本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially available（商业可获取）。
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本文内容
摘要
摘要
尽管大脑的质量不足人体总质量的5%，但在静息状态下，其消耗的葡萄糖约占全身消耗总量的四分之一1。非快速眼动睡眠（NREMS）是睡眠中所占时间最长的阶段，其功能尚不明确。然而，NREMS的一个显著特征是大脑葡萄糖利用率相较于清醒状态显著降低2-4。这一现象及其他研究结果促使人们普遍认为，睡眠具有与大脑代谢相关的重要功能。然而，NREMS期间大脑葡萄糖代谢率下降的潜在机制仍有待阐明。
与非快速眼动睡眠（NREMS）相关的一个可能影响脑代谢率的现象是慢波的出现，即脑电图中频率低于4 Hz的振荡5,6。在颅骨或大脑皮层表面检测到的这些慢波反映了底层神经元在去极化/上状态与超极化/下状态之间的振荡7。在下状态期间，细胞在长达数百毫秒的时间内不产生动作电位。动作电位之后离子浓度梯度的恢复对细胞构成了显著的代谢负担8；与NREMS相关的下状态期间动作电位的缺失可能有助于相对于清醒状态降低代谢水平。
为了验证这一假设关系，必须解决两个技术难题。首先，需要以能够反映脑电图（EEG）动态变化的时间分辨率（即以秒为单位，而非分钟）来测量大脑糖酵解代谢。为此，我们检测了乳酸浓度，乳酸是需氧糖酵解的产物，因此可作为小鼠脑组织中葡萄糖代谢速率的指标。乳酸的测量采用基于乳酸氧化酶的实时传感器，该传感器嵌入于前额叶皮层。传感器的检测机制由一根铂-铱电极构成，其周围包裹着一层乳酸氧化酶分子。乳酸在乳酸氧化酶的作用下代谢生成过氧化氢，后者在铂-铱电极上产生电流。因此，当脑部糖酵解增强时，乳酸氧化酶的底物浓度随之升高，从而导致检测电极上的电流增加。此外，还需要在调控大脑皮层兴奋性的条件下同步测量这些变量，以便将该变量从非快速眼动睡眠（NREMS）的其他方面中分离出来。
我们设计了一种实验系统，可同时通过脑电图测量神经元活动，通过乳酸生物传感器测量糖酵解通量，并通过光遗传学激活锥体神经元来调控大脑皮层神经元活动。我们已利用该系统记录了与睡眠相关的脑电图波形与大脑皮层乳酸浓度瞬时动态之间的关系。该方案可能对任何希望在自由活动的啮齿类动物中研究脑电图水平测得的神经元活动与脑内细胞能量代谢之间关系的研究人员具有参考价值。
方案
1. 动物的手术准备
1. 实验对象
使用B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J转基因品系小鼠9（JAX品系#7612）或其他在大脑皮层神经元中表达对蓝光敏感的阳离子通道——光敏通道蛋白-2（Channelrhodopsin-2）的小鼠。对B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J转基因品系小鼠的大脑皮层施加蓝光，可导致表达光敏通道蛋白-2的锥体神经元去极化并产生动作电位9,10。由于锥体细胞被激活，局部中间神经元也随之激活，电位变化可传播至刺激部位以外的神经元10。手术应在无菌条件下进行，并遵守适用的监管指南：手术器械和软包装材料（手术巾、纱布垫）需经高压灭菌；所有耐热的植入金属器件（套管、螺钉和导线）需用高温灭菌珠处理30秒；对不耐热的可植入器件（光纤电缆、塑料连接器）用乙醇浸泡消毒10秒；使用罐装空气吹干经乙醇浸泡的物品。
2. 麻醉、立体定位放置与颅骨清除
使用 IMPAC6 集成式多动物麻醉系统（Vet Equip Inc）对小鼠进行麻醉。诱导时使用 5% 异氟烷/95% 氧气，术中维持使用 3% 异氟烷/97% 氧气。将动物置于设定为 37 °C 的循环水毯上。若水毯温度保持在此设....
