同时记录成年小鼠腰段运动神经元的细胞内电活动及其运动单元产生的力 体内

摘要

该新方法可同时记录单个成年小鼠运动神经元的细胞内电活动，并测量其肌纤维产生的力量。在正常和基因修饰动物中联合研究运动单位的电学与机械特性，是神经肌肉系统研究领域的一项突破。

摘要

脊髓运动神经元长期以来一直是研究神经功能的理想模型系统，因为它是中枢神经系统中一种具有独特性质的神经元：（1）具有易于识别的靶标（肌纤维），因此其功能非常明确（控制肌肉收缩）；（2）是许多脊髓内及下行神经网络的汇聚目标，因此被称为“最终共同通路”；（3）具有较大的胞体，便于用尖锐的细胞内电极进行穿刺记录。此外，当对其进行研究时 体内可以同时记录运动神经元的电活动及其靶肌肉产生的力。对运动神经元进行细胞内记录 在体 因此使实验者能够同时研究“运动单位”（指运动神经元、其轴突以及该神经元所支配的肌纤维）的所有组成部分¹：作用于运动神经元的输入、运动神经元的电生理特性，以及这些特性对运动神经元生理功能的影响， 即 其运动单元产生的力。然而，这种方法极具挑战性，因为实验准备过程中无法使动物瘫痪，从而降低了细胞内记录所需的机械稳定性。因此，这类实验迄今仅在猫和大鼠中成功实现。然而，如果能在正常小鼠及基因修饰小鼠中开展类似的实验，脊髓运动系统的研究将取得巨大的飞跃。

由于技术原因，对小鼠脊髓网络的研究主要局限于新生期 体外 制备过程中，运动神经元和脊髓网络尚未成熟，运动神经元与其靶细胞分离，且在脑片研究中，运动神经元也与其大部分输入神经分离。直到最近，仅有少数研究团队成功实现了对运动神经元的细胞内记录 在体^2-4 ，包括我们团队发表了一种新的制备方法，使我们能够获得运动神经元非常稳定的记录 体内 在成年小鼠中^5,6然而，这些记录是在瘫痪的动物中获得的， 即 无法记录这些运动神经元的力输出。本文介绍了一种对原始制备方法的扩展，使我们能够同时记录运动神经元的电生理特性及其所支配运动单元产生的力。这一进展具有重要意义，因为它使我们能够基于力的特征来识别不同类型的运动神经元，从而揭示其功能。结合干扰脊髓节段神经环路的遗传模型^7-9或模拟人类疾病^10,11我们期望该技术将成为研究脊髓运动系统的重要工具。

方案

1. 第一步

麻醉前用药：在麻醉诱导前10-15分钟，皮下注射阿托品（0.20 mg/kg）以预防唾液分泌，同时皮下注射甲基泼尼松龙（0.05 mg）以预防水肿。

2. 第二步

麻醉诱导：腹腔注射戊巴比妥钠（70 mg/kg）或氯胺酮/赛拉嗪混合液（分别为100 mg/kg和10 mg/kg）。待小鼠深麻醉至无足趾夹捏反射为止。若麻醉深度不足，可追加1/4剂量。

3. 第三步

*注意：此手术为终末性操作。

当达到外科麻醉平面时，将小鼠转移至俯卧位的抬高保温毯上。

1. 用面罩覆盖小鼠的口鼻，以约 100 ml/min 的流速输送纯 O₂。
2. 使用毛发剪刀，剃除从颈背至尾基部的背部区域毛发。
3. 同时剃除右侧后肢的毛发。
4. 将小鼠翻转至仰卧位，但需注意保持氧气面罩处于原位。

4. 第四步

用缝线环绕小鼠的四肢，并在工作台面的四个角固定，以将小鼠稳妥固定。

5. 第五步

插入温度探针以监测小鼠的核心体温。调节加热垫或加热灯的功率，使核心体温维持在 36 °C 至 38 °C 之间。

6. 气管切开术与人工通气

1. 使用钝头剪刀在气管上方剪开切口，并将两侧皮肤拉开。
2. 用钝头镊子撕开唾液腺，以暴露覆盖气管的两条薄肌（Sternohyoid）。
3. 用钝头镊子沿两块肌肉的内侧分界将其分开，以暴露气管。
4. 使用Dumont 7号镊子，将两段4.0丝线缝合线从气管下方穿过。
5. 在两个软骨环之间对气管进行横向切割，但注意不要完全切断气管。
6. 将气管插管沿气管插入，然后在插入口两侧打结固定缝线以固定插管。气管插管连接至小鼠呼吸机（SAR-830/AP，CWE Inc.）和微型二氧化碳监测仪（μcapstar，CWE Inc.）。呼吸机通过顺应性气囊连接至纯氧气源。₂调整呼吸机参数（呼吸频率 100–150 次/分钟，呼气末潮气量 170–310 μl），使小鼠不与人工通气对抗，并维持呼气末 pCO₂₂ 在4%到5%之间保持稳定。

