一种血小板介导的聚集现象简易实验方案 恶性疟原虫资源匮乏环境下感染性红细胞的检测

摘要

本方法研究临床分离株中Plasmodium falciparum感染红细胞（pRBC）的血小板介导聚集表型。该实验通过分离富含血小板的血浆，并将其与pRBC悬液共同孵育来完成。

摘要

P. falciparum 引起大多数严重的疟疾感染。脑型疟疾（CM）的病理生理机制尚未完全阐明，目前已有多种假说被提出，其中包括P. falciparum感染的红细胞（pRBC）在微血管中机械性阻塞。事实上，在其生命周期的红细胞内阶段，P. falciparum具有独特的能力，可通过将具有不同黏附特性的表面抗原输出至红细胞膜上，从而修饰被感染红细胞的表面。这使得pRBC能够通过与后微静脉微血管内皮细胞的黏附，滞留在多种组织和器官中¹。通过这种方式，成熟的寄生虫形态可避免因感染红细胞变形而被脾脏清除²，并将其生存环境限制在更低氧分压的更有利条件下³。由于这种滞留现象，外周血中仅能检测到未成熟的无性体阶段寄生虫和配子体。

成熟感染红细胞与微血管床表达的多种宿主受体之间的细胞黏附及滞留现象，在重症和无并发症疟疾中均会发生。然而，多条证据表明，仅特定的黏附表型可能与疟疾的严重病理结果相关。此类特定宿主-寄生虫相互作用的一个实例已被证实 体外，其中细胞间黏附分子-1 支持具有特定黏附特性的感染红细胞结合的能力已与脑型疟疾的发生相关联 ^4,5胎盘也被认为是疟疾感染孕妇体内受感染红细胞（pRBC）优先积聚的部位，其中表达于胎盘绒毛间隙衬层合体滋养层细胞上的硫酸软骨素A是主要受体 ⁶通过补体受体1（CD35）介导的感染性红细胞与未感染红细胞的花环状结合^7,8 也与严重疾病相关 ⁹.

最近被描述的之一 P. falciparum 细胞黏附表型是指感染红细胞形成血小板介导的聚集体的能力 体外. 这种感染红细胞（pRBC）聚集体的形成需要血小板表面表达的糖蛋白CD36。另一种在多种细胞类型（包括内皮细胞和血小板）上表达的人类受体gC1qR/HABP1/p32，也被证实可促进pRBC与血小板黏附，从而形成聚集体 ¹⁰是否发生凝集 体内 尚不明确，但它可能解释了马拉维死于脑型疟疾的儿童脑微血管中观察到的血小板显著积聚现象 ¹¹此外，临床分离培养物的聚集能力 体外 与中国马拉维患者疾病的严重程度直接相关 ¹² 以及莫桑比克患者 ¹³，（尽管在马里没有 ¹⁴).

由于对感染红细胞（pRBC）聚集表型的多个方面表征尚不充分，目前针对该现象的研究尚未遵循标准化的操作流程。这一问题尤为重要，因为已知该检测方法本身具有较高的变异性。 ¹⁵在此，我们介绍一种方法 体外 血小板介导的聚集 P. falciparum 希望该方案能为其他研究团队提供一个一致性的方法平台，并提高未来研究中对此表型检测局限性的认识。由于我们位于马拉维，本方案特别针对资源有限的环境设计，其优势在于可直接检测 freshly collected 临床分离株的表型，无需进行冷冻保存。

方案

1. 样本采集

血小板容易因温度变化、震荡或储存而被激活，因此应小心操作。在大多数临床情况下，采集血液制备血小板时不可避免地需要使用真空采血管，但需谨慎考虑，因为负压抽吸可能引起血小板活化。由于本研究医院采用的临床操作规程，我们的样本均小心地采集至含枸橼酸钠的真空采血管中。在此研究及我们之前的研究所中，均未出现血小板过早活化的问题¹²。我们从O+血型个体采集血液用于制备血小板，以尽量减少非特异性血型抗原聚集。此外，献血者在采血前7至10天内未服用任何药物，因为某些药物已知会影响血小板功能。

