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方法文章

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

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DOI：

10.3791/4294

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2012年12月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

本文内容

摘要

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。

摘要

细胞核中含有与基因调控功能关系最为密切的蛋白质组。成年哺乳动物心肌细胞的细胞核具有独特性，表现为双核细胞比例较高1，DNA主要处于异染色质状态，且心肌细胞本身不具备分裂能力，导致成年心肌细胞核长期处于分裂间期2。该器官在发育和疾病过程中的转录调控已被广泛研究3-5，但相对而言，尚不清楚的是负责DNA包装和表达的核蛋白所起的作用，以及这些蛋白如何调控疾病过程中发生的转录程序变化6。在发达国家，心脏病是男性和女性死亡的首要原因7。深入了解核蛋白如何协同作用以调控该疾病的进展，对于推动现有治疗手段的发展至关重要。

质谱技术是解决这些问题的理想工具，因为它能够对核蛋白质组进行无偏倚的注释，并相对定量这些蛋白质在疾病状态下的丰度变化。尽管已有若干针对哺乳动物核蛋白复合物的蛋白质组学研究，8-13 直到最近14 迄今为止，仅有一项研究探讨了心脏细胞核蛋白质组，且该研究仅针对整个细胞核，而未深入到核内亚结构层面的蛋白质组分析。15 在很大程度上，这一研究工作的缺乏源于分离心肌细胞核的困难。心肌细胞核位于一个坚固而致密的肌动蛋白-肌球蛋白结构内部，并通过内质网的多个突起与该结构相连，以致心肌细胞收缩会改变其整体形态。16 此外，心肌细胞的体积中有40%为线粒体17 这需要将细胞核从其他细胞器中分离富集。本文描述了一种心脏组织核富集及进一步分离为生物学相关组分的实验方案。此外，我们详细介绍了对这些组分进行无标记定量质谱分析的方法——这些技术适用于 体内 在代谢标记不可行的多种动物模型和器官系统中进行实验。

方案

实验流程包含七个主要步骤（图1）。对于任何涉及将样品用于质谱仪分析的操作，实验人员应穿戴实验服、手套和发网，并注意避免灰尘及人体角蛋白脱落造成的污染。

1. 心脏组织匀浆与细胞核分离

将小鼠心脏进行匀浆处理，并分离出完整的细胞核沉淀（图2）。

  1. 处死成年小鼠，取出心脏，用预冷的 PBS 冲洗，并在冰上用玻璃匀浆器（我们更倾向于使用 Fisher 公司的 Wheaton 组织研磨器，货号 #08-414-13A，但其他方法也可能同样有效）中加入 2 ml 裂解缓冲液（一种低渗溶液，可选择性裂解细胞膜而保留细胞器，包括细胞核）进行匀浆（裂解缓冲液组成为：10 mM Tris（pH 7.5）、15 mM NaCl 和 0.15% v/v Nonidet P-40 [NP-40]，溶于去离子水中，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物：10 mM 丁酸钠、0.1 mM 苯甲基磺酰氟 [PMSF]、0.2 mM Na3VO4、0.1 mM NaF 以及每 10 ml 裂解缓冲液加入 1 片 Roche 蛋白酶抑制剂片剂；裂解缓冲液可在 -20 °C 下保存最多一周）。(注意：我们发现无需用 PBS 灌注心脏，因为我们的质谱数据和 GO 分析显示所鉴定蛋白主要来源于心肌细胞 [p 值 3.8E-22]，而非血液污染 [p 值 5.0E-2]。)
  2. 将裂解液通过 100 μm 滤网过滤，收集滤过液至 1.5 ml 离心管中。此后，除非另有说明，样品应始终保持在冰上。
  3. 在 4 °C 条件下以 4,000 rpm 离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液（此为胞质组分，应储存于 -80 °C；其中含有已裂解的线粒体）。通过吹打将沉淀重悬于 200 μl 裂解缓冲液中（此为粗核沉淀）。
  5. 在 1.5 ml 离心管中加入 1 ml 蔗糖缓冲液（24% 蔗糖 w/v、10 mM Tris（pH 7.5）、15 mM NaCl 溶于去离子水中，并添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物；蔗糖缓冲液需在使用当天新鲜配制）。将重悬的沉淀轻轻铺在蔗糖垫上方，在 4 °C 条件下以 5,000 rpm 离心 10 分钟。
  6. 去除上层薄膜及蔗糖垫（其中含有膜成分）。用 200 μl 预冷的 PBS/EDTA（含 1 mM EDTA 的 1× PBS）冲洗剩余沉淀（此为细胞核沉淀，可用于溶解或固定后进行 Western 印迹或电子显微镜分析 [见步骤 4.1 和 4.2]，以评估富集程度）。

