斑马鱼是一种强大的脊椎动物模型，在代谢研究中尚未得到充分利用。本文介绍了一种快速测量 体内 斑马鱼发育过程中的代谢谱，可实现对经基因或药物干预的胚胎之间不同线粒体功能参数的比较，从而提升该模式生物的适用性。
本文内容
摘要
摘要
代谢领域日益重要的一个目标是确定遗传因素对线粒体功能不同方面的影响。理解这些关系将有助于阐明与线粒体功能障碍相关的一系列疾病（如糖尿病和肥胖）的潜在病因。近年来，随着仪器技术的进步，已能够对细胞系或组织外植体中的线粒体功能各项参数进行监测。本文介绍一种快速且灵敏的线粒体功能参数分析方法 体内 使用Seahorse生物科学XF 24细胞外通量分析仪检测斑马鱼胚胎发育过程中的呼吸参数。本实验方案采用胰岛捕获微孔板，将单个胚胎置于每个孔中，从而可测定以下生物能量学指标：（i）基础呼吸；（ii）基础线粒体呼吸；（iii）由ATP周转引起的线粒体呼吸；（iv）线粒体解偶联呼吸或质子漏；（v）最大呼吸。通过该方法，可比较野生型与基因修饰胚胎（突变体、基因过表达或基因敲低）之间，或经药物处理的胚胎之间的斑马鱼胚胎呼吸参数。预计本方案的推广将为研究人员提供分析代谢障碍遗传基础的新工具。 体内 在此相关的脊椎动物模型中。
方案
第1部分：斑马鱼胚胎的化学处理
- 受精后收集斑马鱼胚胎。在100×15 mm培养皿中，于28.5 °C条件下使用E3培养基进行培养。 注意： 对于 原位 杂交或油红O染色时，加入终浓度为0.2 mM的1-苯基-2-硫脲（PTU）以抑制色素形成，1 但对于Seahorse分析并非必需。
- 在药理学研究中，于受精后约26小时（hpf）将所需化学物质以适当的终浓度加入正在发育的斑马鱼胚胎中，并设置仅含相应溶剂的对照组。 注意： 对于光敏感的药理学抑制剂，胚胎可在分析前于避光条件下发育。
第二部分：使用 Seahorse XF 24 分析仪进行活细胞代谢谱分析
- 每次运行前，Seahorse XF 24 分析仪会通过其自动程序对含有 O2 和 H+ 荧光探针的 Seahorse XF 24 分析仪探头进行校准。
- 24 孔 XF 24 胰岛板的制备。采用以下实验步骤：
- 由于氧气消耗对温度波动敏感，需使用四个孔用于监测整个板上的可能温度波动。这些孔不放置胚胎，而是加入 700 μl 的 E3 培养基（图 2A）。
- 其余 20 个孔（见第 2.2 部分）各加入 700 μl E3 培养基和一个胚胎（图 2B）。
- 在每次实验中，10 个胚胎用溶剂处理（对照组），10 个胚胎用化学抑制剂处理（处理组）。对照组和处理组胚胎交替放置（例如 A2 孔：对照胚胎；A3 孔：处理胚胎；A4 孔：对照胚胎；A5 孔：处理胚胎，依此类推）。
- 在每个孔的上方添加胰岛捕获筛，以确保样品在整个检测过程中保持在测量室内（图 2B）。注意：化学处理的胚胎在整个操作过程中始终保留在原始化学溶液中，无需在运行 Seahorse 分析仪程序前洗去化学物质。
- 完成后，将板放入 Seahorse 分析仪中并启动检测。
- 样品分析。通常进行两种不同的检测：
- 基础呼吸/最大呼吸程序（持续时间约 90 分钟）。基础呼吸的改变反映了代谢功能障碍，而最大呼吸则衡量了总能量生成能力，该参数的改变与多种病理和生理状态相关。备用呼吸能力，即系统进一步增加 ATP 生成的能力，可通过从最大呼吸中减去基础呼吸来计算得出。首先进行三次每种混合（2 分钟）/等待（1 分钟）/测量（2 分钟）循环，以确定基础呼吸。在第三次循环结束时，向每个孔中加入终浓度为 2.5 μM 的 FCCP（线粒体质子载体/解偶联剂），以测量最大呼吸。随后重复测量循环 5 至 8 次（图 3）。