1.1 富血小板血浆（PRP）的制备

1. 从无疟疾感染史的宿主采集约 5 ml 全血，或从脑型疟疾（CM）或重症疟疾（SM）患者采集 2.5 ml 血液，置于含柠檬酸钠的真空采血管（BD 产品编号 36276）中。
2. 在室温下以250 × g离心全血10分钟。不要在4 °C下离心，因为低温可能导致血小板聚集。
3. 小心地将浑浊的上清液转移至一支干净的15 ml离心管中. 血小板极易因温度变化和物理震荡而被激活，因此应小心操作。避免振荡或对试管进行任何剧烈晃动。
4. 使用血细胞计数板对血小板悬液进行计数并调整至 >300 x 10³ 健康供者的血小板/μl 及 <150 x 10³ 使用1×磷酸盐缓冲液（pH 7.2–7.4；PBS）对CM和SM患者的血小板/μl进行计数。务必选择较高的稀释倍数，以方便血小板计数并确保其准确性。

注意：与健康个体相比，疟疾患者的血小板计数降低^16,17,18。因此，脑型疟疾（CM）和非脑型疟疾（UM）的血小板浓度根据各疟疾诊断组患者平均血小板计数进行调整。P. falciparum 的聚集表型在脑型疟疾分离株中较为常见，且表现出较强的结合亲和力，因此血小板浓度的降低不会影响聚集物的大小或频率，因为所有脑型疟疾病例的血小板浓度均已标准化。

1.2 富血小板血浆（PPP）的制备

1. 为获得贫血小板血浆（PPP），将上述获得的富血小板血浆（PRP）部分在1,500 × g离心10分钟。大部分血小板将沉淀至管底。
2. PRP和PPP均可在4 °C保存长达两周。理想情况下，凝集试验应使用新鲜血小板。8至10天后，大多数血小板可能已失活并可能发生聚集。

2. 寄生虫培养

1. 将压积红细胞（pRBC）用 5–10 ml RPMI 1640 培养基洗涤三次，每次在 370 × g 条件下离心 5 分钟。
   注意：本实验方案中，所有培养均起始于约 1 ml 压积细胞体积（PCV），并维持在 5% 的血细胞比容。可根据需要使用未感染红细胞和培养基调整起始 PCV，以达到目标血细胞比容。
2. 将 pRBC 置于培养瓶中，并加入含 25 mM HEPES、5% Albumax II 或 10% 血清以及 40 μg/ml 庆大霉素的 RPMI 1640 标准疟原虫培养基，调节至 5% 血细胞比容。
3. 在密封并培养前，用含 92.5% 氮气、2.5% 氧气和 5% 二氧化碳的混合气体对培养瓶进行气体置换。或者，也可采用 Trager-Jensen 描述的密闭蜡烛罐法。
4. 对于直接来自患者的 pRBC，将其培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 24–36 小时，以获得成熟的寄生虫。
   注意：大多数实验室常用株及适应培养的虫株在标准条件下均易于维持培养。下文将介绍几种简单技术，可用于同步不同发育阶段的寄生虫，以保持其生长速率。
5. 按以下方法制备薄血涂片，并在光学显微镜下观察寄生虫的成熟情况。

3. 薄血膜涂片制备

1. 将约 10–15 μl 血液置于平放的磨砂玻璃载玻片一端。
2. 用另一张载玻片的边缘接触血滴，直至血液均匀分布在该载玻片边缘。
3. 将第二张载玻片保持在 45° 角，快速而轻柔地在第一张载玻片上推移血液，避免对第一张载玻片施加过大压力，形成一层均匀的薄血膜。空气中自然干燥。
4. 将载玻片浸入甲醇中 10 秒。空气中自然干燥。
5. 将载玻片浸入 2% 吉姆萨染液中至少 10 分钟。用清水充分冲洗，直至流出的水清澈为止。空气中自然干燥。
6. 使用光学显微镜的 90–100 倍油镜观察载玻片。

