一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

摘要

我们描述了一种从神经、肌肉及已鉴定的单个神经元进行细胞外记录和刺激的技术 体外 在摄食装置中诱发并观察不同类型的摄食行为 Aplysia.

摘要

多功能性，指单一外周结构产生多种不同行为的能力¹，使动物能够快速适应变化的环境。海洋软体动物 Aplysia californica 为研究多功能性提供了一个易于操作的系统。在摄食过程中， Aplysia 利用同一摄食器官——口球，产生多种截然不同的行为。控制这些行为的神经节包含多个体积较大且已被鉴定的神经元，可进行电生理学研究。这些神经元的活动表现为两类运动程序，根据控制食物抓握器关闭的神经活动与控制抓握器伸出或缩回的神经活动之间的时序关系，可将运动程序分为摄食性和排飞性两类。²然而，在离体神经节中，能够产生这些行为的肌肉运动并不存在，因此更难确定所观察到的运动程序是否真实行为的对应表现。 体内，已获得与摄食程序相对应的神经和肌肉记录^2,3,4，但直接记录单个神经元的活动非常困难⁵此外， 体内，摄食程序可进一步分为咬合和吞咽^1,2，这一区别在以往大多数已描述的方法中均难以实现 体外 制备物

悬置的口器团块制备（图1）填补了离体神经节与完整动物之间的空白。在此制备中，摄食行为（包括咬合和吞咽）以及排食行为（排斥）均可被诱发，同时可使用细胞外电极对单个神经元进行记录和刺激⁶。与这些不同行为相关的摄食运动可以被记录、量化，并直接与运动程序相关联。在悬置的口器团块制备中，所观察到的运动程序似乎比在离体神经节中诱发的运动程序更接近于in vivo状态下观察到的程序。因此，该制备中的运动程序可更直接地与in vivo行为相对应；同时，单个神经元相较于完整动物更易于进行记录和刺激。此外，作为离体神经节与完整动物之间的中间步骤，来自悬置口器团块的研究结果有助于解释在更简化或更完整条件下所获得的数据。悬置的口器团块制备是研究Aplysia中神经对多功能性控制的一个有效工具。

方案

1. 溶液的配制

1. 为配制与动物所处海水渗透压等渗的氯化镁溶液（约 1,000 毫渗透摩尔），在大烧杯上标记所需体积的刻度。先加入蒸馏水至该刻度约 80% 处，称取适量六水合氯化镁，使其在最终体积中形成 333 mM 的溶液。将六水合氯化镁加入烧杯中，盖紧盖子并剧烈摇晃，直至完全溶解，然后加蒸馏水至最终体积。
2. 配制 Aplysia 生理盐水时，同样在大烧杯上标记所需体积的刻度，并加入蒸馏水至该刻度约 80% 处。将烧杯置于搅拌器上，放入搅拌子，开启搅拌器。
3. 依次称取以下各物质的适量，逐一加入烧杯中，使最终体积中各成分浓度分别为：460 mM 氯化钠、10 mM 氯化钾、22 mM 六水合氯化镁、33 mM 七水合硫酸镁、10 mM 二水合氯化钙、10 mM 葡萄糖、10 mM MOPS。
4. 待溶质完全溶解后，使用 pH 计测量溶液的 pH 值。缓慢加入 1 M 氢氧化钠溶液，将 pH 调至 7.5。若不慎加入过多氢氧化钠，可用 1 M 盐酸溶液回调 pH 值。
5. 加蒸馏水至最终体积。
6. 为减缓细菌生长，将溶液储存于冰箱中，待实验需要时取出。需注意温度可能影响 Aplysia 的运动程序。我们未对温度进行严格监控，但在实验装置完成后，标本通常接近室温。

