我们描述了通过使用辅助依赖型腺病毒载体（HDAd）将Neurogenin3（Ngn3）和Betacellulin（Btc）基因转移至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内，从而诱导肝脏中新生胰岛的形成，并实现高血糖的逆转。本方法利用了辅助依赖型腺病毒载体在体内高效转导以及外源基因持久表达的优势。
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摘要
摘要
1型糖尿病是由T细胞介导的自身免疫反应导致胰腺中胰岛素生成细胞被破坏而引起的。迄今为止，胰岛素替代治疗仍然是主要的治疗方法，因为胰岛移植受到供体来源有限以及需要长期免疫抑制的限制。通过基因转导方法导入胰岛谱系决定性转录因子Neurogenin3（Ngn3）和胰岛生长因子Betacellulin（Btc），可诱导胰岛新生，有望治愈1型糖尿病。
腺病毒载体（Ads）是一种高效的基因转导载体；然而，早期代次的腺病毒载体在体内应用时存在若干缺点。Helper-dependent 腺病毒载体（HDAds）是目前最先进的腺病毒载体，其开发旨在改善早期代次腺病毒载体的安全性，并延长外源基因的表达1。由于HDAds不含病毒编码序列2-5，仅保留腺病毒复制和包装所必需的cis元件，因而不具有慢性毒性。这使得HDAds能够容纳长达36 kb的基因进行克隆。
在本实验方案中，我们描述了生成 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 的方法，并将这些载体递送至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内。我们的结果表明，联合注射 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 可在肝脏中诱导形成“新生胰岛”，并逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。
方案
1. 将治疗基因克隆至HDAd穿梭载体
- 将小鼠 Ngn3 和 Btc cDNA 克隆至含有普遍性延伸因子-1 启动子（BOS）和 poly A 信号的 pLPBL1 质粒载体中。完成后，通过序列分析验证载体，然后将这些表达盒亚克隆至 pΔ28 HDAd 携带性质粒6中。
- 用 PmeI 消化 HDAd 携带性质粒，释放质粒骨架，通过苯酚/氯仿/异戊醇抽提法纯化 DNA，随后进行乙醇沉淀，并用转染级水重悬。
2. 辅助依赖型腺病毒载体的制备
HDAd 载体的制备涉及多个步骤，需严格遵循操作流程以获得最佳结果。
2.1 转染
- 转染前两天，将116细胞7接种至6 cm培养皿中，使其在转染当天达到70–80%融合度。
- 转染前3小时，移除培养基，并加入5 ml新鲜生长培养基[MEM补充10% FBS和1% PSG（青霉素、链霉素和谷氨酰胺），Invitrogen]。
- 使用Promega公司的ProFectionR哺乳动物转染试剂盒，按照生产商说明书，用步骤1.2中获得的10 μg DNA转染116细胞。
- 次日，用1 ml生长培养基洗涤细胞2次。在含有钙和镁的0.1 ml PBS（PBS++）中加入辅助病毒（HV），使其终浓度为每细胞500个病毒颗粒（vp），然后覆盖于细胞上。每10分钟轻轻摇动培养皿，使HV均匀分布。
- 60分钟后，加入1.5 ml维持培养基（MEM，5% FBS，1% PSG）。
- 次日再加入1 ml维持培养基。
- 观察细胞病变效应（CPE，细胞变圆并脱落）。感染后第2天，应有超过80%的细胞出现CPE。
- 收集粗制细胞裂解液（CVL，包括细胞和培养基），加入相当于总体积10%的40%蔗糖溶液，于-80 °C保存。该CVL标记为第0代（CVL-P0）。
2.2 载体扩增
- 反复冻融3次：-80 °C冷冻3–5分钟，37 °C融化1–2分钟。
- 在6 cm培养皿中，将0.5 ml CVL（添加HV至200 vp/细胞）覆盖于汇合的116细胞上，每5分钟轻柔摇动培养皿一次。30分钟后，加入1 ml维持培养基。
- 次日加入1 ml维持培养基。两天后，大多数细胞应出现细胞病变效应（CPE）。
- 收集CVL，并按步骤2.1.8所述方法于-80 °C保存（记为CVL-P1）。
- 重复该操作3次，获得CVL-P2至P4。
- 使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）从P1至P4收集的0.2 ml CVL中提取DNA，并利用针对HV和HDAd特异性的引物通过qPCR分析载体扩增情况（表1）。选择HDAd相对于HV呈指数扩增的传代样本（如图2中的P3）用于后续实验。
