使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

摘要

为了研究Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的共生关系，研究人员开发了用于监测细菌在线虫体内存在情况及定位的方法。该实验方法可应用于其他系统，其核心步骤是通过基因工程使细菌表达绿色荧光蛋白，并利用荧光显微镜观察透明线虫体内的荧光标记细菌。

摘要

共生是指两种或多种生物共同生活的关系，在生命的所有界中广泛存在。作为地球上最普遍的两类生物，线虫和细菌形成了多种多样的共生关系，这些关系从互利到致病不等^1-3。其中一种典型的共生关系是Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的互利共生，这一系统已成为研究共生的模式体系⁴。Steinernema线虫具有昆虫病原性，依赖其细菌共生体来杀死昆虫⁵。为了在不同昆虫宿主之间传播，这些细菌会定植于线虫感染性幼虫阶段的肠道中^6-8。最近的研究发现，其他几种线虫物种也被证实利用细菌来杀死昆虫^9-13，并已开始探讨这些系统中线虫与细菌之间的相互作用⁹。

我们介绍一种利用线虫在显微镜下具有光学透明性的特点，来可视化其体内或体表细菌共生体的方法。通过基因工程使细菌表达荧光蛋白，从而可通过荧光显微镜对其进行观察。目前已有多种质粒可供使用，这些质粒携带编码在不同波长下发出荧光的蛋白质（例如绿色或红色）的基因，且将质粒从供体质粒Escherichia coli菌株接合转入受体细菌共生体在多种细菌中均能成功实现。本文所述方法最初用于研究Steinernema carpocapsae与Xenorhabdus nematophila¹⁴之间的共生关系。类似方法也已被用于研究其他线虫-细菌间的互作关系^9,15-18，因此该策略具有广泛的适用性。

该方法可用于表征线虫在不同发育阶段体内细菌的存在及其定位，从而揭示共生关系的性质及定植过程^14,16,19。显微分析可同时提供群体内定植频率以及细菌在宿主组织中的定位信息^14,16,19-21。相较于其他监测线虫群体内细菌的方法（如超声处理²²或研磨²³），该方法具有优势，因为后者仅能提供平均定植水平，却可能无法区分高频率低共生菌载量的群体与低频率高共生菌载量的群体。在筛选或鉴定具有定植表型的细菌突变体时，区分定植细菌的频率与载量尤为重要^21,24。事实上，荧光显微镜已被用于对细菌突变体进行高通量筛选，以发现其定植缺陷^17,18，且相比超声处理^22,25-27和单个线虫解剖^28,29等其他方法更为省力。

方案

1. 通过接合构建荧光标记细菌菌株

1. 将受体菌株（待检测的共生菌）和供体菌株在适宜条件下过夜培养。供体菌株通常为Escherichia coli，应具备通过接合转移传递DNA的能力，并已转化携带编码荧光蛋白基因的质粒（表2）。根据所用质粒的不同，可能还需使用接合辅助菌株。若需要，该辅助菌株也应进行过夜培养。供体菌株和辅助菌株应使用抗生素进行培养，以确保质粒的稳定维持。
2. 以1:100的接种比例，将供体、辅助及受体菌株转接到不含抗生素的营养丰富的培养基中进行二次培养。
3. 将各菌株在各自适宜的温度下培养至对数生长中期（OD₆₀₀约0.6）。对于Xenorhabdus和E. coli，此阶段通常在二次接种后约3至4小时达到。具体时间可能因菌株或所用质粒不同而有所差异。
4. 将菌液在微量离心管中混合，于17,900 × g（大多数微量离心机中为13,000 rpm）离心2分钟。供体与受体菌株的最佳比例因组合不同而异，需通过实验确定。对于以Xenorhabdus为受体、E. coli为供体的情况，我们采用3:1或1:1的比例。若需要辅助菌株（例如E. coli），应以与供体菌株相同的比例加入。
5. 弃去上清液。
6. 用30 μl新鲜培养基重悬菌体沉淀。
7. 将悬液点样于无抗生素的营养丰富的平板上，待液滴自然干燥。
8. 将平板倒置，在对受体细菌最适且供体（如有辅助菌株，则也包括辅助菌株）可耐受的温度下过夜培养。培养时间应至少为18小时。
9. 刮下菌斑，在含选择性抗生素的平板上划线以分离单菌落。所用抗生素应能抑制供体菌生长，同时允许携带质粒的受体菌生长。可能需要再进行一至两次划线分离，以获得纯培养物。
10. 通过检测受体菌特有的表型特征（如菌落形态）或通过聚合酶链式反应（PCR）检测受体特异性基因，确认所得菌落确为受体共生菌而非供体菌株。同时通过PCR扩增已知质粒序列以及检测荧光信号，验证菌落是否含有质粒。在对应荧光蛋白的激发波长下，阳性菌落应显示荧光。