2. 记录培养皿的制备

1. 实验过程中，口器团将悬浮于一个圆形的 Pyrex 培养皿中，该培养皿直径为 100 mm，高为 50 mm。该培养皿应设有前室用于放置口器团，中间为狭窄且抬高的平台，用于将口神经节固定在 Sylgard 上，后部另设一个独立且抬高的腔室，用于隔离脑神经节。Sylgard 上应切出一个凹槽，以连接口神经节所在的平台与脑神经节腔室。参见 图1，构建培养皿时需参考指定的关键尺寸。
2. 首先准备一个圆形的100 × 50 mm Pyrex培养皿。按照产品说明书配制Sylgard。培养皿的制备需分多次倒入Sylgard，每次倒入后均需等待Sylgard固化。
3. 第一次浇注是为了在培养皿中形成Sylgard的最高层面，即颊侧室与脑室之间的壁（参见 图1）。用建模黏土将培养皿的这一区域与其他部分隔开。对于平直的隔墙，可使用 cardboard 并以建模黏土作为支撑；对于弧形隔墙（可减小容纳脑神经节的腔室尺寸），则单独使用建模黏土构筑墙体基础。所有将与 Sylgard 接触的墙体表面均需用塑料薄膜包裹，以便后续更容易拆除。
4. 一旦按照2.3所述将颊部室与脑室之间的壁空间封闭，并确保边缘密封严密以尽量减少泄漏，将Sylgard倒入该空间，直至接近培养皿顶部。让Sylgard过夜固化，确保完全固化后再继续后续操作。将培养皿置于温暖处可加快固化速度。
5. 接下来，应倒入颊神经节平台和脑神经节腔（同样，请参考 图1，显示了这些神经节在培养皿中的最终位置）。移除之前的阻隔壁，在中间区域的平直Sylgard壁外侧0.5 cm处建立新的阻隔壁，以分隔出用于放置口侧神经节的平台。用于容纳脑神经节的后室无需额外构建隔墙。向两个区域倒入Sylgard，液面高度约为距离顶部约3 mm。脑室部分应略低于口侧神经节平台。再次静置过夜，使Sylgard固化。
6. 最后，倒入前室即，用于悬挂口器团的腔室）。无需设置隔板。按指定高度倒入适量液体 图1.
7. 最后一步是切割一个连接口侧神经节平台和脑室的切口，切口的深度应与口侧神经节平台的水平一致。可使用手术刀片进行切口。 图1 展示完成后的培养皿。

3. 电极制备

1. 使用 Flaming-Brown 微电极拉制仪从单桶毛细玻璃管中拉制细胞外电极。电极的内径应约为 40 μm，电阻应约为 0.1 MΩ。当拉制仪中使用 FT345B 丝时，我们常用的拉制程序设置为：加热 480，拉力 50，速度 13，时间 20；但需注意，不同丝材的设置会有所不同。该程序可在一次拉制中完成电极制备，无需火焰抛光步骤。在开始实验前，用 Aplysia 生理盐水反向填充细胞外电极。
2. 按照与 Cullins 和 Chiel⁴ 所述类似的方法制备用于神经和肌肉记录的钩状电极²，但单根电极无需相互缠绕。具体制备步骤见 3.3–3.13。
3. 剪取一段约 60 cm 长、直径为 0.001 英寸的漆包不锈钢丝。在导线两端各固定一个橡皮泥球，用手捏住导线中点将其悬空提起，然后旋转两端的橡皮泥球，使导线相互缠绕（以减少电容性瞬变）。
4. 将两个橡皮泥球合并为一个，使导线两端固定在一起，并用胶带固定导线另一端以悬挂导线。
5. 用家用硅胶粘合剂涂覆整段导线：将胶体涂于拇指上，用拇指与食指夹住导线并沿其滑动，使胶均匀覆盖导线表面。静置过夜使其干燥。
6. 胶体干燥后，将导线平放于体视显微镜下。剪断此前为中点的位置，得到两根相互绞合的独立导线。此即差分电极。
7. 用胶带固定电极一端。使用镊子去除胶层和漆层，在一端准备出约 2 cm 的裸露导线，其中约 1 cm 长度去除了漆层。将金质连接针分别焊接到两根导线上，并用实验室胶带包裹连接针以保持彼此隔离。
8. 在电极另一端，准备出约 3 mm 的裸露导线。将其中一根导线末端约 1 mm 处的漆层去除，并将其弯折并移开，作为参考电极。必须确保两根导线的裸露部分彼此不接触。
9. 将另一根导线的漆层完全去除至硅胶涂层处。将该导线弯成钩状，并剪至约 1 mm 长。此钩将用于连接神经或肌肉。使用较短的钩可提高神经连接电极时的稳定性。
10. 使用万用表检测电极是否正确组装且结构完整。一个金质连接针与其中一根导线尖端之间的电阻读数应约为 200–500 欧姆，另一个金质连接针与另一根导线之间的读数也应相近。
11. 若某根导线无连续连接，可尝试重新剥离导线末端并重新焊接一个或两个金质连接针以恢复连接。若两个金质连接针均与两根导线导通，则可能存在两根裸露导线接触的情况。可尝试修复另一端以消除该问题；否则应弃用该电极。
12. 根据实验所需数量重复上述步骤制备电极。钩状电极可在多次实验中重复使用，方法是剪除连接过神经的一端并制作新的钩，直至导线因多次使用而过短为止。每次操作后均需使用万用表检测电极是否完整。
13. 为在实验过程中区分不同电极，应对电极及其电缆进行标记。使用不同颜色的实验室胶带有助于识别。