- 在15 cm培养皿中，用0.5 ml CVL和HV（200 vp/细胞）共感染90%汇合的116细胞，每5分钟轻柔摇动一次。30分钟后，加入10 ml维持培养基。
- 感染24小时后，加入5 ml维持培养基。
- 感染后48小时整，以1,500 × g离心5分钟收集细胞。
- 将细胞重悬于含4%蔗糖的1 ml PBS++中（记为P5），并于-80 °C冻存。
2.3 大规模 HDAd 生产
- 为在悬浮细胞培养中准备116细胞进行感染，将8个15厘米培养皿中汇合的116细胞转移至3升旋转瓶中，加入悬浮生长培养基（Joklik改良MEM，添加5%胎牛血清、0.1 mg/ml潮霉素和1%PSG），最终体积为1升，并在CO2培养箱中以60 rpm转速旋转培养8。
- 每天添加0.5升新鲜培养基，持续2天（共2升）。
- 在第3天计数细胞。当总细胞数达到1×109时，细胞即可使用。
- 将P5进行三次冻融处理。
- 通过在1,000 × g离心5分钟收集3升旋转瓶中的细胞。保留100毫升上清液用于重悬细胞。
- 将细胞转移至250毫升旋转瓶中，向细胞中加入P5和HV，每细胞200病毒颗粒（vp/cell），在37 °C、60 rpm条件下孵育1小时。
- 将细胞及培养基转移至3升旋转瓶，加入2升悬浮生长培养基。取1毫升细胞悬液加入12孔板的一个孔中，用于观察细胞病变效应（CPE）。
- 在CO2培养箱中以60 rpm转速将旋转瓶中的细胞继续孵育2天。
- 通过离心收集细胞，用15毫升100 mM Tris-HCl（pH 8.0）重悬，并于-80 °C保存（P6），直至纯化。
2.4 载体纯化
- 向P6中加入1.0 ml的5%脱氧胆酸钠，轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。
- 加入400 μl的2 M MgCl2、300 μl的RNase A（10 mg/ml）和300 μl的DNase I（10 mg/ml），在37 °C孵育1小时。
- 在室温下以6,000 × g离心10分钟，收集上清液。
- 在组织培养罩内用紫外灯对NVT 65超速离心管（Beckman）进行1小时的灭菌处理。
- 加入2.8 ml低密度CsCl溶液（1.25 g/ml），下层铺入2.8 ml高密度CsCl溶液（1.41 g/ml），然后上层覆盖5–6 ml上清液至管颈处。如有需要，可用100 mM Tris-HCl（pH 8.0）将管子加满。
- 使用Beckman LE-80K超速离心机和NVT-65转子，在10 °C、50,000 rpm条件下离心30分钟。
- 用70%乙醇擦拭针刺区域，使用配备22号针头的3 ml注射器通过侧壁穿刺收集下层乳光条带（图3a）。有时在较明显的载体条带下方可见一条极淡的辅助因子条带。应尽可能收集载体条带，避免混入辅助因子条带。此步骤中即使吸入少量辅助因子条带也可接受，因其将在后续的过夜离心中被进一步分离。
- 将收集的条带转移至新的灭菌超速离心管中，再覆盖1.35 g/ml的CsCl密度溶液至管颈处，填满离心管。
- 在10 °C、50,000 rpm条件下离心过夜。收集乳光条带（图3b）。
- 将条带转移至透析盒（Slide-a-Lyzer，10,000 MWCO，Thermo-scientific）中。
- 在4 °C条件下，用3 L灭菌的10 mM Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液（含2 mM MgCl2和4%蔗糖）透析过夜。
- 从透析盒中取出HDAd载体。分装20 μl用于物理滴度测定，50 μl用于DNA特性分析。（注意：对于Ngn3载体，由于HDAd-Ngn3的产量较HDAd-Btc或HDAd-空载体低，需重复“P6”步骤三次以获得足够的载体。）
2.5 HDAd 载体的表征
- 使用光密度（OD）测定物理滴度（vp/ml）。将20 μl载体或20 μl透析缓冲液加入含0.1% SDS的380 μl TE缓冲液中，56 °C孵育20分钟。在260 nm处测定OD值。物理滴度 = OD260 × 1.1 × 1012 x 20 (vp/ml)
- 通过qPCR分析HV污染。取50μl样品，使用DNeasy组织/血液DNA提取试剂盒（Qiagen）提取DNA。将DNA稀释1000倍后，取5μl进行qPCR分析，使用辅助因子和载体特异性引物（表1）。辅助病毒污染应低于1%，如图所示 图 4A.
