.0 | 7 | 12 | 7.4 | 60 |
| 6 | 刺激后 | 固定 | 浮动 | 205 | 8.6 | 6 | 6.9 | 6.8 | 62 |
| 6 | 刺激后 | 浮动 | 浮动 | 205 | 6.5 | 6 | 1.3 | 6.5 | 59 |
表3. 增殖模型对拟合优度（RCS）和增殖指标的影响a。a 样本染色、数据采集和设门方法详见图3A和3B。
讨论
本文所述方法是在我们联合实验室中发现的、用于人外周血单个核细胞（hPBMC）膜染料标记13,16,18以及利用膜染料或蛋白染料进行淋巴细胞亚群表型分析和增殖追踪时最可靠且能获得最佳结果的操作流程2,11,13,16,18。如图1和图2所示，通过减少生理盐的存在，并采用一种能使所有细胞迅速、均匀地暴露于相同染料浓度的混匀技术，最容易实现明亮且均一的标记效果。由于膜染料染色是通过进入脂双层进行分配而实现的，因此其他影响游离染料浓度的因素也可能影响标记效率。例如，在圆底聚苯乙烯试管中进行标记时，重悬于稀释液C之前盐分的洗涤去除效率较低，同时由于染料吸附在管壁上（尤其是在较低染料浓度下），导致游离染料浓度下降。这两个因素均倾向于产生比使用锥底聚丙烯试管更宽的染色分布（图3、图4及未发表结果）。即使采用优化的染色程序，样本的保存时间和类型也可能影响染色峰的宽度。例如，从新鲜采集的血液中分离的PKH26pos淋巴细胞的变异系数（CV）为14–20%（图3，参考文献13及未发表结果），而从保存24小时的血液样本或TRIMA单采过滤器中分离的淋巴细胞，其变异系数则为25–30%（图4及参考文献18）。
染色的均一性以及排除非活细胞的程度均会影响染料稀释曲线中是否能够明显区分出子代峰，进而影响对拟合观测数据的增殖模型的选择（图5 和 图6）。尽管本文以ModFit（Verity Software House, Topsham, ME）作为生成增殖指数（Proliferation Index）和前体频率（Precursor Frequency）等参数的软件示例（图3、图5 和 图6；表3），其他软件包也包含分析增殖数据的模块，例如FCSExpress（De Novo Software, Los Angeles, CA）和FlowJo（Tree Star, Inc., Ashland, OR）。这些程序均采用非线性最小二乘法分析，通过调整代表连续子代的高斯峰的位置、高度和标准差（或宽度），迭代寻找与原始数据的最佳拟合。增殖指数（PI）和前体频率（PF）是衡量增殖程度最常用的两个指标。根据ModFit的定义，PI用于衡量在整个实验过程中细胞数量的增加，类似于胸苷掺入实验中的“刺激指数”。PF则反映初始细胞群体中对刺激产生增殖反应的细胞所占的比例。然而，在阅读文献时需谨慎，因为不同软件包之间的术语存在一定差异（例如，FlowJo和ModFit对“增殖指数”这一术语的定义和计算方法不同）22。
在使用蛋白染料进行标记和增殖分析时，同样会遇到本文讨论的膜染料相关的关键问题。例如，使用CFSE时（图6）2-4,13,18,24，必须同样注意混匀技术，并排除死亡或濒死细胞，以获得均匀的分布和可区分的子代峰。选择合适的荧光染料用于表型分析和活力评估也至关重要，以避免过度的光谱重叠，导致难以识别抗体阳性细胞，尤其是使用发射可见光的蛋白染料（如CFSE）时2-4,11,13,16,18。降低示踪染料的浓度可减少相邻光谱通道间的补偿问题，但也会限制在子代细胞荧光强度与自发荧光开始重叠之前可监测的细胞分裂次数。 alternatively，使用较新的细胞示踪染料，如远红发射的CellVue Claret（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）或紫光发射的CellTrace Violet（Life Technologies, Grand Island, NY），可能有助于减少补偿问题（图6）。最后，尽管膜染料通常表现出较低的毒性11,26，但使用任一类染料均有可能过度标记细胞。因此，必须始终验证所用示踪染料的浓度是否影响了待追踪细胞的功能（图6）3,13,16,18。
披露
K. Humphrey、J.D. Tario, Jr. 和 P.K. Wallace 已从 Life Technologies, Inc. 与 BD Biosciences 获得用于评估的商业化前细胞示踪试剂。A.D. Bantly 和 J.S. Moore 已从 Life Technologies, Inc. 获得用于评估的商业化前细胞示踪试剂，并从 PTI Research, Inc. 获得资助，用于多种 CellVue 细胞示踪染料的商业化前表征研究。K. Muirhead 任职于 SciGro, Inc.，该公司为 Phanos Technologies, Inc.（PKH 和 CellVue 染料的所有者）提供咨询服务，并为 Sigma-Aldrich 和 Molecular Targeting Technologies, Inc.（这些染料的分销商）提供后备技术支持。
本文的出版及免费访问由 Sigma-Aldrich 赞助。
致谢
作者们特别感谢多年来在这些方法的开发过程中提供技术与学术贡献的以下人员：Bruce Bagwell（Verity Software House）、Nadège Bercovici（IDM）、Lizanne Breslin（Zynaxis Cell Science 和 PTI Research）、Brian Gray（PTI Research）、Jan Fisher（达特茅斯医学院）、Alice Givan（达特茅斯医学院）、Betsy Ohlsson-Wilhelm（SciGro, Inc.）以及 Mary Waugh（达特茅斯医学院）。作者们还感谢流式细胞术研究方法与应用年度课程中鲍登学院2006届班级，图2中展示的数据即由该班级生成。