4. 动物解剖与口器团制备

1. 选择一只体重约200-300 g的健康动物。当提供海藻时，该动物应以3-5秒的规律间隔产生具有强烈前伸动作的咬合行为。
2. 将动物置于解剖盘中，通过注射约为其体重50%的等渗氯化镁溶液进行麻醉。第一次注射时，将注射器以约15至30度的角度插入动物体中段附近，并朝向尾部方向。注射后，轻轻按摩动物体表以促进氯化镁扩散。根据需要，将注射器朝向头部方向进行额外注射。
3. 当动物对轻触刺激不再反应时，将其腹面朝下固定在解剖盘上，尾部和每个前触手各用一枚图钉固定。
4. 用镊子夹住并提起头部中央、嗅角后方的皮肤。在所夹持位置稍后方横向做冠状切口，然后沿中线向前在两个嗅角之间向口部方向做正中矢状切口，暴露口球结构。
5. 用镊子将靠近操作者的皮肤瓣从口球上轻轻拉开，并切断连接该皮肤瓣与体壁的神经和结缔组织，以完全分离皮肤瓣与口球。注意不要切断任何属于口球本身的神经或固有组织。
6. 用镊子夹住并固定食管，于夹持点后方切断食管。在进行后续切割时，向上牵拉食管以抬起口球。
7. 在口球后方，脑神经节、足神经节和侧神经节形成一个环状结构，其中脑神经节通过脑-口球连索（CBCs）与口球神经节相连。保留此环状神经节与口球的连接，并切断这些神经节通向身体其他部位的所有神经纤维。
8. 环绕口球切断其周围的结缔组织，随着口球与身体连接逐渐减少，持续将其向上提起。当口球仅通过口部与身体相连时，应将食管和口球垂直向上提起。
9. 在颚的前方做最后切割，使口球完全脱离身体。将分离的口球置于含50%等渗氯化镁溶液和50% Aplysia 生理盐水的混合溶液中，以便在连接电极期间维持部分麻醉状态。
10. 将口球连同溶液放入底部铺有Sylgard的培养皿中。切断侧神经节和足神经节与脑神经节之间的连接，将其移除。保留脑神经节通过脑-口球连索（CBCs）与口球神经节及口球的连接，但切断脑神经节与口球之间的其他连接。修剪食管和唾液腺至较短长度，以免妨碍操作。