- 使用Southern印迹法分析载体结构。进行Southern印迹分析10 使用反向末端重复序列（ITR）探针进行检测。代表性结果如图所示。 图4B.
- 确定 体外 效率。在12孔板中，以每个细胞1000个病毒颗粒（vp/cell）的感染复数，对已知数量的116个细胞进行HDAd载体感染，设四个重复孔。感染48小时后收集细胞，提取RNA，通过qRT-PCR检测Ngn3和Btc mRNA的表达水平。表1。代表性结果如图所示 图5.
3. 采用 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 治疗糖尿病小鼠
3.1 小鼠糖尿病的诱导及 HDAd 载体注射
- STZ 溶液的制备：配制 0.1 M 柠檬酸缓冲液，并将 pH 调整至 4.3–4.5。使用 0.22 mm 注射器滤器过滤该缓冲液。用无菌水将其稀释至 0.01 M 柠檬酸钠溶液（pH 4.2–4.5）。在该溶液中溶解适量的 STZ（Sigma），使其终浓度为 12.5 mg/ml。在此浓度下无沉淀产生。将配制好的 STZ 溶液保存于 4 °C，待用。注射前立即将其温度恢复至室温。STZ 溶液需每日新鲜配制，并在溶解后 5–10 分钟内完成注射。
- 将上述 STZ 溶液通过腹腔注射给予（10 μl/g，以达到 125 μg/g 体重的剂量），注射时间选择在傍晚 5:00 至 7:00 之间（即小鼠饲养室灯光关闭前，小鼠即将开始活跃进食的时段），连续注射两天9。
3.2 监测小鼠血糖并注射 HDAd 载体。
- 禁食小鼠6小时，每周测量体重和血糖，直至小鼠出现高血糖（≥250 mg/dl）。通过尾部取血，使用One Touch血糖仪检测血糖。当血糖水平≥250 mg/dl时，在6小时禁食后48小时再次检测血糖，以确认持续性高血糖，并确保血糖处于治疗目标范围：250–500 mg/dl。
- 对具有持续性高血糖的小鼠，通过尾静脉单次静脉注射HDAd载体进行治疗。所有治疗组的总载体剂量均为6×1011 vp（溶于0.25 ml）：联合组为5×1011 vp Ngn3 + 1×1011 vp Btc；Ngn3组为5×1011 vp Ngn3 + 1×1011 vp；Btc组为1×1011 vp Btc + 5×1011 vp空载体；对照组为6×1011 vp空载体。
- 尾静脉注射。将小鼠放入Tailveiner固定器（TV-150, Braintree Scientific Inc.）中，用温水扩张尾静脉，以70%酒精清洁尾部。用一只手的拇指和食指在注射部位下方固定尾部，另一只手进行注射。注射前确保注射器内无气泡（使用301/2G针头和1 ml注射器）。插入针头后缓慢注射载体。若针头位于静脉内，针座处可见血液回闪，且注射时无明显阻力。注射完成后拔出针头，用纱布按压注射部位止血，随后将小鼠放回笼中。
若针头未进入静脉，则注射时阻力明显，并出现轻微皮下隆起。此时应立即拔出针头，并在另一部位重新尝试注射。
3.3 分析 HDAd-Ngn3 与 HDAd-Btc 联合治疗的效果。
- 在载体处理后，每周监测6小时禁食状态下的血糖水平和体重。
- 每2周从腿部的隐静脉或尾静脉采集血液，使用商用试剂盒检测胰岛素（小鼠胰岛素ELISA试剂盒，Mercodia）和肝酶（AST和ALT Infinity试剂，Thermo Scientific）。
- 将小鼠放入一个未加盖的50 ml Falcon管中，管的封闭端需预先打孔。
- 小鼠头部位于管的封闭端，四肢和尾巴从开口端伸出。若需从左腿采血，将左腿拉出管外，并用拇指和食指轻轻捏住大腿部位的皮肤以固定腿部。
- 使用剃毛器去除小腿/下肢区域的毛发，暴露位于下肢外侧的隐静脉。用70%酒精清洁剃毛区域，并待其自然干燥。
- 用25号针头穿刺隐静脉，用Microvette CB300管（Sarstedt）收集血液，并将采集管立即置于冰上。
