本文所述方法利用昆虫病原细菌直接注射到烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫的血腔中。M. sexta 是一种 commercially available 且研究充分的昆虫。因此，该方法为从宿主和/或细菌单方或双方的角度分析宿主-细菌相互作用提供了一种简便的途径。
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摘要
摘要
Manduca sexta（通常称为烟草天蛾）是一种重要的农业害虫，以茄科植物（如烟草和番茄）为食。由于M. sexta幼虫对多种昆虫病原细菌具有易感性1-5，且关于该昆虫免疫系统的相关信息丰富6-8，同时其基因组序列即将公布9，因此它是研究病原过程中宿主-微生物相互作用的理想模式生物。此外，与其他易感昆虫物种相比，M. sexta幼虫体型相对较大，在实验室中易于操作和饲养。其较大的体型也有利于高效提取组织和血淋巴，用于分析宿主对感染的免疫应答。
本文所述方法为将细菌直接注射到血腔（血液腔隙）中 M. sexta 幼虫。该方法通过注射后简单监测昆虫死亡时间，即可用于分析和比较不同细菌物种、菌株或突变体的毒力特征。本方法最初开发用于研究细菌的致病性。 Xenorhabdus 和 Photorhabdus 物种，这些物种通常与线虫媒介共生，借此进入昆虫体内。昆虫病原性线虫通常通过幼虫的自然消化道或呼吸孔感染，并在短时间内将其共生细菌释放到昆虫的血淋巴（血液）中10该注射方法无需线虫载体，从而将细菌与线虫对昆虫的影响分离开来。该方法可对接种物中的感染性物质（细胞或蛋白）进行准确定量，而现有的其他昆虫病原性分析方法（包括刺伤法）均无法实现这一目的。11 和口服毒性检测12. 此外，口服毒性检测用于评估分泌型毒素在进入幼虫消化系统后的毒力，而直接注射法则用于评估全细胞接种物的毒力。
本文所述直接注射方法的用途是通过监测昆虫死亡率来分析细菌致病性。然而，该方法也可轻松拓展用于研究感染对M. sexta免疫系统的影响。昆虫通过体液免疫和细胞免疫两种机制应对感染。体液免疫包括对细菌相关模式的识别，进而产生多种抗菌肽7；可通过RNA提取和定量PCR13检测直接感染后编码这些抗菌肽的基因表达水平。细胞免疫反应则包括血细胞对病原体的结节形成、包囊和吞噬作用6。为分析这些免疫反应，可对注射后的昆虫进行解剖，并通过显微镜观察13, 14。
方案
1. 昆虫卵的消毒与饲养
- 首先将15 g提供的琼脂加入900–1,000 ml H₂O中，高压灭菌，制备培养基2O. 高压灭菌后立即与166 g小麦胚芽饲料混合，并在实验室搅拌器中充分混匀。倒入培养皿（或多个培养皿）中冷却，然后将饲料转移至铝箔纸中，紧密包裹后于4 °C保存。
- 到达后，进行灭菌 M. sexta 在玻璃滤器装置和真空抽滤瓶中，使用90 mm滤纸，将卵与250 ml 0.6%次氯酸钠溶液混合，偶尔搅拌，处理2–3分钟。
- 打开真空泵以排出漂白液，并用250 ml无菌蒸馏水洗涤卵3-4次。2每次洗涤操作。
- 将卵转移至置于培养皿盖内的新鲜90 mm滤纸上，晾干至卵不再相互粘连（约20-30分钟）。
- 将卵转移至装有昆虫饲料的塑料容器底部，每个容器中放置约40枚卵（图1A将卵与食物分离，以防止因潮湿引起的真菌污染。将卵置于26 °C环境中，保持16小时光照：8小时黑暗的光周期。孵化前卵会变为浅黄色至白色。
- 孵化完成后，小心地将约25条幼虫分别转移至底部含有饲料的新容器中（图 1B）。使用镊子夹住幼虫的长黑色角来拾取每一只幼虫，以避免在其脆弱的早期发育阶段造成损伤。按上述条件孵育2天。尽管此阶段幼虫死亡并不常见，但仍可能观察到个别死亡或更可能是发育受阻的幼虫。此类昆虫应排除在后续研究之外，并通过冷冻处死。
- 为避免同类相食行为，将幼虫转移至单独的容器中，并放入少量食物图1C）并按上述方法孵育。观察昆虫发育情况，每隔一天更换食物并清理容器中的粪便，直至其经历第三次幼虫蜕皮（通常在孵化后6-9天）。此为第四龄幼虫阶段。th 幼虫龄期，其特征是每个腹足上出现黑色钩状趾钩，且昆虫体表的条纹更加明显（图1D）。幼虫的大小可能差异较大，但通常在进入第4龄期时体重为0.15–0.4 gth 龄期阶段。应选择体型相近的幼虫进行注射。
2. 注射用细菌的制备
- 根据标准操作流程，将待测细菌菌株培养至所需测试的生长阶段。
- 取每种待测细菌菌株500 μl，在室温下以13,000 rpm离心2分钟，收集菌体沉淀。
- 将菌体重悬于1 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，按上述条件再次离心收集菌体。
- 将菌体重悬于0.5 ml无菌1×PBS中，测定菌悬液的光密度（OD），必要时将所有菌悬液调整至相同的OD值。如需要，也可使用无菌培养基代替1×PBS进行菌体重悬和稀释。
3. 4的注射th 龄期幼虫
- 在96孔微量培养板的6个孔中，用无菌1×PBS对第一种细菌菌株进行连续10倍梯度稀释，每次稀释均使用新的移液器吸头（图2A每个孔中细胞悬液的最终体积应超过注射所需体积（每只昆虫10 μl）加上20 μl接种液铺板用量（见步骤3.2和3.7）。
- 每个稀释度取 10 μl，共 5 个稀释度（10-2 通过 10-6) 沿含有适当培养基的培养皿上部进行点样。倾斜培养皿，使样点向中心扩散（图2B).