2. 核质与去垢剂提取的染色质分级分离

将粗核沉淀分离为核质和经去垢剂提取的染色质组分，后者含有与DNA松散结合的蛋白质。

  1. 将步骤1.6得到的沉淀用200 μl去垢剂提取缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.6，7.5 mM MgCl2，0.2 mM EDTA，30 mM NaCl，1 M 尿素，1% NP-40溶于去离子水中，加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物——去垢剂提取缓冲液可在-20 °C保存最多一周）重悬。
  2. 涡旋震荡样品2次，每次10秒，期间将样品置于冰上孵育10分钟。
  3. 在4 °C下以13,000 rpm离心5分钟。
  4. 移除上清液（此为核浆组分，应于-80 °C保存）。用预冷的PBS/EDTA缓冲液清洗沉淀（此为染色质沉淀）。
  5. 将沉淀用300 μl Tris、SDS、EDTA缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，10 mM EDTA，1% SDS溶于去离子水中，加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物——Tris、SDS、EDTA缓冲液可在-20 °C保存最多一周）重悬。
  6. 超声处理3–6次，每次10秒，以剪切DNA。每次超声之间将样品置于冰上冷却。
  7. 在4 °C下以13,000 rpm离心5分钟，保留上清液（此为去垢剂提取的染色质蛋白组分，应于-80 °C保存）。剩余沉淀较小，可弃去。
  8. 若使用分离的心肌细胞而非完整心脏：通过酶消化法从出生后一天的大鼠幼崽中分离新生大鼠心室心肌细胞，随后在含10%胎牛血清（FBS）、1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（ITS）和1%青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中进行培养。24小时后，更换为无血清培养基（成分同上，但不含FBS）。用裂解缓冲液（见1.1）收集细胞，并从步骤1.3开始进行核组分分离。

3. 酸提取分级分离——DNA结合蛋白富集

另一种分步分离方法用于富集与DNA紧密结合的蛋白质，包括组蛋白。

  1. 重复步骤 1.1-2.4。
  2. 用 400 μl 的 0.4 N 硫酸重悬染色质沉淀。涡旋振荡以去除团块。
  3. 在 4 °C 下孵育 30 分钟或过夜，同时旋转。
  4. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除核碎片。
  5. 将上清液转移至新离心管中。
  6. 逐滴加入 132 μl 三氯乙酸至上清液中，颠倒混匀数次。冰上孵育 30 分钟。
  7. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
  8. 弃去上清液。用预冷的丙酮轻轻冲洗沉淀。（此为组蛋白沉淀。）
  9. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
  10. 重复洗涤步骤 3.8–3.9。
  11. 将沉淀在空气中干燥。
  12. 用 100 μl Tris、SDS、EDTA 缓冲液重悬沉淀。通过加入 1 M Tris 将 pH 调至 8。（使用未调节 pH 的 1 M Tris 储存液。）
  13. 在水浴中超声处理 15 分钟。通过向水浴中添加冰防止过热。（此为酸提取组分，应保存于 -80 °C。）

4. 纯度检测

Western印迹和电子显微镜证实了细胞核的有效富集以及其他细胞器的成功去除。欲了解以下所有质量控制检测的典型结果，请参见我们之前的发表文献。18

  1. 进行蛋白质印迹分析。使用组蛋白 H2A 或核孔蛋白 p62 的探针检测各组分膜（作为核标记物以验证富集效果），并分别使用腺苷酸转运蛋白、BiP 和微管蛋白的探针（作为线粒体标记物、内质网标记物和细胞骨架标记物）以验证组分纯度。为验证核的亚组分分离成功，使用组蛋白 H3 或 fibrillarin 的探针（分别对应去污剂和酸提取的染色质以及完整细胞核），以及 SNRP70 或 E2F 的探针（核质组分）。使用视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma）或缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1）的探针检测（在去污剂提取的染色质中富集程度高于酸提取组分）。也可在同一凝胶中运行 HeLa 细胞裂解液和全心组织裂解液的额外对照样品：制备 HeLa 细胞裂解液对照时，向培养皿中加入 Tris、SDS、EDTA 缓冲液，并用细胞刮刀收集样品；按步骤 2.6–2.7 进行超声处理和离心。制备全心组织裂解液对照时，将心脏组织在 2 ml 缓冲液（20 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM 甘油磷酸钠，溶于去离子水中，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）中匀浆化，然后按步骤 2.6–2.7 进行超声处理和离心。有关 SDS-PAGE 蛋白样品的制备，请参见步骤 5。
  2. 电子显微镜检测：将步骤 1.6 中获得的细胞核沉淀重悬于含有 2% 戊二醛的裂解缓冲液中，并在 4 °C 下固定样品。用锇酸冲洗样品，脱水后包埋于环氧树脂中。使用 Reichert Ultracut 超薄切片机切割 70 nm 的切片。先用醋酸铀染色，再用铅染色，随后使用 JEOL 100CX 透射电子显微镜成像。通过测量完整细胞核面积占成像总材料面积的比例来定量富集程度。我们发现完整细胞核的比例为 60–80%。14