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结果
如图所示 图2, 一只配备光遗传学刺激及乳酸/脑电图（EEG）/肌电图（EMG）数据采集装置的小鼠在持续监测脑电图、肌电图和脑内乳酸浓度的同时，经历了自发的睡眠-觉醒状态转换。乳酸传感器电流在低幅脑电图期间升高，在高幅脑电图期间下降。如图所示 图3脑电图的两个通道均对前额叶皮层施加的光遗传学刺激有反应。
图1. A) 脑电图（EEG）电极、乳酸传感器及用于光遗传学刺激的套管在手术植入后的示意图。B) 整个实验系统的示意图。1，脑电图导联1；2，脑电图导联2；Gnd，脑电图接地螺钉；Ref，脑电图参考螺钉。
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讨论
本文介绍的方法使得人们能够在前所未有的时间尺度上测量睡眠与脑内糖酵解中间产物乳酸浓度变化之间的关系。动物会自发地在清醒、非快速眼动睡眠（NREMS）和快速眼动睡眠（REMS）之间转换。此外，我们能够在动物发生这些状态转换时施加光遗传学刺激。迄今为止收集的数据表明，无论是自发的还是诱导产生的脑状态波动，均会影响基于乳酸氧化酶的生物传感器的检测信号。
可以使用其他来源的设备和软件构建类似于本文所述的实验系统。适用于啮齿类动物的多导睡眠图系统的其他来源包括 Data Sciences International11 和 Embla12。用于睡眠状态分类的软件可从 Somnologica12、Sleep Sign13 和 Icelus14 获得。用于乳酸检测的安培型生物传感器可从 Quanteon15 获得。据我们所知，Pinnacle Technology 是唯一提供可通过单一软件界面同时测量生物传感器、脑电图（EEG）和肌电图（EMG）系统的厂商。
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致谢
本研究由美国国防部（国防高级研究计划局青年教员奖，资助号 N66001-09-1-2117）和美国国家神经疾病与卒中研究所（R15NS070734）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BASi 小鼠导向套管 | Pinnacle Technology/BASi 公司 | 7032 | |
| 乳酸生物传感器 | Pinnacle Technology | 7004 | |
| 头部固定装置 | Pinnacle Technology | 8402 | |
| 睡眠/生物传感器记录系统 | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2个脑电图通道，1个肌电图通道 &和 1 个生物传感器 |
| 小鼠离体固定校准试剂盒 | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| 光纤导管套管 | Plastics One | C312G | 21 号导引套管针 |
| 假导管 | Plastics One | C312DC | 21 号假针 |
| 金刚石光纤刻划笔 | Thorlabs | S90W | |
| 光纤连接器压接工具 | Thorlabs | CT042 | |
| 分叉导管 | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | 最大直径 0.012 | |
| 分叉管剥离器 | Thorlabs | FTS3 | |
| 裸露硬包层多模光纤 | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm 核心，0.37 数值孔径 |
| 剪线钳/凯夫拉剪 | Thorlabs | T865 | |
| 光纤环氧树脂 | Thorlabs | F112 | |
| 光纤剥线工具 | Thorlabs | ||
| 玻璃抛光板 | Thorlabs | CTG913 | |
| 橡胶抛光垫 | Thorlabs | NRS913 | |
| 眼用放大镜 | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| 压缩空气 | Thorlabs | CA3 | |
| 抛光夹具 | Thorlabs | D50-xx | |
| 光纤检测显微镜 | Thorlabs | CL-200 | |
| 抛光薄膜 | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC连接器端面 | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore，不锈钢卡套 |
| MC 刺激单元 | 多通道系统 | STG-4002 | |
| MC 刺激软件 | 多通道系统 | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| 蓝光激光器 | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| 激光电源 | CrystaLaser | CL2005 | |
| 光纤旋转接头 | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| <强>表2. 耗材与设备。 |
参考文献
- Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in ma....
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重印与许可