5. 钩状电极的安装

1. 用于记录和刺激时，可根据实验需要将钩状电极连接至多种不同的神经和肌肉图2).
2. 表征所展示的模式 体内 由 Cullins 和 Chiel⁴将电极连接至齿舌神经、I2 肌肉以及口球神经 2 和 3。这些记录共同显示了口球肌肉主要本体运动神经元的活动情况^3,7,8，并允许通过I2记录识别前伸阶段³，来自颊神经2和3记录的回缩相^2,5,8，以及根据齿舌神经记录的食物钳闭合时间². 将一个额外的钩状电极连接至分支 a 用于颊神经2的模式刺激。电极的安放遵循与Cullins和Chiel所展示的类似步骤。⁴，具体步骤如下。
3. 每个电极连接时，将电极置于粗调操纵器上。在操纵器上用胶带固定一根末端带有鳄鱼夹的木棒，并用鳄鱼夹夹住电极的末端。鳄鱼夹应夹在电极的硅胶涂层部分，距离硅胶涂层末端约1 cm处。使用操纵器将钩状电极定位至口前部附近。
4. 将颚器侧放并紧贴培养皿侧壁以保持稳定，首先从齿舌神经开始，因其电极连接最为困难。该神经有两种暴露方法。
5. 齿舌神经从口神经节下方发出，在I2肌下方分为两个分支。首先观察是否可在不切断肌肉的情况下接触到齿舌神经。轻轻拨开连接口神经节与I2肌的白色鞘膜；切勿切断此鞘膜。若神经已可触及，使用尖端弯成钩状的镊子提起神经的一个分支。
6. 如果无法通过此方法接触到齿舌神经，第二种选择是定位位于较薄的I2肌下方的神经，并在I2肌上做一个小切口以暴露该神经。该切口应穿透两层肌肉。使用钩状镊子从肌肉下方钩出齿舌神经的一个分支。
7. 使用操纵器将电极的钩子置于神经旁边。为将神经放入钩内，可用有钩镊子夹住神经，同时用另一对镊子将被夹持的神经两部分分开，以便操作。
8. 当神经牢固地置于钩子上后，使用操纵器将神经从颊部组织中轻轻提起，直至其绷紧，但切勿过度拉伸。
9. 取一张吸水纸，将其中一个角紧紧拧成细条，形成一个小灯芯。用此灯芯吸干电极末端及钩住的神经部分。
10. 使用另一把弯头镊子将一滴Quick Gel超级胶水涂抹到钩状神经上。从导线与神经的接触点开始涂抹。确保钩状部分完全被胶水覆盖，而参考导线的尖端不被胶水覆盖。图3).
11. 使用带有聚乙烯管接头的注射器，将培养皿中的溶液涂抹于胶水上，以促使胶水表面固化。务必用溶液充分浸润胶水，以确保其充分固化。
12. 使用操纵器释放神经上的张力，然后将电极从夹子中取出。至此完成一个钩状电极的安装操作。
13. 接下来应连接I2肌肉电极。我们记录的是I2肌肉的肌电图（EMG）活动，而非其支配神经的神经电图（ENG）活动，因为I2神经非常细小，在完整的口球结构中难以接触。在靠近口神经2的位置，使用弯头镊子提起一至两条I2肌束，并用另一把镊子协助将其与其他肌肉部分分离。所分离的I2肌束厚度应与口神经2或3相近。注意避免过度分离，以免造成肌肉去神经化。使用与连接齿舌神经相同的步骤安装钩状电极。
14. 下一个要连接的电极是分支电极 a 颊神经2的这一分支可通过电刺激诱导运动程序⁹在颊神经2穿过I1肌外侧沟下方之前，该神经分为三支；分支 a 是最早分出的分支。分支较小，因此电极连接应小心进行。按照相同步骤连接电极。
15. 颊神经2和3易于接触。采用相同操作步骤，将电极大致连接在颊神经节与侧沟之间的中点位置。
16. 为了区分具有单侧与双侧投射的神经元，还有必要在口球另一侧的口神经2和口神经3，以及口神经2的分支上连接电极。 a，因为某些神经元对同侧与对侧的BN2刺激反应不同a 刺激