关于细胞核富集与纯化的关键考量。本实验方案旨在实现对心脏染色质的蛋白质组学分析，以研究疾病过程中全局基因调控机制。设计全蛋白质组质谱实验时，一个主要问题是动态范围，以及能否鉴定和表征低丰度蛋白质。除了提供有关细胞核和染色质特异性生物学信息的主要目标外，对核蛋白质组进行富集可提高检测这些低丰度蛋白质的可能性，进一步对细胞核进行亚组分分离亦有帮助。然而，如前所述，成年心肌细胞具有致密的细胞骨架结构，与核膜相连。我们认为，尚未能完全将细胞核从其他细胞组分中彻底纯化。但通过仅富集细胞核组分，我们已达到可接受的阈值，足以支持所描述类型分析的开展。

具体而言，我们已采用电子显微镜（EM）评估粗提细胞核沉淀的纯度，发现其中60–80%为完整细胞核，约10%为线粒体，其余为碎片。此外，根据我们此前对完整细胞核群体的研究可知，尽管该实验方案并未富集多种肌原纤维蛋白（如通过Western blot检测到的微管蛋白和肌动蛋白），但某些蛋白（如calsarcin-1）得到了富集，提示这些蛋白在心肌细胞核中确实存在特定的生物学分布。19

此外，我们将酸提取染色质组分中检测到的蛋白质与基因本体（gene ontology）预测的这些蛋白质功能进行了比较。重要的是，该基因本体分析并未考虑不同蛋白质的相对丰度（而我们的Western blot数据则反映了丰度信息），而是在鉴定共同通路和细胞区室时，将所有鉴定出的蛋白质（无论是否富集）视为同等重要。这些通路和细胞区室的分析结果可参见我们之前的发表文献18,20。尤为关键的是，酸提取染色质组分的有效富集使我们能够在成年小鼠心肌细胞中鉴定出54种组蛋白变体18，其中许多依赖于唯一的特征性肽段进行鉴定，因此鉴于整个心肌细胞蛋白质组的极高复杂性，若无此富集方案，这些组蛋白变体很可能无法被检测到。在我们从心脏细胞核中鉴定出的1,048种蛋白质中，有56种（5.3%）经GO分析注释为核小体组分（即目标细胞核中的一个组成部分）。另一项针对整个心脏组织的研究鉴定了6,180种蛋白质，其中仅有11种（0.18%）被注释为属于核小体21。这一对比进一步凸显了本实验方案在有效富集核蛋白方面的显著优势。

5. 蛋白质凝胶电泳与酶解消化

蛋白质通过一维SDS-PAGE分离后，用胰蛋白酶消化，用于质谱仪分析。

  1. 将样品置于冰上解冻，并使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。
  2. 使用5倍拉梅利缓冲液将样品稀释至已知浓度，煮沸10分钟，然后于-20 °C保存，用于一维SDS-PAGE。使用尿素提取缓冲液将样品稀释至已知浓度，并于-20 °C保存，用于二维凝胶电泳。
  3. 选择合适的凝胶进行电泳，每条泳道上样等量蛋白。可将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用于后续Western blot检测（如步骤4.1中的对照），或切取条带用于质谱分析；详见后续步骤。
  4. 使用去离子水将凝胶从电泳装置中取出，并转移至洁净容器中。加入Oriole染色液覆盖凝胶，并用铝箔包裹容器以避光。将凝胶置于摇床上，室温孵育至少90分钟。
  5. 使用紫外光成像Oriole染色的凝胶（图3），并在图像上标记将要切取的条带位置。在测定全蛋白质组的研究中，我们将每条泳道切成约25段、每段2毫米的条带。
  6. 将凝胶置于洁净的表面上。仅使用保持密封或经乙醇喷雾处理的材料，以防止角蛋白污染。逐一切下各条带，再将其进一步切成三个相等的小段。将每条带的三段小块一同放入标记好的1.5 ml离心管中。凝胶小块可在-20 °C保存数月。
  7. 准备凝胶胶粒用于酶解消化。在37 °C下用胰蛋白酶过夜消化凝胶小块。详细的凝胶样品处理方案请参见我们之前的发表文献22。对于低分子量条带，可使用糜蛋白酶替代胰蛋白酶进行消化，以避免胰蛋白酶对组蛋白尾部的过度切割。