4. 无性阶段的纯化与同步化

纯化成熟的P. falciparum感染红细胞（pRBC）是进行聚集实验的必要步骤。事实上，只有在疟原虫发育至成熟阶段时，其表面才会表达并突出相应的配体，从而能够与血小板受体结合。目前有多种方法可用于纯化和同步化P. falciparum的无性繁殖阶段：晚期无性阶段可通过Percoll梯度离心¹⁹、磁性细胞分选²⁰，或采用本文所述的明胶沉降²¹方法进行富集。山梨醇同步化法可选择性保留环状体阶段²²，随后将环状体继续培养24–26小时，即可获得成熟阶段的疟原虫（无需进行明胶漂浮处理）。

4.1 质粒凝胶浮选

Plasmagel 浮选法利用类似明胶的溶液，使较轻的带 knobs 红细胞保留在溶液中，而密度较高的环状体和花环状结构则沉降至底部。该技术可获得高达 90% 纯度的成熟期感染红细胞，适用于野外和实验室分离株。然而，如前所述，Plasmagel 浮选法会同时去除形成花环的感染红细胞（pRBC）以及未成熟阶段的虫体，可能导致高花环形成频率样本中的聚集频率降低。不过，Plasmagel 浮选后花环状 pRBC 的缺失不会影响聚集实验，因为花环形成是感染红细胞与未感染红细胞之间的相互作用，而聚集则是由血小板介导的感染红细胞之间的结合。这两种表型所涉及的配体不同，其中花环形成主要由未感染红细胞表面的补体受体 CR-1 介导。

1. 将Gelofusine溶液和无血清/Albumax II培养基在水浴中预热至37 °C。
2. 将培养物转移至洁净的无菌15 ml离心管中，在室温下以370 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
3. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀，然后用等体积的Gelofusine和无蛋白培养基重悬细胞。
4. 将混合液转移至无菌15 ml离心管中，置于37 °C培养箱中静置15–20分钟，或直至观察到明显的上下层分界。
5. 小心将上层液体转移至新的无菌15 ml离心管中，并加入10 ml新鲜RPMI培养基。
6. 以370 × g离心5分钟，然后小心弃去上清液。
7. 通过薄血涂片评估寄生率和发育阶段，并按照第4节所述方法在光学显微镜下观察。

注意：成熟pRBC的比例占感染红细胞的60-90%，具体范围取决于培养物的初始寄生率。若需获得较高比例的成熟寄生虫，应使用初始寄生率≥10%的培养物。

5. 聚集试验

1. 使用血细胞计数板对经Plasmagel浮选后获得的pRBC悬液进行计数，并调整浓度至1 × 10⁸ pRBC/μl
2. 在新的 1.5 ml 离心管中，将 pRBC 重悬于终浓度为 20 μg/ml 的吖啶橙中，调节红细胞压积至 5%，并加入占总体积 10% 的 PRP。
   可使用 25 μg/ml 溴化乙锭染色寄生虫培养物 5 分钟，替代吖啶橙染色。
   例如 对于200 μl反应体系，加入10 μl成熟红细胞、20 μl 300 x 10³ 血小板/μl，用于健康供体的PRP或150 x 10³ 血小板/μl 来自SM患者，以及170 μl无蛋白培养基。
   注意：最终反应中血小板与pRBC的比例为20:1。这一点非常重要，因为它能够确定样本的最大凝集频率。若在对照组中加入的血小板数量较少，则并非所有可凝集的pRBC都有机会发生凝集。
3. 以相同方式制备以下对照：未感染的红细胞与富血小板血浆（PRP），以及寄生红细胞与贫血小板血浆（PPP），以明确血小板在寄生红细胞聚集中的作用。
4. 将悬液转移至1.5–2.0 ml锥形螺口离心管中。
5. 将小瓶置于室温下，以10-12 rpm的速度轻轻振荡。
6. 通过移液器吸取10 μl红细胞包被的血小板混合液（pRBC ± 血小板混合物）置于载玻片上制备湿片，盖上盖玻片后在荧光显微镜下观察，检查是否有团块形成。
7. 采样可在120分钟内以15-20分钟间隔进行。团块定义为三个或更多感染红细胞的聚集物。

