一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

摘要

我们描述了一种从神经、肌肉及已鉴定的单个神经元进行细胞外记录和刺激的技术 体外 在摄食装置中诱发并观察不同类型的摄食行为 Aplysia.

摘要

多功能性，指单一外周结构产生多种不同行为的能力¹，使动物能够快速适应变化的环境。海洋软体动物 Aplysia californica 为研究多功能性提供了一个易于操作的系统。在摄食过程中， Aplysia 利用同一摄食器官——口球，产生多种截然不同的行为。控制这些行为的神经节包含多个体积较大且已被鉴定的神经元，可进行电生理学研究。这些神经元的活动表现为两类运动程序，根据控制食物抓握器关闭的神经活动与控制抓握器伸出或缩回的神经活动之间的时序关系，可将运动程序分为摄食性和排飞性两类。²然而，在离体神经节中，能够产生这些行为的肌肉运动并不存在，因此更难确定所观察到的运动程序是否真实行为的对应表现。 体内，已获得与摄食程序相对应的神经和肌肉记录^2,3,4，但直接记录单个神经元的活动非常困难⁵此外， 体内，摄食程序可进一步分为咬合和吞咽^1,2，这一区别在以往大多数已描述的方法中均难以实现 体外 制备物

悬置的口器团块制备（图1）填补了离体神经节与完整动物之间的空白。在此制备中，摄食行为（包括咬合和吞咽）以及排食行为（排斥）均可被诱发，同时可使用细胞外电极对单个神经元进行记录和刺激⁶。与这些不同行为相关的摄食运动可以被记录、量化，并直接与运动程序相关联。在悬置的口器团块制备中，所观察到的运动程序似乎比在离体神经节中诱发的运动程序更接近于in vivo状态下观察到的程序。因此，该制备中的运动程序可更直接地与in vivo行为相对应；同时，单个神经元相较于完整动物更易于进行记录和刺激。此外，作为离体神经节与完整动物之间的中间步骤，来自悬置口器团块的研究结果有助于解释在更简化或更完整条件下所获得的数据。悬置的口器团块制备是研究Aplysia中神经对多功能性控制的一个有效工具。

方案

1. 溶液的配制

1. 为配制与动物所处海水渗透压等渗的氯化镁溶液（约 1,000 毫渗透摩尔），在大烧杯上标记所需体积的刻度。先加入蒸馏水至该刻度约 80% 处，称取适量六水合氯化镁，使其在最终体积中形成 333 mM 的溶液。将六水合氯化镁加入烧杯中，盖紧盖子并剧烈摇晃，直至完全溶解，然后加蒸馏水至最终体积。
2. 配制 Aplysia 生理盐水时，同样在大烧杯上标记所需体积的刻度，并加入蒸馏水至该刻度约 80% 处。将烧杯置于搅拌器上，放入搅拌子，开启搅拌器。
3. 依次称取以下各物质的适量，逐一加入烧杯中，使最终体积中各成分浓度分别为：460 mM 氯化钠、10 mM 氯化钾、22 mM 六水合氯化镁、33 mM 七水合硫酸镁、10 mM 二水合氯化钙、10 mM 葡萄糖、10 mM MOPS。
4. 待溶质完全溶解后，使用 pH 计测量溶液的 pH 值。缓慢加入 1 M 氢氧化钠溶液，将 pH 调至 7.5。若不慎加入过多氢氧化钠，可用 1 M 盐酸溶液回调 pH 值。
5. 加蒸馏水至最终体积。
6. 为减缓细菌生长，将溶液储存于冰箱中，待实验需要时取出。需注意温度可能影响 Aplysia 的运动程序。我们未对温度进行严格监控，但在实验装置完成后，标本通常接近室温。

2. 记录培养皿的制备

1. 实验过程中，口....

结果

当细胞外电极置于神经元胞体上方并用于刺激该神经元时，可在胞体记录通道与该神经元投射所支配的神经上观察到一一对应的放电关系（图6，左图，对已鉴定神经元B9的刺激）。在施加电流时（图中时间点1），胞体通道（顶部通道）被设置为刺激模式，随后迅速切换至记录模式（时间点2）。通过保持电极位置不变，可在运动程序期间持续记录该神经元的活动（图6，右图），同时记录I2肌肉、齿舌神经以及左右两侧的口前神经2和3的活动。

图7展示了通过向脑神经节施加卡巴胆碱并在此期间将海藻条放入齿舌颚中以诱导卡巴胆碱引发的摄食行为后，记录到的一系列吞咽模式的视频图像。在7A中，齿舌外伸以夹住海藻；在7B中，齿舌回缩，将海藻拉入口中。视频与电生理记录可直接相互同步；图7中的静态图像对应于图6右侧面板中标注的时间点A和B。

讨论

以往的研究已对完整动物以及简化制备标本（如离体神经节）中的Aplysia运动程序进行了表征。在完整动物中，尽管已获得单个神经元的记录⁵，但此类实验极为困难，且在摄食过程中无法将电极从一个神经元移动到另一个神经元。在离体神经节中，则无法观察由神经活动引发的摄食运动。悬浮的口球囊制备标本填补了这两种极端情况之间的空白。

在之前的研究中曾使用过其他半离体 preparations，但悬浮的口球 preparation 具有显著优势。在一种半离体 preparation 中，唇部和口球仍保持连接，但该 preparation 结构过于简化，无法观察完整的摄食运动¹⁴。一种摄食头部 preparation^15,16 可实现体外（in vitro）观察摄食运动。然而，与本文所述的悬浮口球 preparation 相比，该摄食头部 preparation 的制备更为复杂，且仅能接触脑神经节中的单个神经元，而无法接触口神经节中的神经元。摄食头部 preparation 的优势在于，其保留了唇部和前.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher Scientific	S671	生物级，认证
氯化钾	Fisher Scientific	P217	ACS认证
六水合氯化镁	Acros Organics	19753	99%
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63	ACS认证
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79	ACS认证
葡萄糖（右旋糖）	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
MOPS缓冲液	Acros Organics	17263	99%
卡巴胆碱	Acros Organics	10824	99%
氢氧化钠	Fisher Scientific	SS255	认证级
盐酸	Fisher Scientific	SA49	认证级
单通道毛细玻璃管	A-M Systems	6150
Flaming-Brown 微电极拉制仪 P-80/PC 型号	Sutter Instruments		使用灯丝：FT345B
漆包不锈钢丝	California Fine Wire		0.001D，h型涂层
家用 Silicone II 胶水	GE
Duro Quick-Gel 瞬干胶	Henkel corp.
A-M Systems 1700 型放大器	A-M Systems		滤波设置：300-500 Hz 神经，10-500 Hz I2 肌肉
Pulsemaster 多通道刺激器	World Precision Instruments	A300
刺激隔离器	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
Veeder-Root 累计计数器	Danaher	C342-0562
金质连接插针	Bulgin	SA3148/1
金质连接插座	Bulgin	SA3149/1
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Dow Corning
100 x 50 mm 结晶皿	Pyrex
高真空润滑脂	Dow Corning
移液器吸头	Fisher Scientific	21-375D
显微固定针	Fine Science Tools	26002-10
模型黏土	Sargent Art	22-4400
丝线缝合线	Ethicon	K89OH
Whisper 气泵	Tetra	77849
水族管路	Eheim	7783	12/16 mm
Elite 气石	Hagen	A962
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Yaki 寿司海苔	Rhee Bros
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark	34155