利用RootChip快速调控根际环境对拟南芥根生长进行延时荧光成像

摘要

本文提供了一种在RootChip中培养拟南芥幼苗的实验方案。RootChip是一种微流控成像平台，可自动控制生长条件，同时实现根部的显微监测以及基于FRET的细胞内代谢物水平检测。

摘要

根作为植物的物理锚定器官，负责从土壤中吸收水分和矿质养分，例如氮、磷、硫酸盐以及微量元素。如果我们希望发展可持续的高产作物生产方式，就需要更深入地理解根的发育过程、对多种养分的吸收机制，以及其与共生和致病生物之间的相互作用。为了实现这些目标，我们需要能够在数分钟至数天的时间尺度上，对根进行显微层面的细致观察和研究。

我们开发了RootChip，一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置，可使拟南芥幼苗的根在生长过程中进行成像，同时在成像前处理时避免对根部造成任何物理损伤¹（图1）。该装置包含一个具有微机械阀门的分叉通道结构，可将溶液入口的流体引导至八个观察室中的每一个²。该灌流系统能够精确且快速地控制和调节根部微环境。每个腔室的体积约为400 nl，因此仅需极少量的测试溶液。

本文提供了一种利用基于成像的方法并以实时分辨率在RootChip上研究根系生物学的详细实验方案。可通过延时显微镜对根系进行持续数天的分析。根系可灌注营养液或抑制剂，且最多可同时分析八株幼苗。该系统具有广泛的应用潜力，包括在有或无化学物质条件下分析根系生长、基于荧光的基因表达分析以及生物传感器分析，例如FRET纳米传感器³。

方案

注意：所有准备步骤均需在无菌条件下进行。

1. 种子萌发用塑料锥形管的制备

1. 在培养皿中加入含有1%琼脂的生长培养基，使培养基厚度达到5 mm，培养皿直径为10 cm。我们使用半强度改良Hoagland培养基⁴，但培养基的组成应根据具体的实验需求进行选择。
2. 在培养基仍处于液态时，使用多通道移液器从培养皿中吸取5 μl培养基，注入10 μl移液器吸头内。
3. 将装有培养基的吸头存放于吸头盒中，待培养基凝固后，切割成4 mm长的塑料锥形管，并将其垂直放置于含有固体生长培养基的培养皿中。

2. 种子萌发与幼苗生长

1. 将种子在5% NaOCl中表面灭菌5分钟，用无菌水清洗三次，然后将单粒种子放置于每个装有培养基的锥形管顶部。
2. 用Micropore胶带（3M）密封培养皿，并在4 °C下保存以同步萌发。
3. 三天后，将培养皿转移至生长培养箱以启动萌发。我们的生长条件为23 °C，光照周期为16小时强光/8小时黑暗（光照强度：100 μE m^-2 s^-1）。
4. 萌发后5至7天，幼苗应已准备好转移至RootChip。此时，根尖应接近塑料锥形管底部的出口。在解剖显微镜下检查幼苗健康状况、根长以及（如适用）荧光标记的表达情况。
5. 标记待转移至芯片的单个幼苗。建议选择约十株幼苗，以防转移过程中有幼苗受损。

3. 将幼苗转移至RootChip上

1. 为对 RootChip 进行长期实验的灭菌处理，需先用纸巾包裹该装置，放入玻璃培养皿中，然后进行高压灭菌。
2. 待 RootChip 冷却后，用液体培养基覆盖。RootChip 应完全浸没在培养基中，但液面高度不得超过 RootChip 表面以上 3 mm。
3. 使用 20 μl 移液器，通过根部入口和观察室出口吸取培养基，以使观察室充满培养基。
4. 将步骤 2.5 中选定的塑料锥形塞插入 RootChip 的入口中。锥形塞应紧密地插入入口。由于 RootChip 安装在一层薄的光学玻璃上，因此请勿对芯片施加过大压力。
5. 将 RootChip 装置于液体培养基中过夜培养。为防止漂浮，可在芯片上放置两片载玻片，加入磁力搅拌子后盖上培养皿盖。
6. 将整个装置转移至磁力搅拌器上，轻轻搅动培养基。
7. RootChip 的入口以 30° 角与通道相交，该角度相对于装置法线方向有利于根向通道内生长（图 1A）。为进一步促进根朝预期方向生长，可在培养皿底部出口侧的对侧下方垫一片载玻片，使装置略微倾斜。
8. 为维持光照/黑暗周期，使用连接定时器的环形灯对幼苗进行照射（光照强度：100 μE m^-2 s^-1）。