- 采血后用纱布按压穿刺部位以止血，随后将小鼠放回笼中。
- 将血液样本在3,000 × g离心5分钟，取上清液并储存在-20 °C，用于后续分析。
3.4 在治疗后6周进行葡萄糖耐量试验（GTT）。
- 将D-葡萄糖（Sigma）溶于蒸馏水中，配制成15%葡萄糖溶液（15 g / 100 ml），并用无菌滤器过滤除菌。
- 禁食小鼠6小时。使用加热垫保温小鼠，并采集基线血样（0分钟时间点）。随后按1.5 g/kg剂量腹腔注射D-葡萄糖（每克体重注射10 μl的15%葡萄糖溶液）。
- 在注射后15、30、60和120分钟分别采集血液样本。
- 测定所有样本中的葡萄糖和胰岛素水平。
3.5 组织分析以评估载体的表达及胰岛新生的诱导情况。
在所有这些步骤中，为可靠解读结果所需的对照包括：（1）经空载体处理的糖尿病小鼠；（2）非糖尿病小鼠；以及（3）非糖尿病胰腺组织，作为胰岛特异性激素和转录因子表达的阳性对照。
- 在治疗后3周和6周时取肝脏和胰腺组织，各分为两份：一份立即置于液氮中速冻，并于-80 °C保存，用于RNA和蛋白质提取；另一份用10%福尔马林固定过夜，用于免疫组织化学分析。
- 采用标准方案提取RNA，并通过qRT-PCR结合特异性引物分析肝脏中胰岛特异性激素和转录因子的表达水平，同时检测Ngn3和Btc的表达以确认载体表达9, 10。
- 采用酸-乙醇提取法从肝脏中提取胰岛素和C肽，并使用商用ELISA试剂盒进行定量（超敏胰岛素检测试剂盒，Mercodia；C肽ELISA试剂盒，Wako）。
- 对石蜡包埋切片进行免疫染色，检测胰岛特异性激素（胰岛素、胰高血糖素、PP、SST）及胰岛特异性转录因子的表达9, 10。同时可通过免疫染色确认Ngn3和Btc的表达。
4. 代表性结果
我们将Ngn3和Btc的cDNA克隆至由普遍性启动子eIF2a（BOS）驱动的pΔ28载体中，构建了HDAd-Ngn3和HDAd-Btc。如图2所示，在第3代传代时，相对HV污染显著减少（表明载体扩增更多而辅助病毒扩增更少）。因此，我们采用P3代进行后续的载体生产。经过首次CsCl不连续梯度超速离心后，我们收集了最下方的载体条带，随后在第二次超速离心中收集对应于HDAd载体的乳光条带（图3）。通过qPCR检测，纯化后的HDAd载体中HV污染低于1%（图4A），且Southern印迹未检测到辅助病毒污染（图4B），表明其质量足以用于小鼠体内的载体输注。进一步分析包括通过感染116细胞检测目的基因表达。与未感染细胞相比，感染载体的细胞中Ngn3和Btc的mRNA表达水平高出10,000倍以上（图5）。
随后通过尾静脉注射将 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 施用于链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠，以注射空载体的糖尿病小鼠和注射 HDAd-Btc 的糖尿病小鼠作为阴性对照。在接受 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 联合治疗的小鼠中，高血糖得到逆转，葡萄糖刺激的胰岛素分泌也得以恢复；而在接受单基因载体或对照空载体治疗的小鼠中则未见此效应（图 6）。HDAd-Ngn3-Btc 治疗诱导了胰岛新生，通过检测总胰岛素和 C 肽含量对此进行了定量分析（图 6E），并以非糖尿病小鼠及接受空载体治疗的糖尿病小鼠作为对照。C 肽与胰岛素以等摩尔比例存在，证实了在肝脏中检测到的胰岛素确实在肝脏内合成。RT-qPCR 结果证实，接受 HDAd-Ngn3-Btc 治疗的小鼠肝脏表达了所有胰岛特异性激素和转录因子9。免疫组织化学结果显示，在接受 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 治疗的小鼠肝脏中存在胰岛素阳性细胞，而在接受对照载体治疗的小鼠肝脏中未观察到胰岛素阳性细胞（图 7）。我们还确认，与非糖尿病小鼠胰腺中大量存在的胰岛相比，Ngn3-Btc 治疗后的小鼠胰腺中无残余胰岛。同时通过肝脏免疫染色评估了载体（Ngn3 和 Btc）以及胰岛特异性谱系转录因子（Pdx-1 和 Nkx6.1）的表达情况（图 7）。