- 移除昆虫食物和粪便，将昆虫放入容器中置于冰上约5分钟。
- 用70-100%乙醇的两管溶液分别冲洗注射器针头3次，每管各洗3次，然后在无菌H₂O中冲洗一次，对针头进行灭菌2O (图2C）。液体的体积必须足以浸没针头。
- 使用血细胞计数板在显微镜下定量稀释后的细胞悬液。根据所需接种量，从相应的微量培养孔中吸取10 μl图2D).
- 用95%乙醇擦拭昆虫体表，以小于45°的角度将10 ml细胞悬液注射到腹足之一的后方。注意避免刺破肠道，将液体注入表皮层下方即可图2E）。虽然有少量血淋巴（透明的蓝绿色液体）流失是正常现象，但若注射部位出现颗粒物或黄色液体，则表明可能刺穿了肠道。一旦发生此情况，应立即处死该昆虫，并更换新的幼虫。
- 对第一注射组中剩余的每只昆虫重复步骤3.6。若使用相同稀释度和菌株的细菌进行注射，且未发生污染，则每次注射之间无需对针头进行灭菌。 Alternatively，可使用重复加样器以提高各样本间注射体积的一致性。
- 注射第一种细菌菌株后，重复步骤3.2，此次将细胞悬液点在平板中央，使其向底部流动图 2F）。将平板置于适当的温度下孵育，并计数菌落以确定接种物的数量。此第二次涂布步骤用于验证注射过程中样品是否受到污染，因为若发生污染，第一次和第二次涂布的菌落数量将出现明显差异。
- 对实验中的每种细菌菌株重复步骤 3.1 至 3.8。最后，使用无菌针头向 3–5 只昆虫注射无菌 1× PBS，作为阴性对照组。将昆虫置于 26 °C 条件下培养，光照周期为 16 小时光照：8 小时黑暗。
- 随时间监测注射后昆虫的存活情况。昆虫死亡的特征为受到刺激后无自主运动。昆虫在死亡前感染期间常表现出食欲减退、腹泻（水样、黄色排泄物）和/或失水（“出汗”）等症状；这些特征也值得记录。
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结果
一个昆虫死亡率测定实验的代表性示例如下所示 图3在本实验中，昆虫被注射了约50个菌落形成单位（CFU）的野生型（ATCC19061）或减毒突变株lrp13的 Xenorhabdus nematophila 培养至对数生长期中期（每种菌株接种6只昆虫）。接种后约72小时内持续观察昆虫存活情况，记录各时间点存活昆虫的百分比。在此情况下，减毒菌株在杀灭昆虫方面表现出明显的延迟；野生型菌株在接种后30小时内杀死了全部6只幼虫，而此时任何接种突变株的幼虫均尚未死亡。
图1. 注射前昆虫的饲养准备。A) 将约40个表面灭...
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讨论
如本文所述，将昆虫病原细菌直接注射到M. sexta幼虫体内，是一种分析细菌毒力的简单而有效的方法。该方法还具有高度的适应性，可灵活适用于不同的实验对象和/或实验条件。在注射前，细菌可通过多种方式制备。以X. nematophila为例，通常在营养丰富的Luria-Bertani（LB）培养基中培养至对数中期的野生型细胞毒力最强，注射后30小时内可杀死大部分甚至全部昆虫。处于稳定期的细胞则通常需要多花5–10小时才能杀死幼虫。尽管生长阶段会影响毒力，但注射的细菌总数似乎影响较小16，通常接种量范围为20至20,000 CFU。事实上，对于Xenorhabdus和Photorhabdus菌种，仅需5 CFU即可杀死昆虫宿主17。为了评估对乙醇灭菌具有抗性的细菌物种（如Bacillus菌属）的毒力特性，可使用一次性注射针头代替乙醇灭菌步骤（步骤3.4），以分别注射各独特菌株。
对该方法的进一步调整可能涉及饲养和/或操作方式的改变 M. sext...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Goodrich-Blair实验室的前成员Samantha Orchard、Kimberly Cowles、Erin Herbert-Tran、Greg Richards、Megan Menard和Youngjin Park为本实验方案的建立所做出的贡献。本研究工作由美国国家科学基金会资助项目IOS-0950873以及美国国立卫生研究院NRSA博士后奖学金FAI084441Z资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 90 mm 滤纸 | Whatman | 1001 090 | |
| 玻璃滤器支架 | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta 卵 | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| 舞毒蛾饲料 + 琼脂 | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 盎司塑料容器及盖子 | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 盎司塑料容器及盖子 | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1× PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| 注射器 | Hamilton | 80208 | 30 号，0.375" 长，2 型针尖 |
参考文献
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