4. 将根芯片连接至载具

1. 次日，用液体培养基填充一个可密封、可加压的小瓶（图 1B）。
2. 将芯片支架倒置并放置在稳定表面上。将RootChip从液体培养基中取出，使其PDMS面朝下插入芯片支架底部的开口中。调整芯片方向，使含有控制层入口的一侧朝向支架侧壁上压力管路连接管所在的一侧。
3. 用纸巾轻轻吸干芯片底部盖玻片上的液体。用胶带将RootChip固定在支架上，并将整个组件恢复至正立位置。
4. 管路连接管由切割成5 cm长的柔性塑料微孔管（TYGON，内径0.20" × 外径0.060"）与不锈钢微孔管（New England Small Tube，外径0.025" × 内径0.013" × 长0.75"）连接而成。使用注射器将水注入管路连接管中，并将每根连接管插入芯片上对应的控制层入口。这些水将随后填充控制层通道，并用于将压力传递至微机械阀门。
5. 将管路的另一端插入培养液/溶液瓶中。使用空气注射器对溶液瓶加压，溶液瓶内增高的气压将推动液体进入管路。

5. 在显微镜上安装 RootChip

1. 将载具放置到显微镜载物台上。为减少实验过程中因室内振动导致组件移位的可能性，载具应精确嵌入载物台插件的凹槽中。
2. 芯片阀门及培养基在芯片内的流动由气压控制。从一条主气压管路分出两条带调压阀的支路——其中一条用于调节培养基在通道中的流动，另一条连接电磁气动阀，用于驱动控制层中的顶起式阀门。电磁阀通过计算机连接USB阀门控制器（由Rafael Gómez-Sjöberg，劳伦斯伯克利国家实验室开发）进行操作。在连接芯片前，请关闭两个压力调节阀。
3. 向载具的储液槽中加入几毫升水，以维持组件内部的高湿度环境。在较长时间的实验过程中，应重复此步骤，防止植物样本干燥。加水量应保持较低，以尽量减少可能溢出到显微镜上的液体量。对于长期实验，可通过微孔管将芯片出口与载具的储液槽连接，从而将芯片出口流出的液体导流至储液槽中（参见步骤4.4）。或者，也可通过移液方式收集积聚在芯片表面的流出液。
4. 使用透明塑料文件保护套（C-Line）裁剪成方形片材。用双面胶将透明塑料片固定在载具上，以维持组件内的高湿度环境。
5. 将环形光源置于芯片上方，并维持光照/黑暗循环。在使用荧光标记的任何实验开始前，应关闭环形光源，因为直接照明会干扰图像采集。

6. 使用 LabView 界面操作 RootChip

LabView 软件平台的 RootChip 控制器接口可从我们的网站下载：http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip。

1. 通过向控制层施加压力来关闭芯片上的阀门，在本例中是通过打开电磁空气阀实现的。控制器界面允许通过点击阀门编号下方的按钮来驱动阀门。亮绿色表示已施加压力并关闭芯片阀门（图2B）。在打开压力调节器之前，先在控制器界面中激活所有三个溶液入口阀门。 注意：控制器界面具有反馈回路功能，可用于监测系统状态。该功能可通过点击控制器界面上的“Readback”按钮来启用。
2. 打开控制层的压力调节器，并初始设定为 15 psi，然后打开流体层的压力调节器，并初始设定为 5 psi。根据所需的流速，后续可对压力进行调整。
3. 打开所选培养基的入口阀，以用培养基冲洗各个腔室。
4. 在显微镜下检查流动路径。通常情况下，流道中会困有气泡，必须将其清除。此外，控制层的通道中仍含有空气，需通过管路连接件中的水将其排出并取代（盲端填充）。上述两项操作均可通过反复冲洗全部八个腔室数次（5 psi），直至所有空气被驱出通道并进入PDMS材料中（“脱气”）来完成。 注意：控制器界面可编程以实现实验自动化。此类程序也可用于芯片的脱气处理。

7. 代表性结果

RootChip 的主要目的是将成像平台与灌流系统高度集成于单一装置中。为展示对根部微环境的操控能力，我们用深色食用色素（以水培培养基稀释 1:4）冲洗腔室，并测量腔室内液体的交换情况。在推荐的 5 psi 压力下，测得腔室内液体在约 1.5 μl/min 的计算流速下，10 秒内即可完成完全交换（图 3）。

我们还观察了幼苗的根系生长，本实验中幼苗在黑暗条件下培养，并提供10 mM葡萄糖作为外源能量来源（图4）。根据光照条件和培养基成分等生长条件的不同，可在RootChip中持续观察植物长达三天。

RootChip 已被用于监测表达基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码纳米传感器的根中葡萄糖和半乳糖的胞内水平^5-7。芯片中的根部接受葡萄糖或半乳糖溶液的方波脉冲灌流（图5）。胞内糖水平的监测结果以受体荧光蛋白Citrine与供体ECFP荧光强度的比值表示。比值上升表明糖的积累。

图1. RootChip工作原理。

1. RootChip 包含八个用于根系生长和成像的观察室。种子首先在塑料锥形管中萌发——这些锥形管由塑料移液枪头制成，并填充固体培养基。根尖穿过培养基，进入观察室，在此处连续流动的液体培养基可保持室内环境恒定。微机械阀门（红色）控制液体流动。芯片安装在光学盖玻片上。
   示意图未按比例绘制。（经 Grossmann et al., 2011 Plant Cell 许可改编。）
2. 带隔膜（红色）的可加压溶液瓶示意图。