2. 无菌线虫卵的制备

1. 将天然共生细菌接种于5 ml培养液中，过夜培养。起始培养时，可直接从冻存菌种或划线平板中将细菌接种至Lysogeny Broth（LB）或其他培养基中。
2. 取600 μl细菌培养物均匀涂布于10 mm Lipid Agar（LA）平板上²⁹。对于大多数线虫种类，8至10个平板可提供足够的线虫数量。
3. 在25 °C黑暗条件下无湿培养两天。
4. 向细菌菌苔中加入5,000条感染期幼虫（IJs）或其他所需发育阶段的线虫，溶于500 μl培养液中。将平板置于25 °C培养3天。
5. 检查平板中是否存在成虫线虫和卵。取20 μl水滴加至显微镜载玻片上。使用无菌接种针从细菌菌苔上刮取少量线虫，将接种针放入水中，使线虫游离出来。在低倍镜下观察样本。有关形态特征的更多信息，请参见讨论部分及图2。
6. 若可见卵和雌虫，则继续操作；否则将平板在25 °C继续培养，并每隔6–12小时检查发育情况。当雌虫体内含有卵时，在平板表面加入数毫升水，轻轻旋转平板后将液体倒入50 ml锥形管中。线虫应从平板表面脱离，平板表面不再可见线虫。可能需要多次冲洗。
7. 让线虫在锥形管底部自然沉降。
8. 清洗线虫。用移液器吸除管顶多余液体，重新加入洁净水，待成虫线虫沉降后，再次吸除上清液。
9. 向锥形管中加满卵裂解液。一旦加入卵裂解液，后续所有步骤的时间必须严格按照描述进行，以获得最大卵产量。将锥形管置于轻微振荡条件下，准确孵育10分钟。大多数线虫应在孵育结束时被完全溶解。
10. 立即以1250 × g离心10分钟（包含加速至设定转速的时间，但不包含减速至0 × g的时间），使用离心机刹车功能。
11. 立即倾去上清液。
12. 立即用移液器将沉淀物重悬于卵裂解液中。
13. 立即用卵裂解液充满锥形管，颠倒混匀3–5次，随后立即按步骤2.10进行离心。
14. 立即倾去上清液。
15. 用移液器将沉淀物重悬于LB培养基中，并转移至15 ml锥形管中，以便在洗涤步骤中更有效地形成沉淀。LB为Steinernema spp.的标准培养基。根据所用线虫和细菌种类，也可选用其他缓冲液（例如最低盐培养基），但需确保缓冲液对线虫和共生细菌均无毒性。
16. 用LB充满锥形管，并按步骤2.10进行离心。
17. 吸除上清液后，用LB重悬沉淀物。
18. 重复步骤2.14和2.15，共清洗线虫3次。
19. 将重悬的线虫卵调整至适当体积，浓度应至少达到每微升10个卵。可在6 cm培养皿中加入5 ml含抗生素的LB培养基（抑制定植细菌生长），并将培养皿用Parafilm封口，使卵在其中保存至少4天。在接种至细菌菌苔前，需将卵在15 ml LB中清洗一次（如步骤2.13和2.14所述）。需注意，在此期间卵会逐渐孵化，用于定植实验时其发育阶段可能不同步。

