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方法文章

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

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DOI:

10.3791/4294

2012年12月28日

本文内容

摘要

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型,定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质,且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。

摘要

细胞核中含有与基因调控功能关系最为密切的蛋白质组。成年哺乳动物心肌细胞的细胞核具有独特性,表现为双核细胞比例较高1,DNA主要处于异染色质状态,且心肌细胞本身不具备分裂能力,导致成年心肌细胞核长期处于分裂间期2。该器官在发育和疾病过程中的转录调控已被广泛研究3-5,但相对而言,尚不清楚的是负责DNA包装和表达的核蛋白所起的作用,以及这些蛋白如何调控疾病过程中发生的转录程序变化6。在发达国家,心脏病是男性和女性死亡的首要原因7。深入了解核蛋白如何协同作用以调控该疾病的进展,对于推动现有治疗手段的发展至关重要。

质谱技术是解决这些问题的理想工具,因为它能够对核蛋白质组进行无偏倚的注释,并相对定量这些蛋白质在疾病状态下的丰度变化。尽管已有若干针对哺乳动物核蛋白复合物的蛋白质组学研究,8-13 直到最近14 迄今为止,仅有一项研究探讨了心脏细胞核蛋白质组,且该研究仅针对整个细胞核,而未深入到核内亚结构层面的蛋白质组分析。15 在很大程度上,这一研究工作的缺乏源于分离心肌细胞核的困难。心肌细胞核位于一个坚固而致密的肌动蛋白-肌球蛋白结构内部,并通过内质网的多个突起与该结构相连,以致心肌细胞收缩会改变其整体形态。16 此外,心肌细胞的体积中有40%为线粒体17 这需要将细胞核从其他细胞器中分离富集。本文描述了一种心脏组织核富集及进一步分离为生物学相关组分的实验方案。此外,我们详细介绍了对这些组分进行无标记定量质谱分析的方法——这些技术适用于 体内 在代谢标记不可行的多种动物模型和器官系统中进行实验。

方案

实验流程包含七个主要步骤(图1)。对于任何涉及将样品用于质谱仪分析的操作,实验人员应穿戴实验服、手套和发网,并注意避免灰尘及人体角蛋白脱落造成的污染。

1. 心脏组织匀浆与细胞核分离

将小鼠心脏进行匀浆处理,并分离出完整的细胞核沉淀(图2)。

  1. 处死成年小鼠,取出心脏,用预冷的 PBS 冲洗,并在冰上用玻璃匀浆器(我们更倾向于使用 Fisher 公司的 Wheaton 组织研磨器,货号 #08-414-13A,但其他方法也可能同样有效)中加入 2 ml 裂解缓冲液(一种低渗溶液,可选择性裂解细胞膜而保留细胞器,包括细胞核)进行匀浆(裂解缓冲液组成为:10 mM Tris(pH 7.5)、15 mM NaCl 和 0.15% v/v Nonidet P-40 [NP-40],溶于去离子水中,并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物:10 mM 丁酸钠、0.1 mM 苯甲基磺酰氟 [PMSF]、0.2 mM Na3VO4、0.1 mM NaF 以及每 10 ml 裂解缓冲液加入 1 片 Roche 蛋白酶抑制剂片剂;裂解缓冲液可在 -20 °C 下保存最多一周)。(注意:我们发现无需用 PBS 灌注心脏,因为我们的质谱数据和 GO 分析显示所鉴定蛋白主要来源于心肌细胞....

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结果

图4 突出了这种相对定量方法的实用性。左侧面板显示了来自不同小鼠的单一同位素肽峰(叠加显示),这些肽峰被指定属于HMGB1蛋白(通过数据库搜索鉴定)。每个峰实质上是对应肽段的提取离子色谱图,来源于不同的小鼠。各组代表三种不同的生理状态:基础状态、心脏肥厚和心力衰竭,每组包含三个生物学重复。通过积分曲线下面积,可计算出相对丰度。中间面板展示了这些丰度的平均值。由此类分析可以明显看出,HMGB1蛋白的丰度在疾病发展过程中发生变化。相比之下,底部面板显示了组蛋白H4的示例,其丰度不随疾病状态改变。在这两种情况下,来自相同表型状态动物的肽段表现出相似的洗脱轮廓和相对丰度,证明了样品制备及液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)分析的可重复性。

通过主成分分析(PCA)进一步验证了该技术的可重复性。图5显示,对每只动物全蛋白质组结果进行方差分析(ANOVA)后,不同心脏表型(生物学重复)之间呈现出明显的聚类,且来自同一只动物的技术重复(同一样本的不同质谱运行)之间的关联最为紧密。这表明,所关注的各个蛋白质丰度的变化确实源于生.......

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讨论

此前已综述过两种主要的细胞核分离方法:27 一种是Behrens法,即在非水溶剂中匀浆冻干组织;另一种则是我们在本研究中所采用方法的原型,即在水相蔗糖/盐溶液中匀浆组织,随后进行差速离心或密度梯度离心。

通过对组织样本进行酸提取来分离细胞核亚组分,是研究染色质的重要工具,自1960年以来已被广泛应用28,最初目的是分析组蛋白。为此目标已开发出用于纯化核小体核心组蛋白组分的酸提取方案29。以往研究的一个局限性在于缺乏关于构成和修饰染色质的非组蛋白的信息;我们通过本实验方案解决了这一挑战,旨在表征细胞核及染色质中不同的生物学亚组分。该方法并行使用去垢剂提取或酸提取染色质,揭示了染色质调控分子的多样性,并能区分内源性调控的不同层次,因而为提出科学假设提供了一种可靠的方法。

将既定的酸提取方法应用于成年心肌细胞时会遇到某些障碍,包括致密的细胞骨架和大量的线粒体。尽管已有使用酸提取法对完整心脏组织进行研究的报道30,但这些实验均以靶向方式用于研究已知.......

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

Vondriska 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)下属国家心肺血液研究所和加州大学洛杉矶分校(UCLA)Laubisch 基金的支持。EM 获得了加州大学洛杉矶分校(UCLA)Jennifer S. Buchwald 生理学研究生奖学金;HC 获得了美国心脏协会(AHA)博士前奖学金;MP 获得了美国国立卫生研究院(NIH)Ruth Kirschstein 博士后奖学金;SF 获得了美国国立卫生研究院(NIH)K99 奖项。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基Invitrogen11965
蛋白酶小颗粒Roche04 693 159 001
100 μm 细胞筛BD Falcon352360
Ultracut 超薄切片机Reichert
100CX 透射电子
显微镜
JEOL USA, Inc.
OrioleBioRad161-0496
组蛋白 H2A 抗体Santa Cruzsc-8648
核孔蛋白 p62 抗体BD Biosciences610498
腺苷酸转运蛋白抗体Santa Cruzsc-9299
BiP 抗体Santa Cruzsc-1050
微管蛋白抗体SigmaT1568
组蛋白 H3 抗体Abcamab1791
纤维蛋白抗体Cell SignalingC12C3
SNRP70 抗体Abcamab51266
E2F-1 抗体Thermo FisherMS-879
视网膜母细胞瘤蛋白抗体BD Biosciences554136
缺氧诱导因子-1 抗体Novus BiologicalsNB100-469
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23227
反相色谱柱New ObjectivePFC7515-B14-10
BioWorks 浏览器Thermo Scientific

参考文献

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P.

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重印与许可

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