6. 质谱分析与数据分析

样品通过液相色谱分离，并采用串联质谱进行分析。将质谱图与蛋白质数据库进行比对，以实现蛋白质鉴定。

  1. 将每种样品各取 10 μl 进行 LC/MS/MS 分析。我们使用 nano-flow Eskigent 液相色谱系统，配备 75 μm 反相色谱柱。采用针对多种蛋白质和肽段优化的液相色谱程序。使用线性梯度洗脱，流动相 A 为含 0.1% 甲酸、2% 乙腈（ACN）的水溶液，流动相 B 为含 0.1% 甲酸、20% 水的乙腈溶液：在 60 分钟内从 5% B 相线性升至 50% B 相，随后 15 分钟内从 50% B 相升至 95% B 相，最后在 95% B 相条件下保持 10 分钟。流速设定为 200 nl/min。以数据依赖模式采集质谱数据。我们使用 Thermo Orbitrap 质谱仪，对丰度最高的前 6 个母离子进行碎裂分析。
  2. 至少进行三次生物学重复和两次技术重复实验。（推荐）
  3. 使用软件（商业软件包括 BioWorks 和 Xcalibur；公开可用软件包括 PROWL、X!Tandem、SpectraST）通过搜索算法（如 SEQUEST 或 MASCOT）将质谱图与选定的 Uniprot 数据库进行比对。
  4. 建议调整搜索参数，允许半胱氨酸的羧甲基化修饰和甲硫氨酸的氧化修饰，这两种修饰在样品处理过程中较为常见。
  5. 通过反向数据库搜索计算假阳性率。
  6. 对蛋白质鉴定结果进行筛选，仅保留达到设定置信阈值的匹配结果。建议初始筛选参数如下：Xcorr >3（+2 电荷），>4（+3 电荷），>5（+4 电荷）；deltaCN >0.1，共识得分 ≥20，母离子质量容差为 2 Da，子离子质量容差为 0.5 Da，每个蛋白质至少包含 2 条独特肽段，且酶切位点错切不超过 3 次。

7. 无标记定量

使用无标记定量法确定蛋白质的相对丰度（图4）。

  1. 目前已有多种公开或商业化的软件程序可用于质谱数据的非标记定量分析，包括 Census（Yates 教授团队）23、Elucidator（Microsoft）24、SIEVE（Thermo Scientific）25 和 Scaffold（Proteome Software）26。这些程序旨在将完整肽段的质谱信号强度或肽段测序事件的数量与两种或多种状态之间的相对蛋白质丰度相关联。
  2. 尽管各程序均采用相似的分析流程，但某些程序对可执行的数据分析类型存在限制。首先，需对不同运行批次的数据进行对齐，对信号强度进行归一化处理，并筛选用于分析的肽段峰。
  3. 目前最常用的两种方法是基于谱图计数或液相色谱-质谱（LC-MS）峰面积的定量方法。通过计算丰度比值，确定不同组间肽段丰度的变化。
  4. 这些程序可与蛋白质组学搜索算法（如 Mascot、Sequest、X!Tandem）联用，将定量信息与蛋白质鉴定结果进行关联。
  5. 为确保数据的准确性与可重复性，必须同时纳入生物学重复（不同实验样本）和技术重复（同一样本在质谱仪上多次运行）的质谱数据。
  6. 可通过方差分析（ANOVA）评估不同实验条件下肽段丰度的变异情况，并通过主成分分析（PCA）进行可视化展示（图5）。

无标记定量的重要注意事项 在进行无标记定量时，必须特别注意确保样品制备、消化时间以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）条件的一致性，因为每个样品都需要单独处理和分析。与代谢标记方法不同，无标记实验中的比较是基于不同质谱运行所获得的数据（由于缺乏标记，无法将样品混合上机检测），因此要求样品分析的各个方面均具备高度的可重复性。即 样品制备、液相色谱和质谱步骤）以及高分辨质谱仪的使用。

