使用荧光显微镜可视化中的细菌线虫

Summary

要研究之间的互利共生嗜斯氏线虫

Abstract

共生，生活在一起的两个或多个物种，广泛分布于所有的王国的生活。作为地球上的最普遍的生物，线虫和细菌形成共生广泛的范围从有利于致病^1-3。一个这样的协会是互惠互利的关系致病杆菌的细菌和斯氏线虫，这已经成为了一个模型系统的共生^4。 斯氏线虫，昆虫，细菌共生体，杀死昆虫^5。昆虫宿主之间传输时，细菌定植于肠道线虫的感染青少年阶段^6-8。最近，几个其他线虫种已被示出利用细菌杀死昆虫^9-13，并调查已经开始研究在这些系统中的线虫和细菌之间的相互作用<SUP> 9。

我们描述了一种内共生菌或一种线虫主机上进行可视化的方法，利用通过显微镜观察时，光学透明度的线虫。这种细菌被设计来表达荧光蛋白，让他们通过荧光显微镜的可视化。许多质粒是可携带荧光在不同的波长（ 例如，绿色或红色），和共轭从一种供体到受体细菌共生体的大肠杆菌菌株的质粒编码的蛋白质的基因是成功的范围广泛的细菌。描述的方法进行调查之间的关联斯氏carpocapsae和嗜线虫致病杆菌 ^14。类似的方法已被用来调查其他线虫细菌协会^9，15-18，因此，该方法是普遍适用的。

的METHOD允许的细菌内线虫的存在和定位的特性，在不同的发展阶段，深入了解协会的性质和过程的殖民统治^{14，16，19。}微观分析揭示了两个殖民频率范围内的人口和本地化的细菌宿主组织^{，14，16，19-21。}监测细菌内线虫的人群，如超声²²或研磨^23，可提供平均水平的殖民与其他方法相比，这是一个优势，但没有可能，例如，歧视的人群高频率的低共生体负载从人口低频率高的共生体负荷。判别的频率和负载的定殖菌筛选时，可能是特别重要或描述细菌殖民表型的突变体^21，24。事实上，荧光显微镜被用于高通量筛选的细菌定植^17，18中的缺陷的突变体，并且是不太费力的比其他的方法，包括超声处理^{22 25日至27日，}和个别线虫夹层^28，29。

Protocol

1。建设一个荧光的细菌菌株，通过共轭

1. 成长的受体菌（共生体进行审查）和供体菌过夜。供体菌株中，通常会大肠杆菌 ，应该是能够通过共轭捐赠DNA应转化的质粒（ 表2）的，携带编码荧光蛋白的基因。根据质粒上，共轭辅助菌株也可能是必需的。如果是这样的话，该菌株应还​​可以生长过夜。供体菌和辅助应变应种植与抗生素选择维护的质粒。
2. 继代培养的捐赠者，助手，受体菌营养丰富的生长介质，缺乏文化到介质中的比例为1:100的抗生素。
3. 每个菌株在温度适宜成长的文化，直到他们达到数中期阶段的增长（OD _{600〜0.6）。} 致病杆菌和大肠杆菌大肠杆菌这一阶段的成长次达到约3至4小时后，传代培养。这可能会有所不同，这取决于在该菌株中，或在某些情况下，该质粒，用。
4. 在离心管中，离心2分钟17,900 XG（13,000 RPM在最microfuges），混合菌株。供体和受体，产生最好的结果的比例会有所不同，不同的组合，并且可以具有可以凭经验确定。 ，对于嗜收件人和E.大肠杆菌供体，我们用一个3:1或1:1的比例。如果一个辅助菌（ 如大肠杆菌 ），它应该被添加到相同的比例作为供体。
5. 滗析出上清液。
6. 细胞沉淀重新悬浮在30μl的新鲜培养基。
7. 现货悬挂到营养丰富的传媒板块没有任何....

Discussion

这里所描述的协议提供了一种方法，一种线虫主机（ 图1）内的细菌的光学检测。此方法利用的光学透明度，线虫和荧光标记细菌的能力，使在体内分析的细菌内的线虫主机（ 图3）。具体而言，这种方法在其主机的标识细菌本地化的。横跨线虫种群的细菌定植的频率可以通过计数线虫种群和得分为细菌的存在，来确定（ 表1）。此方法是，可以用于研究线虫主机和共生细菌之间的相互作用的许多潜在的技术之一。相关的方法已经被以前，隔离细菌共生，增长线虫axenically，操纵双方的合作伙伴^{25日至27日} 。

描述的协议，Ĥ趁着开发中的嗜线虫致病杆菌，斯氏线虫carpocapsae模型系统^14，和类似的方法已被用于其他昆虫病原线虫细菌协会^{9,15,17,18。}以应用这种方法对其他线虫细菌系统必须满足几个条件。首先，细菌共生体必须能够从主机分离，并生长在培养独立。二，共生体必须能够通过采取DNA转化或结合，以引进荧光蛋白.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
脂质琼脂 （无菌）			营养肉汤8克，琼脂15克，5克酵母提取物，890毫升水，10毫升0.2克/毫升的MgCl 2。 6H 2 O，96毫升玉米糖浆溶液*，4毫升玉米油* 搅拌均匀介质，同时浇注板 *添加高压灭菌后的无菌成分
玉米糖浆溶液 （无菌）			7毫升玉米糖浆，89毫升水 混合和高压灭菌器
鸡蛋的解决方案			16.6毫升12％次氯酸钠，5毫升5M KOH，80毫升水
溶原性肉汤 （无菌）			酵母提取物5克，10克胰蛋白胨，5克盐，1升的水 混合和高压灭菌器
微型离心	费舍尔	13-100-675	将工作任何的离心持有的离心管
离心分离	贝克曼	366802	大台式离心机，持有15毫升和50毫升锥形管
无菌60毫米X 15毫米培养皿	费舍尔	0875713
50 mL离心管	费舍尔	05-539-6
15 mL离心管	费舍尔	05-531-6
无菌100毫米X 20毫米培养皿	费舍尔	0875711Z	深于标准的培养皿
24 - 孔板	格雷纳生物	662000-06
显微镜			荧光功能，兼容的荧光显微镜需要
多聚甲醛	电子显微镜科学	15710
PBS （无菌）			8克氯化钠 0.2克KCl 1.44克Na 2 HPO 4， 0.24克KH 2 PO 4 1升的水 调整到pH为7.4，水至1 L和高压釜中
微型离心管	费舍尔	05-408-138	2毫升或1.5毫升管
振动筛			任何振动筛，使液体轻轻移动工作
二氨基庚二酸	西格玛	D-1377	如果需要，补充介质的浓度或1mM