- ATP 转换/质子泄漏程序（持续时间约 60 分钟）。由 ATP 转换引起的呼吸代表了线粒体的主要功能，即 ATP 的生成；而由质子泄漏（或称解偶联呼吸）引起的呼吸则与其他线粒体功能参数密切相关，包括基础呼吸和活性氧的生成。ATP 转换相关的呼吸通过加入 25 μM 寡霉素（ATP 合酶抑制剂）后呼吸的变化与基础呼吸之间的差值来表示。解偶联呼吸，即由质子泄漏引起的呼吸，通过计算寡霉素介导的呼吸与加入 25 μM 鱼藤酮（复合物 I 抑制剂）后呼吸之间的差值来确定。每次加入线粒体抑制剂后，重复测量循环 8 次。
实验结束后，计算10个对照组和10个化学处理组胚胎的平均值。
第3部分：油红O染色
- 使用精细镊子去除50 hpf胚胎的卵膜，并在4 °C条件下用4% PFA固定过夜。
- 按照先前所述方法进行油红O染色2（见图4）。
结果
我们旨在研究特定基因在代谢中的作用，尤其是对呼吸速率和脂质代谢的影响。因此，我们从26 hpf开始，使用针对其中一个基因所编码酶的特异性药理学抑制剂处理野生型斑马鱼胚胎。在50 hpf时，将一半的对照溶剂处理组和抑制剂处理组胚胎用于Seahorse检测线粒体功能，其余一半胚胎则在4 °C下用4%多聚甲醛固定过夜，随后用油红O染色以检测脂质沉积。特异性酶抑制剂处理导致基础呼吸速率增加约2倍（图4A），同时伴随脂质沉积增加，尤其在端脑区域及耳泡下方区域更为明显（图4B,C）。
图1. 斑马鱼胚胎化学处理的示意图。 野生型、基因操作或药理学处理的斑马鱼胚胎作为实验背景。
图2. XF24胰岛板的设置。 （A）四个孔中仅含有胚胎培养基作为温度对照（用X标记），其余孔中每孔含一个胚胎。（B）单个孔（C6）的放大图像，显示一个50小时受精龄的野生型胚胎，经溶剂（DMSO）处理，并覆盖有胰岛捕获筛（箭头所示）。
图 3. 野生型 50 小时受精后斑马鱼胚胎的呼吸参数。 (A) 每项测量结果均显示 20 个独立胚胎的平均值。基础呼吸（均值：299.7；标准差：75.7；标准误：16.9）、最大呼吸（均值：387.4；标准差：93.3；标准误：20.9）、备用呼吸能力（均值：87.7；标准差：72.0；标准误：16.1）。(B) 每项测量结果均显示 20 个独立结果的平均值。基础线粒体呼吸；由 ATP 转换引起的线粒体呼吸；解偶联的线粒体呼吸以及非线粒体呼吸。Mt：线粒体；SRC：备用呼吸能力；SD：标准差；SEM：均值标准误。结果以每个胚胎每分钟消耗的 O2 皮摩尔（pmol）表示。点击此处查看高清大图。
图4. 化学暴露对基础呼吸和脂质沉积影响的代表性结果。 （A，B）50 hpf 胚胎侧视图经油红O染色。与溶剂处理对照胚胎相比，经选择性抑制剂孵育的胚胎（B）在端脑（箭头）和耳囊下方（箭）显示出更多的油红O染色。（C）化学处理胚胎的基础呼吸显示约增加2倍（每组n=10个胚胎）。结果以pmol O2/min/胚胎表示。
讨论
斑马鱼是一个成熟的遗传学模型，可用于正向遗传学（ENU诱变）和反向遗传学（Tilling、锌指核酸酶靶向敲除、吗啉代寡核苷酸敲降）研究。3,4，而斑马鱼胚胎中的基因功能也可以通过针对其编码产物的特异性药理化合物进行有效抑制或激活。由于斑马鱼胚胎为体外发育且体型较小，特别适用于代谢分析。然而，对其代谢谱和线粒体功能进行可靠检测 体内 在斑马鱼胚胎中尚未实现，仅有一项初步描述被报道5Seahorse 分析最初是为基于细胞的代谢研究而设计的，已被证明能够提供准确且可靠的结果6将这一新方法应用于斑马鱼胚胎具有重要意义，有望进一步拓展该模型在代谢研究中的广泛应用。
本研究中，我们利用Seahorse分析仪测量斑马鱼胚胎的一系列呼吸参数，包括基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、ATP转换和质子泄漏。我们还举例说明了如何将此类测量结果与其他生理参数（本例中为脂质积累）进行关联分析，以及在此检测系统中使用药理学抑制剂的方法。结合基因改造胚胎的应用，该方法为研究影响代谢的因素提供了一个强大的实验平台。