流式细胞术在罗斯威尔公园癌症研究所的流式细胞术实验室进行，该实验室部分由美国国立卫生研究院共享仪器项目（NIH Shared Instrument Program）的设备资助建立，并获得美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）对罗斯威尔公园癌症研究所的核心资助（5 P30 CA016056-29）支持。部分实验也在宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心流式细胞术与细胞分选资源实验室完成，该实验室同样部分由美国国立卫生研究院共享仪器项目的设备资助建立，并获得美国国家癌症研究所资助 NIH #2P30 CA016520 的支持。图3和图5所示工作还部分得到了美国国立生物医学成像与生物工程研究所（National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIBIB）授予PTI Research, Inc.的小企业创新研究（SBIR）资助 EB00228 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 商业购买 | |||
| 7-氨基放线菌素D |  Sigma-Aldrich | A9400 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hanks平衡盐溶液（HBSS） | Life Technologies | 14175-079 | 不含钙和镁，不含酚红 |
| 人IgG科恩组分II和III球蛋白 | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
| 小鼠抗人 CD3-FITC | BD 生物科学 | 349201 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD4-APC | BD 生物科学 | 340672 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD4-PECy7 | BD 生物科学 | 348799 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD8-FITC | BD 生物科学 | 347313 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD8-APC | Caltag（Life Technologies） | MHCD0805 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD19-APC | Caltag（Life Technologies） | MHCD1905 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD25-APC | BD 生物科学 | 340938 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD127-PE | BD 生物科学 | 557938 | 由实验室滴定确定的饱和浓度 |
| 小鼠抗人 CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/mL；无叠氮化物 |
| 小鼠抗人 CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/mL；无叠氮 |
| PBS | Gibco | 21300-058 | |
| PKH26红色荧光细胞连接试剂盒，包含乙醇中的10-3M PKH26及稀释液C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT 或 MINI26-1KT | 步骤1中的操作程序同样适用于含有PKH67或其他CellVue染料的试剂盒 |
| CellVue Claret 远红荧光细胞标记试剂盒，包含乙醇中的 10-3M CellVue Claret 及稀释液 C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT 或 MIDCLARET-1KT | |
| 5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE） | Invitrogen（Life Technologies） | C34554 | 非荧光性；可被膜酯酶切割，生成具有荧光且可与氨基反应的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE） |
| LIVE/DEAD 可固定紫染料 | Invitrogen（Life Technologies） | L34955 | |
| 无菌 12x75 mm 圆锥形离心管 聚丙烯管 & 胶囊 | VWR | 60818-102 | 提高膜染料染色效率（减少染料吸附；吸除上清液时细胞损失更少） |
| 12x75 mm 圆底 聚苯乙烯管 | Becton Dickinson | 21008-936 | |
| 流式细胞仪 | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa | 任何能够检测 FITC、PKH26 和 7-AAD（激发波长 488 nm；发射波长分别为 520 nm、567 nm 和 655 nm）以及 APC（激发波长 633–640 nm；发射波长 660 nm）的流式细胞仪 |
| 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特 | LSRII CyAn | 任何能够检测 FITC、PKH26 和 7-AAD（激发波长 488 nm；发射波长分别为 520 nm、567 nm 和 655 nm）以及 APC（激发波长 633–640 nm；发射波长 660 nm）的流式细胞仪 |
| 实验室制备 | |||
| 7-氨基放线菌素D 浓缩储备液 | NA | NA | 1 mg/mL（溶于PBS中）。分装后冻存于-80℃20 °C. |
| 7-氨基放线菌素D 工作液 | NA | NA | 100 μg/mL 在 PBS 中；每天从 1 mg/mL 冻存液中新鲜配制。 |
| IgG 封闭 | NA | NA | HBSS + 10 mg/mL 人IgG Cohn组分II和III球蛋白 + 10 mg/mL BSA |
参考文献
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