结果

在通过Plasmagel漂浮法富集约70%成熟阶段的P. falciparum后，使用血小板介导的聚集试验的一个示例如图2所示。聚集物是指三个或更多感染红细胞的聚集体。使用吖啶橙或溴化乙锭染色后，可通过荧光显微镜观察。吖啶橙的光谱特性与荧光素相似，激发波长最大值为502 nm，发射波长最大值为525 nm（绿色）；而溴化乙锭的激发波长最大值为493 nm，发射波长最大值为620 nm（类似于罗丹明染料，呈红色）。在显微镜下，这些聚集物易于识别：在普通光线下表现为细胞聚集体，而在荧光下，经吖啶橙或溴化乙锭染色后分别呈现绿色或红色亮点，如图2所示（使用吖啶橙的30分钟时间点）。聚集物越大，在普通光线下看到的细胞聚集体越大，在相应染料的荧光下呈现的绿色或红色亮点也越大。由于这些染料靶向DNA，因而可染色细胞核，而血小板和未感染的红细胞因无细胞核，在荧光显微镜下无法被检测到。

30分钟后出现随机形成的小型pRBC聚集体，每个聚集体含4.7±1.6个pRBC。聚集体大小显著增加至平均 >孵育120分钟后，每个聚集体含有约15个感染红细胞（pRBC）或聚集体，部分聚集体内含有大量无法通过肉眼计数的pRBC/聚集体。聚集体表型频率通过双份检测中每1,000个感染细胞中存在于聚集体内的感染细胞数量进行计算。

图1. 凝集实验的工作流程。 制备富血小板和贫血小板血浆(A)以及P. falciparum感染的红细胞培养物(B)，然后混合进行凝集实验(C)。

图2. 恶性疟原虫（P. falciparum）实验室分离株感染的红细胞发生聚集。 HB3菌株在富含血小板的血浆中于0、30和120分钟时形成的聚集体(A)，以及在血小板贫乏血浆中聚集体形成较少(B)。

检测的局限性

存在一些特定限制因素，可能影响血小板功能或结果，其中大多数问题此前已被Arman和Rowe¹⁵指出。以下列举在检测不同阶段可能遇到的一些潜在问题：

1. 适应临床分离株 体外 培养可能具有挑战性，因为有时需要较长的培养时间才能达到足够高的寄生虫血症水平，以允许形成凝集团块。由于抗原变异率较高， P. falciparum长期培养后，适应培养的寄生虫的黏附表型可能无法反映原始感染寄生虫群体的特征。
2. 为避免因血型抗原导致的非特异性凝集，血小板供体应与同次检测中使用的临床分离株在血型抗原上相匹配，或使用通用供体血型O-。然而，在马拉维等非洲地区，O-型血个体较为罕见，因此通常使用的血小板来自O+型血供体，且必须进行血型匹配。
3. 在湿片制备中计数凝集块既繁琐又难以进行图像采集，因为细胞处于持续运动状态。通常，感染红细胞（pRBC）会聚集在盖玻片边缘，或相互黏附形成“假性”凝集块，容易与真实凝集块混淆。为减少细胞运动，分析前应在室温下静置15分钟，使细胞自然沉降。
4. 凝集试验对时间较为敏感，因此为了获得最佳准确性，每人每次只能分析一个样本。若同时处理多个样本，不同样本的采样时间点容易发生重叠，从而导致样本间的采样时间点不匹配。在此类情况下，可使用复杂的定量软件来计算凝集团块的大小，或使用细胞特异性抗体来分析团块的组成成分。尽管这些技术可显著提升数据的可靠性，但在资源有限、该试验最可能被应用的环境中，此类技术与设备往往难以获得。