3. 与荧光标记细菌的共培养实验

1. 如有必要，选择含质粒的荧光细菌过夜培养。
2. 用无菌涂布棒将 600 μl 细菌培养物均匀涂布于 10 mm 脂质琼脂平板上，在 25 °C 下孵育 2 天。
3. 将 500–5,000 个无菌线虫卵以总共 100 至 400 μl 的体积（最佳条件为 200 μl 中含 2,000 条线虫）接种至每个脂质琼脂平板上。
4. 在 25 °C 黑暗条件下孵育，不加湿，直至感染性幼虫（IJs）或其他目标发育阶段形成。IJs 会在平板边缘呈现为模糊的白色环状结构。如需观察其他生活史阶段，请参见方案 4。
5. 将平板置于改良的 White 捕虫装置³⁰中。移去脂质琼脂平板的盖子，将底部置于一个空的 100 mm × 20 mm 培养皿底部内。向大培养皿中加入水或适用于您所用线虫的其他缓冲液，使小平板被液体包围，液面高度约为小平板高度的一半。
6. 继续孵育水捕装置，直至子代感染性幼虫完全进入缓冲液中。
7. 感染性幼虫线虫可保存于组织培养瓶的水中。

4. 筛选用早期生活阶段样本的采集

1. 使用步骤 3.1 至 3.4 设置实验。
2. 孵育培养板，直至出现所需的生活阶段。可能需要每日进行肉眼观察以确定时间。检查培养板时，采用方案 2.5 中描述的程序。对于在 LA 培养板上与 S. carpocapsae 共同培养的 X. nematophila 虫卵， gravid 雌虫将在 4–5 天内出现，幼虫将在 7 天内出现，而感染性幼虫将在 15–17 天开始产生。
3. 当所需的生活阶段出现后，收集样品。在 96 孔板的一个孔中加入 200 μl PBS 或其他适当的缓冲液。轻轻刮取含有线虫的细菌菌苔。约豌豆大小（~50 mg）的量在 F1 代子代产生后即可提供数百条以上的线虫，但若需更早时间点取样，可能需要更多材料。将刮取物放入含有缓冲液的孔中。
4. 孵育 30 秒至 1 分钟。取出接种棒并刮下残留物。用接种棒去除孔中的琼脂。线虫应在缓冲液中可见。将缓冲液混合物转移至干净的微量离心管中。
5. 使用左旋咪唑或其他麻痹剂处理线虫。将少量左旋咪唑晶体溶解于 30 μl 水中。每 50 μl 样品加入 1–2 μl 该溶液。经左旋咪唑处理后，线虫将失去活性。
6. 若样品需在后续时间观察，请按本步骤进行固定；否则跳至步骤 4.6。加入含 1X 缓冲液和 4% 多聚甲醛的固定液 200 μl。轻柔混匀，使用移液器吹打可能导致脆弱的生活阶段破裂。用铝箔包裹，在低速摇床上室温孵育至少 18 小时。
7. 将离心管置于试管架中，使线虫沉降到管底。
8. 清洗线虫以去除背景干扰。用移液器吸去上清液，加入 200–500 μl 缓冲液并轻柔混匀。重复该步骤。如需进一步降低背景，可重复数次。
9. 让线虫沉降到管底，然后重悬于所需体积的缓冲液中。
10. 若线虫未固定，应立即进行观察。固定的线虫可在冰箱中避光保存最多两周。