图1. 利用辅助依赖型病毒系统对糖尿病小鼠进行基因治疗的流程图。首先，将由普遍性BOS启动子驱动的表达盒中的Ngn3和Btc克隆至HDAd穿梭载体（pΔ28）中。HDAd的制备包括多个步骤：转染、连续传代扩增、大规模感染以及随后的载体纯化。在对HDAd进行质量表征后，通过尾静脉将HDAd经静脉注射至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内。通过检测血糖水平、体重、葡萄糖耐量试验（GTT）以及肝脏中基因表达的分析来评估治疗效果。
图2. HDAd载体扩增的测定。使用DNA提取试剂盒（Qiagen）从P0至P4代细胞中提取DNA。将DNA稀释1000倍后，取5μl用于实时定量PCR（qPCR）。使用辅助病毒和载体特异性引物。通过HDAd穿梭载体质粒和HV质粒的系列稀释液（10-5 至1 ng/ml）生成标准曲线（上图）。根据标准曲线及Ct值计算载体和辅助病毒的拷贝数，并将HDAd/HV的比值以总病毒量（辅助病毒+HDAd）的百分比形式绘图。因此，相对载体扩增率计算公式为：[载体拷贝数 /（载体拷贝数 + 辅助病毒拷贝数）]。如图所示（下图），HDAd载体扩增在P4代趋于平稳，而相对HDAd/HV比值在P3代仍在上升。因此，选择P3代进行后续步骤。
图3. 不连续CsCl密度超速离心后典型的HDAd载体条带。HDAd载体从3L旋转培养瓶培养物中提取，并经连续CsCl密度梯度纯化。（A）第一次密度梯度超速离心后，可见一条乳白色载体条带（箭头所示），位于不透明的细胞碎片（CD）下方。收集该乳白色条带（箭头所示）用于第二次密度梯度离心。（B）第二次密度梯度超速离心后，收集乳白色条带（箭头所示）进行透析。
图4. 辅助病毒污染分析。从50μl纯化病毒中提取DNA，并参照图2的方法评估辅助病毒污染情况。结果显示，HDAd-Ngn3和HDAd-Btc的辅助病毒污染率低于1%。
图 5. HDAd 载体结构的分析。 Southern 印迹按先前所述方法进行（Oka K，et al.）。泳道 1：辅助病毒的 DNA；泳道 2：P3 的 DNA；泳道 3：P4 的 DNA；泳道 4：纯化的载体。空心箭头表示来自辅助病毒的条带，实心箭头表示来自 HDAd 载体的 ITR 条带。
图 6. 感染 HDAd-Ngn3 或 HDAd-Btc 载体的 116 细胞中 Ngn3 或 Btc 的表达水平。将 116 细胞接种于 12 孔板中，用 HDAd-Ngn3、HDAd-Btc 或空载体以 1000 vp/细胞的感染复数感染 2 天。收集细胞后，使用 Trizol 试剂提取总 RNA。采用 Ngn3 或 Btc 特异性引物进行 qRT-PCR 检测。感染 HDAd-Ngn3 或 HDAd-Btc 的细胞中，Ngn3 或 Btc mRNA 的相对表达量增加了 10,000 倍以上。该图经 Elsevier 公司许可，重印自 Dev.Cell 2009 年 3 月；16(3):358-73；Yechoor 等。
图7. 将HDAd-Ngn3和HDAd-Btc基因导入链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠后，可逆转糖尿病并诱导肝脏中胰岛新生。（A）经HDAd-Ngn3和HDAd-Btc处理的STZ诱导糖尿病小鼠的血浆葡萄糖水平；（B）体重变化。（C）治疗后6周进行腹腔葡萄糖耐量试验（IP-GTT）期间的血浆葡萄糖和胰岛素水平。（D）治疗后12周肝脏中胰岛素染色的代表性图像。*p<0.05（与空载体组比较）。该图经Elsevier授权转载自Dev. Cell 2009年3月；16(3): 358-73；Yechoor et al.。