讨论

我们已描述了一种血小板介导的凝集试验，用于在野外直接研究临床分离株中的感染性红细胞。血小板介导的凝集是某些疟原虫感染红细胞的特征性行为， P. falciparum 临床分离株中已鉴定出一种独特的黏附表型，该表型在结合CD36的分离株中较为常见 ^12,23-24我们已利用该检测方法确定了三个主要要点：1）一个强烈的 体外 聚集表型 P. falciparum 从马拉维儿童中分离出的与疾病严重程度和诊断相关的疟原虫；2）新型受体P-选择素与CD36共同介导红细胞在血小板上的聚集；3）脑型疟疾患者中血小板减少的程度足以限制感染性红细胞进一步形成聚集体 体外 ¹²通过湿片制备法（如第6节所述）观察血小板在凝块形成中的作用。可通过高速离心从富血小板血浆（PRP）中分离血小板，以尽量减少血型抗原反应；但本实验采用全量PRP，以避免因过度操作和高速离心导致血小板过早活化。血小板活性可通过血小板聚集试验检测，使用弱血小板激动剂如肾上腺素或二磷酸腺苷（ADP）。 ²⁵ 如所述 ²⁶.

该检测方法中存在多个此前表征不足的方面，其中之一便是选择富血小板血浆（PRP）来源的重要性以及血液抗原类型对检测结果的影响。我们采集了血型为O+且在采血前7至10天内未服用任何药物的个体的PRP，因为某些药物可能会影响血小板的行为。

可能影响聚集成功的其他因素包括红细胞压积、寄生虫血症水平以及聚集试验的持续时间。使用较高的红细胞压积和血小板计数时，很难判断细胞团块究竟是真正的聚集，还是仅仅由于细胞密度过高而堆积在一起¹⁵。此外，通常随着孵育时间的延长，聚集现象会增加。在设计聚集实验时，应考虑以上这些有用的指导原则。

我们发现，如果条件允许，可使用同一供体的富血小板血浆（PRP）平行分析不同临床组的样本；但在资源有限的现场环境中，通常献血者来源有限。因此，很难仅依赖单一的O+型供体来标准化检测。为此，我们筛选了多名O+型供体，以尽可能确保血型相容性。在样本量较大的情况下，使用多名供体也有助于避免献血负担集中于单一个人。

如果由单人进行检测，15-20分钟的采样点更为可行，可进行湿片制备并完成检测动力学分析，且避免采样时间相互重叠。大部分显微镜数据为视觉判断，具有一定主观性，因此细胞计数应由多人共同确认。在此情况下，一次处理一个样本，每天可完成三至四个样本的完整分析，具体数量取决于个人操作效率。

血小板介导的聚集实验可使用临床分离株和实验室分离株进行。对于实验室菌株，建议使用能够结合CD36的寄生虫，以最大程度提高聚集频率。该实验可与其他凝集实验（如玫瑰花环形成实验）联合使用，也可用于聚集抑制实验，从而研究可能介导感染红细胞（pRBC）结合的血小板表面受体，这是该表型中一个尚未被充分理解且研究较少的方面。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
吖啶橙	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
琥珀酰明胶	B Braun	Gelofusine
1 M HEPES	Invitrogen	15630
庆大霉素	Invitrogen	15750045	50 mg/ml
白蛋白替代物（Albumax）	GIBCO	1102-037
枸橼酸钠真空采血管	BD	362760	容量 4 ml
倒置显微镜	Leica	MD16000 B
荧光显微镜	Leica	EL6000	配备用于吖啶橙和溴化乙锭的蓝色与绿色激发光荧光滤光片