5. 通过显微镜筛选线虫与细菌的关联

1. 通过取少量混合液样本，在显微镜下观察部分线虫。
2. 为确保拍摄时线虫保持静止，需使用麻痹剂处理，具体操作见方案4.5。若不进行拍照或线虫已固定，则可跳过此步骤。
3. 取20–30 μl含线虫的水样滴加至显微镜载玻片上，盖上盖玻片。
4. 使用明场显微镜观察完整线虫，确保线虫位于视野范围内。
5. 使用显微镜的荧光模式观察线虫，所选荧光通道应与细菌表达的荧光相匹配。
6. 为确定细菌的定位，需在同一视野下分别拍摄荧光模式和明场模式的图像，然后将两幅图像叠加。可能需要尝试多种放大倍数和不同视野，以找到细菌的位置。
7. 可通过统计一群线虫中定植细菌的个体数量来量化线虫定植的分布情况，记录每条线虫是否存在细菌定植，并计算定植率百分比。建议每组（有或无定植）至少统计30条线虫，以获得可靠的数据。
8. 当群体中仅有少数线虫被定植时，可能需要统计数千条线虫才能观察到30条定植个体。对于高通量计数，请采用以下步骤。
9. 无需逐条计数，可将线虫群体分装至多孔板（e.g. 24孔板）中。待线虫沉降至孔底后，可在显微镜下逐孔扫描，并记录每孔中定植细菌的线虫数量。
10. 可通过孔内线虫的系列稀释法确定群体中的总线虫数。例如，向一孔中加入1 ml线虫悬液，用移液器枪头充分混匀，取出3 μl进行计数，以此推算该孔内线虫的总数。
11. 通过将定植线虫数除以孔内线虫总数，即可计算出定植线虫的百分比。

6. 典型结果

示例显微镜图像 斯氏线虫属 与线虫相关的 Xenorhabdus 细菌显示在 图3. 以生成所见的复合图像 图3A，相衬图像与荧光图像进行了叠加。箭头指示 图3A 表示感染性幼虫线虫体内的细菌（比例尺 = 100 μm). 图3B 以类似方式构建，显示一条幼年线虫，其肠道腔内分布有绿色荧光蛋白标记的细菌（绿色杆状物）（标尺 = 20 μm）。统计并记录来自两种培养基的线虫群体中被细菌共生体定殖的数量。表1）。为了获得可靠的统计结果，最好每样本计数至少100条线虫，且每个类别中至少包含30条。如图所示 表1这些线虫在脂质琼脂上培养时定植率约为14.6%，在肝肾琼脂上培养时定植率则为68.6%。其他线虫和细菌物种的定植水平也有所不同。例如 X. nematophila 定植于99%的 S. carpocapsae 感染性幼虫（Martens 2003），以及 P. luminescens 定植率为26% H. bacteriophora 感染性幼虫（Ciche 2003）。

图 1. 方法的示意图。A. 对细菌进行基因工程改造以表达荧光蛋白。B. 从成年线虫中分离线虫卵，以获得无菌线虫。C. 将无菌线虫与荧光细菌共培养。D. 在显微镜下观察所产生的各个发育阶段，以评估细菌在线虫体内的存在情况。

图 2. 含卵成年雌虫的图示。A. 示意图显示了Steinernema雌虫的一般形态。插图：S. feltiae怀卵雌虫的微分干涉差显微（DIC）图像。黑色箭头指示阴门位置，白色箭头显示可见的卵。图像放大倍数为20倍，比例尺为100 μm。B. 发育完全但未孵化的S. feltiae线虫卵的DIC图像。图像放大倍数为40倍，比例尺为50 μm。C. 从S. feltiae线虫中分离出的卵在10倍放大下的DIC图像。比例尺为100 μm。

图 3.线虫-细菌共生关系的显微镜图像示例。A.S. puntauvense 线虫与其表达绿色荧光蛋白（GFP）的共生细菌X. bovienii 相关联。该图像通过将同一视野下的相差图像与荧光图像叠加而成。箭头指示线虫宿主体内的荧光共生细菌。比例尺为 100 μm。B. 本图像显示一株幼年期的S. carpocapsae 线虫，其肠道内定植有表达GFP的X. nematophila 细菌。该图像是通过将荧光图像叠加在微分干涉相差（DIC）图像上构建而成。比例尺为 20 μm。

菌株	携带细菌的线虫数量	计数的总线虫数	定植线虫百分比
S. puntauvense 脂质琼脂	30	205	14.60%
S. puntauvense 肝肾琼脂	72	105	68.60%