这种新方法具有多种应用，因为线粒体功能障碍与许多人类疾病相关，例如糖尿病7、肥胖8、多发性硬化症9、帕金森病10、阿尔茨海默病11以及某些类型的癌症12。重要的是，我们的研究是在体内进行的，其中所有环境影响因素——如细胞因子、发育相关的生长因子等——均处于活跃状态，从而提供了生理条件下体内呼吸和代谢特征的可靠视图。由于化学筛选也常规地在野生型和突变型斑马鱼胚胎中进行（图1），因此可以利用Seahorse分析仪轻松鉴定出影响呼吸、线粒体功能或代谢的新型药物。使用Seahorse分析仪获得的结果可与其他检测方法结合使用，以提供更全面的信息，包括生理学分析（如油红O染色）或分子生物学分析（如针对特定脂肪细胞标志物cebpα、Pparα、Pparγ、FAS等的原位杂交）。
该方法仍存在一些局限性。尽管我们及其他研究者已成功使用寡霉素在早期胚胎中测量ATP生成和质子泄漏5（见图3），但在发育超过60 hpf的胚胎中，寡霉素处理效果不佳。我们认为，在较晚期的胚胎中，寡霉素的扩散能力不如在早期胚胎中，导致结果无法准确解读。由于必须依赖寡霉素处理结果来确定由ATP周转和非耦联呼吸所引起的呼吸作用，我们目前正在探索对较晚期胚胎使用更高浓度的寡霉素。然而，抗霉素A的处理在更长时间内仍然有效，因此在较晚期的斑马鱼胚胎（最长至68 hpf，未展示）中仍可进行其他参数的测量，例如基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力。
当前使用Seahorse分析仪设置的另一个局限性在于每个胰岛捕获板孔内的物理空间，这使得该系统仅适用于斑马鱼胚胎和幼龄幼鱼。因此，例如在成年鱼中开展饮食诱导肥胖的代谢研究，目前在技术上尚不可行。然而，本研究可能推动专为幼年或成年鱼类设计的检测板的开发，从而拓展可进行的分析范围。
致谢
作者谨向迪肯大学斑马鱼实验中心的工作人员致以诚挚感谢，感谢他们提供的优质且持续的饲养管理。YG 获得了阿尔弗雷德·迪肯博士后研究奖学金以及迪肯大学中央研究基金的资助。SLM 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）职业发展奖学金的资助。ACW 获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）支持性基金的资助。所有作者均得到了迪肯大学分子与医学研究战略研究中心的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| XF 24 细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 孔板格式 |
| 胰岛捕获微孔板 | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 孔板格式 |
| XF 校准溶液 | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF 检测培养基 | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| 油红O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-苯基-2-硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3（胚胎培养基） | 自制 | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100×15 mm 培养皿 | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| 寡霉素 | Sigma | 75351 | |
| 抗霉素A | Sigma | A8674 |
参考文献
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重印与许可