| 名称 | 上游引物 | 下游引物 | |
| helper | GACCATCAATCTTGACGACC | ATGTCGCTTTCCAGAACCC | |
| vector | TTGGGCGTAACCGAGTAAG | ACTTCCTACCCATAAGCTCC | |
| Ngn3 | AAGAGCGAGTTGGCACTCAG | TCTGAGTCAGTGCCCAGATG | |
| Btc | GCACAGGTACCACCCCTAGA | TGAACACCACCATGACCACT | |
表1. 引物序列。
讨论
为克服早期腺病毒（Ad）的缺陷并将其应用于基因治疗，研究人员开发了高容量腺病毒（HDAd）。然而，该技术仍面临一些挑战。例如，HDAd的包装需要辅助病毒（HV），且其载体扩增效率不如早期腺病毒。HV属于第一代腺病毒，任何HV污染都会影响HDAd的效果。因此，高效的转染以及每一轮连续传代的最佳条件至关重要。载体生产中的另一个关键参数是：应选择哪一轮传代（P1-P4）用于后续的第5轮传代，后者将直接作为悬浮细胞接种的接种物。根据我们的经验，最佳结果通常来自能使HDAd载体比例在下一轮传代中显著增加的传代轮次（如图2中的P3）。HDAd载体的产量依赖于转基因表达盒。在载体生产过程中，两个转基因均会表达，因为这两个基因均受组成型启动子驱动。Ngn3是一种转录因子，Btc是一种生长因子，这表明表达可能影响细胞谱系的转录因子的HDAd载体可能会抑制载体的扩增，而表达生长因子的载体则有助于载体的复制与包装。
随着糖尿病呈流行态势，亟需开发新的方法以恢复β细胞质量。在本报告中，我们描述了利用HDAd载体的优势，将胰岛谱系决定性转录因子Ngn3与胰岛生长因子betacellulin进行基因转移，从而诱导肝脏门静脉区域发生胰岛新生的方法。为评估该方法的有效性，必须选择血糖水平稳定的高血糖小鼠，并始终设置适当的对照组。在这些基因转移实验中，应始终使用空载体处理的糖尿病小鼠作为对照。此外，分别使用HDAd-Ngn3和HDAd-Btc处理的糖尿病小鼠，可用于检验这两个基因在胰岛新生过程中的独立作用。我们的数据表明，仅Ngn3即可足以诱导胰岛新生，而添加生长因子Btc可增强该反应，从而显著促进胰岛新生。此外，还需验证载体确实在靶组织（肝脏）中实现了表达，并通过证实糖尿病小鼠体内胰腺中不存在残余胰岛，来确认治疗后小鼠血浆中检测到的胰岛素并非来源于胰腺中的残余胰岛。
总之，HDAd 载体系统在基因转移中的优势在于其高容量的克隆能力、在肝脏中高效的转导效率以及持久的基因表达，同时具有最低的慢性毒性，并且其载体基因组不会整合到宿主染色体中。主要局限性在于其制备过程较为复杂，且其体内应用目前主要局限于肝脏，最常用的腺病毒血清型为5型。通过将胰岛谱系决定性转录因子 Ngn3 与胰岛生长因子 betacellulin 进行基因转移，在肝脏中诱导胰岛新生，可完全恢复糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平和葡萄糖耐受性。在本报告中，我们展示了制备高质量 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 的最佳方案，并演示了在糖尿病小鼠肝脏中诱导和评估胰岛新生以逆转高血糖的技术方法。
脚注：本文所述的病毒载体和细胞系可从贝勒医学院糖尿病研究中心的载体生产核心实验室获取http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731）。一些商业试剂盒也可用于生成HDAd病毒（例如 Microbix Biosystems Inc.