表1. 线虫群体中细菌定植情况的示例评分。 在本实验中，将无菌的 S. puntauvense 线虫与其表达GFP的共生菌分别在不同培养基（脂质琼脂和肝肾琼脂 ³²）上共同培养，以检测定植缺陷。每份样本至少统计并评分一百条线虫的细菌定植情况。为保证统计效力，应进行三次实验重复，且每个类别中至少包含30条线虫。

表 2. 含荧光蛋白的质粒。 以下按质粒名称列出可用于将荧光蛋白插入细菌共生体的潜在质粒。其他信息包括所编码的荧光蛋白、用于质粒维持的抗生素抗性盒、使用说明以及质粒来源。括号中注明的浓度为用于 X. nematophila 的抗生素浓度。这些质粒均已成功应用于 Xenorhabdus 或 Photorhabdus 中。更多详细信息可从所列参考文献中获取。根据待测细菌的不同，某些质粒可能因荧光蛋白类型、抗生素筛选方式、插入位点或复制起点的不同而无法发挥作用。上述所列质粒具有不同的特性，可能使其适用于目标细菌。例如，mini-Tn7-KSGFP 通过插入染色体上的 attTn7 位点实现整合，而 pECM20 则通过同源重组插入 X. nematophila 染色体。相比之下，pPROBE 系列质粒可在染色体外稳定维持，每种 pPROBE 质粒具有相同的骨架和荧光蛋白，但带有不同的筛选标记或复制起点，从而可在多种分类学背景或突变株中使用。

讨论

本文所述方案提供了一种在线虫宿主内对细菌进行光学检测的方法图1）。该方法利用了线虫的光学透明性以及对细菌进行荧光标记的能力，从而实现 体内 线虫宿主内细菌的分析图3）。具体而言，该方法可确定细菌在其宿主内的定位。通过统计线虫群体数量并检测细菌的存在情况，可确定细菌在线虫群体中的定植频率（表1）。该方法是可用于研究线虫宿主与细菌共生体之间相互作用的多种潜在技术之一。此前已有相关方法被报道，用于分离细菌共生体、无菌培养线虫，以及对双方共生伙伴进行操作。 ^25-27.

本方案最初是在 Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae 模型系统中开发的¹⁴，类似的方法也已应用于其他昆虫病原性线虫-细菌共生体系^9,15,17,18。若要将该方法推广至其他线虫-细菌系统，需满足若干条件。首先，细菌共生体必须能够从宿主中分离，并可在体外独立培养。其次...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂质琼脂 （无菌）			8克营养肉汤，15克琼脂，5克酵母提取物，890毫升水，10毫升0.2克/毫升氯化镁26H20、96 ml 玉米糖浆溶液*、4 ml 玉米油* 倒平板时搅拌培养基 *高压灭菌后加入无菌成分
玉米糖浆溶液 （无菌）			7 ml 玉米糖浆，89 ml 水 混合并高压灭菌
卵液			16.6 ml 12% 次氯酸钠，5 ml 5M KOH，80 ml 水
溶菌肉汤 （无菌）			5克酵母提取物，10克胰蛋白胨，5克盐，1升水 混合并高压灭菌
微型离心机	Fisher	13-100-675	任何能够容纳微量离心管的微型离心机均可使用
离心	Beckman	366802	可容纳15 ml和50 ml离心管的大型台式离心机
无菌 60 mm X 15 mm 培养皿	Fisher	0875713
50 ml 离心管	Fisher	05-539-6
15 ml 离心管	Fisher	05-531-6
无菌 100 mm × 20 mm 培养皿	Fisher	0875711Z	比标准培养皿更深
24孔板	Greiner Bio-One	662000-06
显微镜			显微镜需要具备与所用荧光染料相匹配的荧光功能
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15710
PBS （无菌）			8 g NaCl 0.2 g 氯化钾 1.44 g Na2高倍光学显微镜4 0.24 g KH2PO4 1 L 水 调节pH至7.4，加水至1 L，高压灭菌
微量离心管	Fisher	05-408-138	2 ml 或 1.5 ml 离心管
Shaker			任何能使液体轻柔晃动的摇床均可使用
二氨基庚二酸	Sigma	D-1377	如有需要，将培养基补充至浓度为 1 mM