7. 静脉通路的放置

1. 使用钝性分离技术，暴露颈部一侧的颈静脉。在此位置，颈静脉分为两个主要分支，即面前静脉和面后静脉。
2. 对每一分支分别执行以下步骤：
   1. 使用Dumont 4或5号镊子，小心地将静脉与其周围的结缔组织分离。
   2. 使用Dumont 7号镊子，将两段6.0丝线从静脉下方穿过，并尽量沿静脉长度方向分开。
   3. 在静脉的近端（靠近心脏的一侧）放置一个小血管夹，并结扎远端。
   4. 使用极细的眼科剪，在静脉上做一个小的横向切口，注意切勿完全切断静脉。
   5. 将一根预充液的1Fr导管（premicath, Vygon）从切口插入，直至抵住血管夹处。
   6. 用Dumont 4号镊子夹住静脉和导管，小心移除血管夹，然后将导管再向静脉内推进数毫米。
   7. 通过结扎插入部位两侧的丝线，固定导管。
3. 其中一根导管连接注射器或注射泵，根据需要（通常每10–30分钟）追加麻醉药物，静脉给药剂量为戊巴比妥钠6 mg/kg，或氯胺酮/赛拉嗪1250+40 μg/kg/min¹²。另一根导管连接注射泵，用于缓慢静脉输注（50 μl/hr）含NaHCO₃（1%）和Plasmion（14%）的4%葡萄糖溶液。

8. 用针线缝合颈部皮肤，并将小鼠恢复至俯卧位

9. 后肢肌肉与神经的解剖

1. 使用剪刀从大腿顶部向跟腱处做一切口。将皮肤与下方肌肉分离，注意不要损伤血管。必要时进行电灼止血。
2. 辨认股二头肌的前缘，其表现为沿大腿纵向走行的一条白色线条。使用剪刀沿此线从膝部一直小心切开至髋骨，分离肌肉。此时坐骨神经已可见于股二头肌下方。
3. 仔细解剖股二头肌。必要时进行电灼或结扎以防止出血。股二头肌可完全切除，或仅向一侧牵开，以暴露坐骨神经和腓肠肌。
4. 分离出腓肠神经。
5. 使用8/0丝线结扎腓总神经远端部分，并在结扎线远端切断。将神经向上端完全游离，尽可能接近髋部。
6. 在腓总神经与腓肠神经之间辨认胫神经。在胫神经的不同分支中，区分出支配腓肠肌的分支与走向更深层的分支（后者以下简称胫神经）。
7. 使用8/0丝线将所有非支配腓肠肌的胫神经分支一起结扎，保留支配腓肠肌的分支完整。在结扎线远端切断胫神经，并尽可能向上游离神经。
8. 用浸有生理盐水的纱布覆盖整个后肢，以防止组织干燥，同时进行下一步操作。

10. 椎板切除术

1. 使用剪刀沿脊柱背侧正中线做切口，分离皮肤与下方肌肉组织。
2. 在椎骨两侧分别做两个切口，分离皮下肌肉；随后剪断附着于椎骨两侧的各条肌肉肌腱。
3. 使用钝头镊子和精细刮匙，清除椎骨背侧棘突周围残留的肌肉组织，以清晰辨认每一节独立椎骨。
4. 辨认第13胸椎（T13）和第1腰椎（L1）。T13是最后一节带有肋骨连接的椎骨。使用Cunningham脊髓椎夹（Stoelting Co.）固定脊柱，将椎夹分别置于T13和L1两侧。注意避免压迫脊髓，但需沿纵轴施加轻微张力。用镊子轻轻按压，确认脊柱已牢固固定。
5. 使用精细咬骨钳，先去除T13和L1节段的棘突，再去除椎板，从而暴露脊髓。
6. 用浸有生理盐水的小块棉片或海绵覆盖暴露的脊髓，防止干燥。
7. 将定制的塑料浴槽置于动物背部，环绕脊髓区域，并使用4/0丝线将浴槽固定。用Kwik-Cast密封剂（WPI）密封接缝，确保浴槽防水。
8. 待Kwik-Cast完全干燥后，移除覆盖脊髓的棉片，并向浴槽内充满矿物油。
9. 使用Dumont 5号镊子和极精细的虹膜剪，轻柔牵拉包裹脊髓的硬脊膜，向两侧尽可能展开切口，并将硬脊膜向脊髓两侧折叠固定。
10. 降低小鼠所处的抬高平台，使其仅由椎夹悬吊固定。
11. 使用另一个椎夹夹住骶部的一个棘突，以支撑动物背部区域。
12. 使用第三个夹子固定右后肢，使其膝关节屈曲成90°角，并固定踝部。