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）R03 DK089061-01（VKY）；NIH K08 DK068391（VKY）；贝勒医学院糖尿病与内分泌研究中心（DERC - P30DK079638）以及来自该中心的试点与可行性项目资助（DERC，VKY）；青少年糖尿病研究基金会：JDRF 奖项 # 5-2006-134（VKY）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ProFectionR 哺乳动物转染试剂盒 | 普洛麦格 | E1200 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒（50） | Qiagen | 69504 | |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix，ROX | Quanta Biosciences | 95055-500 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | D6750-25G | |
| MEM粉末 | Invitrogen | 61100087 | |
| 青霉素 链霉素 | Sigma | 15140122 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-081 | |
| 潮霉素B | Sigma | H0654-1G | |
| MEM EAGLE JOKLIK | Sigma | M0518-10L | |
| Rnase | 罗氏 | 10109169001 | |
| DNase I，II型 | 罗氏 | 10104159001 | |
| 链脲佐菌素 | Sigma | s0130 | |
| 玻璃旋转烧瓶 | 康宁 | 4500-3L | |
| 玻璃旋转烧瓶 | 康宁 | 4500-250 | |
| Slide A-lyzer 装置 | PIERCE CH | PI66380 | |
| 聚烯烃塑料离心管，11.2 ml | Beckman Coulter | 362181 | |
| 氯化铯 1 kg | JT4042-2 | VWR | |
| Beckman LE-80K | Beckman Coulter | Optimal LE-80K 超速离心机 | |
| 筛选 | VWR | 28143-338 | |
| 500 ml 离心管 | 康宁 | 431123 | |
| 尾静脉固定器 | 布雷因特里科学公司 | tv-150 | |
| 胰岛素，小鼠 ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 微采血管 CB300 | Sarstedt | 16.443.100 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 小鼠C肽ELISA试剂盒 | 和光纯药工业株式会社 | #631-07231 | |
| 豚鼠抗胰岛素抗体 | Abcam | ab7842 | |
| 山羊抗Pdx1抗体 | Christopher Wright博士惠赠 | ||
| 小鼠抗 Ngn3 抗体 | β细胞生物学联盟， 宾夕法尼亚大学 | AB2013 | |
| 小鼠抗 Nkx6.1 抗体 | β细胞生物学联盟 宾夕法尼亚大学 | F64A6B4 | |
| 抗Betacellulin抗体 | 细胞科学 | 1型糖尿病是由T细胞介导的针对胰腺中胰岛素生成细胞的自身免疫性破坏所致。目前，胰岛素替代治疗仍是主要疗法，因为胰岛移植受到供体来源有限以及需要长期免疫抑制的限制。通过基因转移技术导入Neurogenin3（Ngn3，即决定胰岛细胞谱系的特异性转录因子）和Betacellulin（Btc，一种胰岛生长因子），可诱导胰岛新生，有望治愈1型糖尿病。腺病毒载体（Ads）是一种高效的基因转移载体，但早期代次的Ads在体内应用中存在多种缺陷。辅助依赖型腺病毒载体（HDAds）是最新一代的Ads，其设计旨在改善早期Ads的安全性并延长外源基因的表达时间1。由于HDAds不含病毒编码序列2-5，仅保留了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件，因此不具有慢性毒性，并可容纳长达36 kb的基因片段。在本实验方案中，我们描述了构建HDAd-Ngn3和HDAd-Btc载体并将其递送至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的方法。实验结果表明，联合注射HDAd-Ngn3和HDAd-Btc可在肝脏中诱导形成“新生胰岛”，并逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。 | |
| ALT（SGPT）显色试剂盒 | Teco Diagnostics | A526 - 120 | |
| AST/（SGOT），比色终点试剂盒 | Teco Diagnostics | A561-120 | |
表2. 特异性试剂与仪器 |
参考文献
- Parks, R. J. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).
- Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
- Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
- Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
- Nomura, S. Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).
- Ng, P. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).
- Oka, K., Chan, L. Helper-Dependent Adenoviral Vectors. Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).
- Yechoor, V. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).
- Yechoor, V. Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice. Endocrinology. , (2009).
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