6. 神经节的定位与鞘膜的减薄

1. 将口球移至第2节所述的圆形100 × 50 mm Pyrex培养皿中。参见图1。
2. 使用移液器吸头蘸取少量真空脂，并将其均匀涂抹在脑室与口室之间的凹槽处，形成一层薄薄的覆盖层。我们发现，真空脂比凡士林更能有效减少渗漏。用Aplysia生理盐水填充前室。小心地将口球从培养皿转移至该较大培养皿的前室中，确保所有电极均未被过度拉紧，以免损伤神经。
3. 若需将培养皿转移至另一台双目解剖显微镜下进行鞘膜减薄操作，请特别注意钩状电极的安全。将位于口球一侧的所有电极归拢在一起，另一侧的电极也分别归拢。操作时应捏住覆盖在连接针脚上的实验室胶带部分来固定电极，再次确认无任何电极受到过度牵拉。
4. 当培养皿置于显微镜下时，应将电极轻轻搭放在培养皿边缘，并自然垂落于培养皿旁的平台上。
5. 在实验间歇及不同阶段之间，使用水族箱用气石对口球腔室中的生理盐水进行通气。
6. 将脑神经节向后固定，使脑-口连索（CBCs）穿过凹槽。在CBCs上方再涂一层真空脂，然后向培养皿的两个部分均添加更多的Aplysia生理盐水，确保神经节完全浸没。所添加的真空脂数量应高于脑室或口室中生理盐水的液面高度，以防止两室之间发生渗漏。此时，口球应平稳 resting 在前室底部，避免对神经和神经节施加过大的牵拉力。
7. 将口神经节固定在中间平台上。为避免损伤仍附着于口球的神经，仅可在两根神经之间的鞘膜区域插入固定针。在CBCs两侧各加两枚固定针，以拉伸并固定这些连索。
8. 根据目标神经元的位置，保持口神经节平坦或适当旋转。若需旋转口神经节，可用精细镊子夹住CBCs上多余的鞘膜组织，并将其固定在口神经2与3之间。这样即可观察到靠近后室、从口神经节顶部难以接近的大部分胞体。最后，在靠近口球一侧的口神经节鞘膜处添加两枚固定针，以最大限度减少口神经节的移动。参见图4。
9. 使用精细镊子夹住靠近后室一侧的口神经节鞘膜，然后用精细剪刀剪除多余鞘膜，注意不要暴露神经元胞体。为最小化损伤，仅去除观察胞体所必需的最少部分鞘膜即可。

7. 刺激与记录

1. 完成鞘膜的减薄后，将所有电极针连接到与放大器相连的电缆插座上。再次确保在此过程中电极不会被拉紧。确认电极已正确连接至相应的电缆，并且极性正确。
2. 为洗去残留的氯化镁，用新鲜的 Aplysia 生理盐水替换口球腔室中的 Aplysia 生理盐水。
3. 将丝线缝合线穿过口球前端、颌软骨前背侧的软组织，并使用两块橡皮泥将缝合线固定在培养皿边缘，从而从口球的前端将其悬挂起来。注意，后端由连接至口球神经节的口球神经悬吊。
4. 调整操纵器，使其夹持的玻璃细胞外电极尖端靠近口球神经节。
5. 为定位和识别神经元，使用操纵器将细胞外电极尖端轻柔地压在神经元胞体上方的鞘膜上（图5）。施加刺激电流，然后将用于激发胞体的通道切换至记录模式，以记录细胞外电极上的活动以及神经上的相应活动（图6）。参考已发表的神经节图谱和神经元描述（例如神经投射和肌肉支配情况）（例如 ^7,8），辅助识别神经元。
6. 为记录摄食程序的视频，将一面镜子置于培养皿侧面，以便同时观察口球的正面和侧面视图（镜子的位置在图1中以示意图形式标出）。将摄像机调整至其视野内同时包含正面和侧面视图。
7. 通过向摄像机视野内的电子计时器和用于记录与分析电生理数据的计算机程序 AxoGraph 中的某一通道同时发送 TTL 脉冲，实现视频与电生理记录的同步。该脉冲提供一个在 AxoGraph 和视频记录中完全一致的时间点，据此可对文件进行同步。
8. 定位某一神经元后，可在不同类型的类似摄食行为中记录其活动，这些行为可通过以下方法诱发。
9. 为诱导类似排斥的运动程序，使用一串持续时间较长的 2 Hz、1 毫秒脉冲刺激 BN2-a⁹（我们的经验表明，在此条件下该刺激可稳定引发排出性运动模式）。运动模式在刺激期间持续出现，有时在刺激结束后仍可持续一段时间。
10. 为诱导类似咬合的运动程序¹²，将少量固体卡巴胆碱晶体直接置于脑神经节上。或者，若需控制卡巴胆碱的暴露浓度，可使用含 1 至 10 mM 卡巴胆碱的 Aplysia 生理盐水溶液。较高浓度更易引发反应。重复性运动模式通常在 5 分钟内开始，持续约 10 至 15 分钟后逐渐减弱。
11. 为诱导类似吞咽的运动程序¹³，先施加卡巴胆碱，并等待口球产生强烈的咬合动作。然后在一次咬合过程中，将一条海藻（干紫菜）放入动物口中，使齿舌抓住海藻（图7）。条状海藻通常宽 0.5 cm、长 5 cm。
12. 在第一轮卡巴胆碱诱导的运动模式结束后，通常可再次获得卡巴胆碱反应。需彻底清洗脑神经节腔室中的 Aplysia 生理盐水，至少更换三次。再次施加卡巴胆碱前需等待至少 20 分钟；等待长达 40 分钟可能获得更可靠的结果。