图2. 根芯片的连接与安装。

1. 倒置显微镜上安装有完全连接的RootChip及其载体的顶视图。
2. 阀门系统及控制器界面示意图。图中展示了一个将流体引导至单个腔室的阀门设置示例。阀门4至8作为独立阀门工作，而阀门0至3则以组的形式工作。通过该系统，可通过激活一组阀门组合来单独寻址某个腔室。

图3. 观察室中溶液的交换。 利用染料溶液对观察室内液体交换过程进行可视化。该图像为明场图像与染料信号伪彩强度图的叠加图像。

图4. 芯片上的根系生长。 对单根表达葡萄糖/半乳糖荧光FRET纳米传感器的生长根在20小时内的连续观察。时间格式：hh:mm；比例尺：100 μm。

图5. 使用FRET纳米传感器测量细胞内糖浓度。

1. 传感器的量以根尖内的锦葵素荧光强度表示（左侧）。细胞内FRET纳米传感器对葡萄糖或半乳糖溶液施加的响应以比率成像显示。（改编自Grossmann et al.，2011年《植物细胞》，经许可使用。）比例尺：100 μm。
2. 追踪FRET比率在三次重复的葡萄糖（绿色）和半乳糖（红色）方波脉冲刺激下的变化。

讨论

与传统培养方法相比，RootChip 的主要优势在于其对显微镜观察的制备过程具有最小侵入性，能够可逆且重复地改变根部环境，并可在数天内持续观察发育能力完整且生理状态健康的组织。此前，幼苗在凝胶培养基上垂直生长，并在实验开始前立即转移至灌流系统，该方法每次仅能测量单个根系⁸。尽管已有微流控工具用于拟南芥研究，但其集成度较低⁹，或缺乏灌流控制能力¹⁰。RootChip 将高度集成性与通过精确流体引导实现实验自动化的能力相结合。该平台的另一优势是所有微流控装置共有的特性¹¹，即即使在持续数天的实验中，也仅需极少量液体即可为根系提供必要的营养物质。RootChip 目前设计为一次性使用装置，但由于芯片生产成本较低，且试剂消耗量极少，因此仍具有很高的成本效益。

为确保幼苗健康，必须采取以下几个关键步骤：

塑料锥形容器中的液体体积仅为3-4 μl，暴露在空气中会开始蒸发。因此，必须迅速将锥形容器转移至芯片上，并保持高湿度环境，直到根系进入观察室，由观察室为其提供充足的水分。为防止幼苗干燥，步骤4.2至4.5应快速且连续地完成。

步骤 3.5 - 3.8 描述了芯片在液体培养基中的孵育过程，期间根系将生长进入观察室。此步骤可跳过，直接将芯片立即安装到载体中，并开始用生长培养基持续灌注。然而，我们建议在生长培养基中浸泡过夜，因其具有以下优势：1）可形成湿润环境，使幼苗在生长进入观察室过程中不易脱水；2）芯片浸泡于液体中，后续脱气（步骤 6.4）过程将更快。

使用溶质浓度较低的培养基非常重要。较高浓度的溶液可能会析出沉淀并堵塞通道，尤其是在芯片使用数天的情况下。

当设备连接到气压管路后，通过改变阀门中的液压来控制培养基的流动。为了确保微机械阀门能够完全闭合，选择的控制压力应约为流动压力的三倍。流动压力不应超过15 psi，否则液体将从根部入口被推出。过高的压力还可能导致芯片分层，从而使芯片无法使用。

RootChip 的一个局限性在于 PDMS 具有孔隙性和疏水性。尽管该材料对水溶液基本呈惰性，但可能吸收有机化合物¹²。这会干扰溶液的快速更换，因为即使在入口处停止供应该有机化合物后，其仍可能从材料中渗出。由于 PDMS 具有孔隙性，使用有机溶剂可能导致 PDMS 膨胀¹²。

我们正在持续优化根芯片并拓展其应用，例如用于农作物根系的研究。我们相信，通过改进对根系进行处理和观察的途径，诸如根芯片之类的微流控工具将为根系研究开辟新的维度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
芯片载体、软件及其他信息。	卡内基研究所 - 植物生物学系	载体制造的CAD和CNC文件、控制器软件以及更多信息可从以下网站下载：http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip。也可通过该网站订购芯片载体。
RootChip	斯坦福微加工中心	掩模设计和制造方案可根据要求提供。可直接使用的RootChips可从以下网址订购：http://www.stanford.edu/group/foundry/
芯片控制器	自制	自动阀门控制系统最初由劳伦斯伯克利国家实验室的Rafael Gómez-Sjöberg开发。有关如何自行搭建驱动阀门控制器的详细说明，请访问：https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers