饲养与注射烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫以评估细菌毒力

摘要

本文所述方法利用昆虫病原细菌直接注射到烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫的血腔中。M. sexta 是一种 commercially available 且研究充分的昆虫。因此，该方法为从宿主和/或细菌单方或双方的角度分析宿主-细菌相互作用提供了一种简便的途径。

摘要

Manduca sexta（通常称为烟草天蛾）是一种重要的农业害虫，以茄科植物（如烟草和番茄）为食。由于M. sexta幼虫对多种昆虫病原细菌具有易感性^1-5，且关于该昆虫免疫系统的相关信息丰富^6-8，同时其基因组序列即将公布⁹，因此它是研究病原过程中宿主-微生物相互作用的理想模式生物。此外，与其他易感昆虫物种相比，M. sexta幼虫体型相对较大，在实验室中易于操作和饲养。其较大的体型也有利于高效提取组织和血淋巴，用于分析宿主对感染的免疫应答。

本文所述方法为将细菌直接注射到血腔（血液腔隙）中 M. sexta 幼虫。该方法通过注射后简单监测昆虫死亡时间，即可用于分析和比较不同细菌物种、菌株或突变体的毒力特征。本方法最初开发用于研究细菌的致病性。 Xenorhabdus 和 Photorhabdus 物种，这些物种通常与线虫媒介共生，借此进入昆虫体内。昆虫病原性线虫通常通过幼虫的自然消化道或呼吸孔感染，并在短时间内将其共生细菌释放到昆虫的血淋巴（血液）中¹⁰该注射方法无需线虫载体，从而将细菌与线虫对昆虫的影响分离开来。该方法可对接种物中的感染性物质（细胞或蛋白）进行准确定量，而现有的其他昆虫病原性分析方法（包括刺伤法）均无法实现这一目的。¹¹ 和口服毒性检测¹². 此外，口服毒性检测用于评估分泌型毒素在进入幼虫消化系统后的毒力，而直接注射法则用于评估全细胞接种物的毒力。

本文所述直接注射方法的用途是通过监测昆虫死亡率来分析细菌致病性。然而，该方法也可轻松拓展用于研究感染对M. sexta免疫系统的影响。昆虫通过体液免疫和细胞免疫两种机制应对感染。体液免疫包括对细菌相关模式的识别，进而产生多种抗菌肽⁷；可通过RNA提取和定量PCR¹³检测直接感染后编码这些抗菌肽的基因表达水平。细胞免疫反应则包括血细胞对病原体的结节形成、包囊和吞噬作用⁶。为分析这些免疫反应，可对注射后的昆虫进行解剖，并通过显微镜观察^{13, 14}。

方案

1. 昆虫卵的消毒与饲养

1. 首先将15 g提供的琼脂加入900–1,000 ml H₂O中，高压灭菌，制备培养基₂O. 高压灭菌后立即与166 g小麦胚芽饲料混合，并在实验室搅拌器中充分混匀。倒入培养皿（或多个培养皿）中冷却，然后将饲料转移至铝箔纸中，紧密包裹后于4 °C保存。
2. 到达后，进行灭菌 M. sexta 在玻璃滤器装置和真空抽滤瓶中，使用90 mm滤纸，将卵与250 ml 0.6%次氯酸钠溶液混合，偶尔搅拌，处理2–3分钟。
3. 打开真空泵以排出漂白液，并用250 ml无菌蒸馏水洗涤卵3-4次。₂每次洗涤操作。
4. 将卵转移至置于培养皿盖内的新鲜90 mm滤纸上，晾干至卵不再相互粘连（约20-30分钟）。
5. 将卵转移至装有昆虫饲料的塑料容器底部，每个容器中放置约40枚卵（图1A将卵与食物分离，以防止因潮湿引起的真菌污染。将卵置于26 °C环境中，保持16小时光照：8小时黑暗的光周期。孵化前卵会变为浅黄色至白色。
6. 孵化完成后，小心地将约25条幼虫分别转移至底部含有饲料的新容器中（图 1B）。使用镊子夹住幼虫的长黑色角来拾取每一只幼虫，以避免在其脆弱的早期发育阶段造成损伤。按上述条件孵育2天。尽管此阶段幼虫死亡并不常见，但仍可能观察到个别死亡或更可能是发育受阻的幼虫。此类昆虫应排除在后续....

结果

一个昆虫死亡率测定实验的代表性示例如下所示 图3在本实验中，昆虫被注射了约50个菌落形成单位（CFU）的野生型（ATCC19061）或减毒突变株lrp¹³的 Xenorhabdus nematophila 培养至对数生长期中期（每种菌株接种6只昆虫）。接种后约72小时内持续观察昆虫存活情况，记录各时间点存活昆虫的百分比。在此情况下，减毒菌株在杀灭昆虫方面表现出明显的延迟；野生型菌株在接种后30小时内杀死了全部6只幼虫，而此时任何接种突变株的幼虫均尚未死亡。

图1. 注射前昆虫的饲养准备。A) 将约40个表面灭.......

讨论

如本文所述，将昆虫病原细菌直接注射到M. sexta幼虫体内，是一种分析细菌毒力的简单而有效的方法。该方法还具有高度的适应性，可灵活适用于不同的实验对象和/或实验条件。在注射前，细菌可通过多种方式制备。以X. nematophila为例，通常在营养丰富的Luria-Bertani（LB）培养基中培养至对数中期的野生型细胞毒力最强，注射后30小时内可杀死大部分甚至全部昆虫。处于稳定期的细胞则通常需要多花5–10小时才能杀死幼虫。尽管生长阶段会影响毒力，但注射的细菌总数似乎影响较小¹⁶，通常接种量范围为20至20,000 CFU。事实上，对于Xenorhabdus和Photorhabdus菌种，仅需5 CFU即可杀死昆虫宿主¹⁷。为了评估对乙醇灭菌具有抗性的细菌物种（如Bacillus菌属）的毒力特性，可使用一次性注射针头代替乙醇灭菌步骤（步骤3.4），以分别注射各独特菌株。

对该方法的进一步调整可能涉及饲养和/或操作方式的改变 M. sext.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
90 mm 滤纸	Whatman	1001 090
玻璃滤器支架	Millipore	XX1004700
Manduca sexta 卵	Carolina Biological Supply	143880
舞毒蛾饲料 + 琼脂	MP Biomedicals	0296029301
5.5 盎司塑料容器及盖子	Solo Cup Company	URC55-0090 Pl4-0090
1 盎司塑料容器及盖子	DART Container Corporation	100PC 100PCL25
1× PBS			137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4
注射器	Hamilton	80208	30 号，0.375" 长，2 型针尖