为消除样品制备和分析过程中可能出现的微小差异，可在每个样品中加入已知的标准品，以辅助数据的标准化。此外，大多数软件程序均支持对信号强度进行标准化处理。例如 通过在数据采集后调整背景噪音或已知高丰度分析物，以校正进样、离子化和碎裂过程中的差异。上述多数软件程序中均包含对齐算法，可辅助校正肽段洗脱谱型的差异。在此类研究中，生物重复和技术重复的使用至关重要，因其可支持统计分析，以确认所观察到的蛋白质丰度变化的可重复性与一致性。

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结果

图4 突出了这种相对定量方法的实用性。左侧面板显示了来自不同小鼠的单一同位素肽峰（叠加显示），这些肽峰被指定属于HMGB1蛋白（通过数据库搜索鉴定）。每个峰实质上是对应肽段的提取离子色谱图，来源于不同的小鼠。各组代表三种不同的生理状态：基础状态、心脏肥厚和心力衰竭，每组包含三个生物学重复。通过积分曲线下面积，可计算出相对丰度。中间面板展示了这些丰度的平均值。由此类分析可以明显看出，HMGB1蛋白的丰度在疾病发展过程中发生变化。相比之下，底部面板显示了组蛋白H4的示例，其丰度不随疾病状态改变。在这两种情况下，来自相同表型状态动物的肽段表现出相似的洗脱轮廓和相对丰度，证明了样品制备及液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）分析的可重复性。

通过主成分分析（PCA）进一步验证了该技术的可重复性。图5显示，对每只动物全蛋白质组结果进行方差分析（ANOVA）后，不同心脏表型（生物学重复）之间呈现出明显的聚类，且来自同一只动物的技术重复（同一样本的不同质谱运行）之间的关联最为紧密。这表明，所关注的各个蛋白质丰度的变化确实源于生...

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讨论

此前已综述过两种主要的细胞核分离方法：27 一种是Behrens法，即在非水溶剂中匀浆冻干组织；另一种则是我们在本研究中所采用方法的原型，即在水相蔗糖/盐溶液中匀浆组织，随后进行差速离心或密度梯度离心。

通过对组织样本进行酸提取来分离细胞核亚组分，是研究染色质的重要工具，自1960年以来已被广泛应用28，最初目的是分析组蛋白。为此目标已开发出用于纯化核小体核心组蛋白组分的酸提取方案29。以往研究的一个局限性在于缺乏关于构成和修饰染色质的非组蛋白的信息；我们通过本实验方案解决了这一挑战，旨在表征细胞核及染色质中不同的生物学亚组分。该方法并行使用去垢剂提取或酸提取染色质，揭示了染色质调控分子的多样性，并能区分内源性调控的不同层次，因而为提出科学假设提供了一种可靠的方法。

将既定的酸提取方法应用于成年心肌细胞时会遇到某些障碍，包括致密的细胞骨架和大量的线粒体。尽管已有使用酸提取法对完整心脏组织进行研究的报道30，但这些实验均以靶向方式用于研究已知...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

Vondriska 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家心肺血液研究所和加州大学洛杉矶分校（UCLA）Laubisch 基金的支持。EM 获得了加州大学洛杉矶分校（UCLA）Jennifer S. Buchwald 生理学研究生奖学金；HC 获得了美国心脏协会（AHA）博士前奖学金；MP 获得了美国国立卫生研究院（NIH）Ruth Kirschstein 博士后奖学金；SF 获得了美国国立卫生研究院（NIH）K99 奖项。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基Invitrogen11965
蛋白酶小颗粒Roche04 693 159 001
100 μm 细胞筛BD Falcon352360
Ultracut 超薄切片机Reichert
100CX 透射电子
显微镜		JEOL USA, Inc.
OrioleBioRad161-0496
组蛋白 H2A 抗体Santa Cruzsc-8648
核孔蛋白 p62 抗体BD Biosciences610498
腺苷酸转运蛋白抗体Santa Cruzsc-9299
BiP 抗体Santa Cruzsc-1050
微管蛋白抗体SigmaT1568
组蛋白 H3 抗体Abcamab1791
纤维蛋白抗体Cell SignalingC12C3
SNRP70 抗体Abcamab51266
E2F-1 抗体Thermo FisherMS-879
视网膜母细胞瘤蛋白抗体BD Biosciences554136
缺氧诱导因子-1 抗体Novus BiologicalsNB100-469
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23227
反相色谱柱New ObjectivePFC7515-B14-10
BioWorks 浏览器Thermo Scientific

参考文献

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