目前在美国，无脊椎动物不需要经过机构动物使用与护理委员会的正式批准。然而，我们已确保对 Aplysia 的所有操作均将对动物造成的伤害和痛苦降至最低，并且所有解剖操作均在动物完全麻醉状态下进行。

结果

当细胞外电极置于神经元胞体上方并用于刺激该神经元时，可在胞体记录通道与该神经元投射所支配的神经上观察到一一对应的放电关系（图6，左图，对已鉴定神经元B9的刺激）。在施加电流时（图中时间点1），胞体通道（顶部通道）被设置为刺激模式，随后迅速切换至记录模式（时间点2）。通过保持电极位置不变，可在运动程序期间持续记录该神经元的活动（图6，右图），同时记录I2肌肉、齿舌神经以及左右两侧的口前神经2和3的活动。

图7展示了通过向脑神经节施加卡巴胆碱并在此期间将海藻条放入齿舌颚中以诱导卡巴胆碱引发的摄食行为后，记录到的一系列吞咽模式的视频图像。在7A中，齿舌外伸以夹住海藻；在7B中，齿舌回缩，将海藻拉入口中。视频与电生理记录可直接相互同步；图7中的静态图像对应于图6右侧面板中标注的时间点A和B。

讨论

以往的研究已对完整动物以及简化制备标本（如离体神经节）中的Aplysia运动程序进行了表征。在完整动物中，尽管已获得单个神经元的记录⁵，但此类实验极为困难，且在摄食过程中无法将电极从一个神经元移动到另一个神经元。在离体神经节中，则无法观察由神经活动引发的摄食运动。悬浮的口球囊制备标本填补了这两种极端情况之间的空白。

在之前的研究中曾使用过其他半离体 preparations，但悬浮的口球 preparation 具有显著优势。在一种半离体 preparation 中，唇部和口球仍保持连接，但该 preparation 结构过于简化，无法观察完整的摄食运动¹⁴。一种摄食头部 preparation^15,16 可实现体外（in vitro）观察摄食运动。然而，与本文所述的悬浮口球 preparation 相比，该摄食头部 preparation 的制备更为复杂，且仅能接触脑神经节中的单个神经元，而无法接触口神经节中的神经元。摄食头部 preparation 的优势在于，其保留了唇部和前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher Scientific	S671	生物级，认证
氯化钾	Fisher Scientific	P217	ACS认证
六水合氯化镁	Acros Organics	19753	99%
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63	ACS认证
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79	ACS认证
葡萄糖（右旋糖）	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
MOPS缓冲液	Acros Organics	17263	99%
卡巴胆碱	Acros Organics	10824	99%
氢氧化钠	Fisher Scientific	SS255	认证级
盐酸	Fisher Scientific	SA49	认证级
单通道毛细玻璃管	A-M Systems	6150
Flaming-Brown 微电极拉制仪 P-80/PC 型号	Sutter Instruments		使用灯丝：FT345B
漆包不锈钢丝	California Fine Wire		0.001D，h型涂层
家用 Silicone II 胶水	GE
Duro Quick-Gel 瞬干胶	Henkel corp.
A-M Systems 1700 型放大器	A-M Systems		滤波设置：300-500 Hz 神经，10-500 Hz I2 肌肉
Pulsemaster 多通道刺激器	World Precision Instruments	A300
刺激隔离器	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
Veeder-Root 累计计数器	Danaher	C342-0562
金质连接插针	Bulgin	SA3148/1
金质连接插座	Bulgin	SA3149/1
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Dow Corning
100 x 50 mm 结晶皿	Pyrex
高真空润滑脂	Dow Corning
移液器吸头	Fisher Scientific	21-375D
显微固定针	Fine Science Tools	26002-10
模型黏土	Sargent Art	22-4400
丝线缝合线	Ethicon	K89OH
Whisper 气泵	Tetra	77849
水族管路	Eheim	7783	12/16 mm
Elite 气石	Hagen	A962
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Yaki 寿司海苔	Rhee Bros
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark	34155