11. 跟腱解剖

1. 将肢体在膝关节和踝关节处弯曲成90°，移除覆盖后肢区域的纱布，游离跟腱周围的组织。尽可能将腓肠肌（Triceps Surae）从周围组织中解剖出来。
2. 在跖肌（Plantaris muscle）肌腱靠近跟骨处切断一次，再切断一次以完全移除该肌腱。
3. 使用带线缝合针，将6/0丝线穿过跟腱，并在肌腱周围打三重结固定。
4. 将力传感器放置在结附近，切断肌腱远端，并用丝线将其连接到力传感器上。
5. 将两段不锈钢丝插入腓肠肌（Triceps Surae）筋膜下方。这些导线连接至细胞外交流放大器，用于肌电图（EMG）记录。
6. 将腓总神经（Common Peroneal nerve）和胫神经（Tibial nerve）分别置于两个双极钩状电极上。
7. 将腓肠肌神经置于钩状电极的阴极，阳极接触附近肌肉组织。
8. 将所有刺激电极连接至隔离单元。
9. 将一个球状电极放置于脊髓背侧表面，连接至细胞外交流放大器以记录脊髓背角电位。将Ag/AgCl参比电极与背部肌肉接触。

12. 第十二步

使用持续时间为50 μsec的方波脉冲，以低频（<1 Hz）逐渐增加刺激强度，刺激腓肠肌神经，直至观察到最大单收缩幅度。在监测单收缩反应幅度的同时，缓慢移动力传感器以拉伸肌肉，直至单收缩幅度达到最大值。

13. 运动神经元的细胞内记录

从这一步开始，采用标准的电生理学技术制备细胞内电极，穿刺脊髓中的神经元，并将其鉴定为运动神经元。

1. 使用拉针仪（P-97 Micropipette Puller, Sutter Instruments）将玻璃微电极拉制至尖端直径约 1 μm。用 3M KCl 溶液充灌电极（电极电阻为 10–20 MΩ）。
2. 利用显微操作器将连接至细胞内放大器（Axoclamp 2B, Axon Instruments）的微电极插入脊髓。通过刺激各条神经并记录诱发的局部场电位，定位腓肠肌运动神经元池。
3. 在监测微电极电阻的同时，小心接近疑似运动神经元。当电极尖端接触细胞膜时，电阻会升高。有时可使用细胞内放大器的“buzz”功能辅助穿透细胞膜。

14. 安乐死操作步骤

实验结束时，通过静脉注射过量戊巴比妥（210 mg/kg）处死动物，随后进行断头。

结果

图1展示了在穿刺后如何识别腓肠肌群中的一个运动神经元。在低强度刺激下，仅能观察到单突触兴奋性突触后电位（EPSP）（图1A）。当刺激强度升高时，EPSP可能足够大以引发一个“顺向传导”的锋电位（图1B）。在更高的刺激强度下，会出现一个“全或无”的逆向传导锋电位，其潜伏期短于单突触EPSP（图1C）。如果通过微电极注入足够的电流以引发锋电位，则可在肌肉上记录到短暂延迟后的肌电活动，随后出现肌肉抽搐（图1D）。在确认运动神经元身份后，可进一步表征其电生理特性。例如，图2展示了如何利用超极化和去极化电流脉冲来测量输入电阻（图2A），以及如何通过绘制膜电位变化与注入电流强度之间的关系曲线来分析该特性（图2B）。

也可通过不同的刺激方案来研究运动单位的收缩特性。例如，通过在运动神经元中以不同频率施加短暂的电流脉冲，可以获得力...

讨论

本文所述的制备方法首次实现了在成年小鼠中，对腰段运动神经元进行细胞内记录的同时，测量其轴突所支配的肌纤维产生的力量。

由于动物体型较小，实施该手术所需的技术较难掌握。然而，一旦掌握这些技术，整个手术可在三小时内完成，且动物在手术结束后可继续存活长达7小时以进行记录。该技术的成功主要取决于麻醉的管理。必须尽可能密切监测各项生理参数（如核心温度、pCO₂、心率等），并将其维持在各自的生理正常范围内。一旦出现异常，必须立即采取措施纠正，例如调节加热垫功率、调整呼吸机参数或追加麻醉剂。我们的经验表明，若未能持续密切关注这些参数，小鼠的生理状态可能在极短时间内迅速恶化。

机械稳定性在进行细胞内记录时至关重要。这一点尤其适用于 体内，其中运动神经元会受到血压、呼吸和肌肉收缩的影响而发生移动。尽管无法保证绝对的稳定性，但我们的方法能够实现对运动神经元持续十分钟或更长时间的稳定记录。这一效果通过使用四个夹具固定脊柱和腿部骨骼来实现。其中两个夹具尽可能靠近椎板切除部位，以固定该区域的脊髓。我们发现，缩...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸阿托品	Aguettant
甲基强的松龙	Pfizer	Solu-Medrol
戊巴比妥钠	Sanofi-Aventis	戊巴比妥
氯胺酮
赛拉嗪
葡萄糖
血浆代用品	Roger Bellon	Plasmagel
钝头剪刀	FST	14079-10
精细钝头剪刀	FST	15025-10
Vannas 弹簧剪刀	FST	15002-08
带齿精细镊子	FST	11370-32
带齿精细镊子	FST	11370-31
Cunningham 脊髓适配器	Stoelting Co.
Kwik-Cast 封固剂	WPI	#KWIK-CAST
呼吸机	CWE Inc	SAR-830/AP
二氧化碳监测仪	CWE Inc	μcapstar
加热毯	Harvard Apparatus	507221F
细胞内放大器	Axon Instruments	Axoclamp 2B
玻璃微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G