Drosophila 幼虫的趋性关联性嗅觉学习

摘要

Drosophila 幼虫能够将气味刺激与味觉奖励相关联。本文介绍了一种简单的行为范式，可用于分析趋味性联想嗅觉学习。

摘要

下文我们将介绍食欲性关联嗅觉学习的方法学细节 果蝇 幼虫。该装置结合遗传干扰技术，可用来分析特定神经元和分子基础 关联的 在简单的幼虫大脑中学习。

生物体可利用过去的经验来调整当前的行为。这种行为潜能的获得可被定义为学习，而这些潜能的物质基础则被称为记忆痕迹^1-4。神经科学家试图通过从无脊椎动物到脊椎动物等多种模式生物，运用各种方法来理解这些过程在大脑中如何以分子和神经元变化的形式组织起来^5,6。在这些研究中，采用结构简单且实验上易于操作的模型系统将大有帮助。Drosophila 幼虫因其具备可靠的行為检测方法、多种转基因技术以及仅包含约10,000个神经元的简单神经系统结构，已被证实符合这些要求（尽管存在一些局限性：认知能力有限、行为选择较少，且经验的丰富性尚存疑问）^7-10。

Drosophila 幼虫能够形成气味与食欲性味觉强化物（如糖）之间的关联^11-14。在由 B. Gerber 实验室建立的标准实验中，动物接受双气味互逆训练：第一组幼虫首先在气味 A 出现时接受味觉强化（糖奖励），随后在无强化条件下暴露于气味 B⁹；与此同时，第二组幼虫则接受互逆训练，即先在无强化条件下暴露于气味 A，随后在气味 B 出现时接受强化（糖奖励）。随后，测试两组幼虫对两种气味的偏好。对获得奖励的气味表现出相对更高的偏好反映了关联学习能力，结果以行为表现指数（PI）表示。该表现指数具有关联性本质的结论具有说服力，因为除了气味与味觉刺激之间的偶联关系外，其他参数（如气味和奖励的暴露、时间推移及操作处理）在两组之间均无差异⁹。

方案

1. 准备

1. 果蝇 野生型幼虫在25 °C、60%-80%湿度、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养。为精确控制幼虫的发育时间，每次将20只雌蝇与10只雄蝇放入一个含有约6 ml标准果蝇培养基的试管（高6 cm，直径2.5 cm）中。让果蝇产卵12小时，第二天将其转移至新的试管。产卵后5-6天，幼虫进入摄食第三龄^rd 若在25 °C条件下培养，幼虫已达到三龄阶段，现可用于行为学实验。但需注意仅选取仍位于食物内部的幼虫，避免选取位于瓶壁侧边的幼虫，后者已进入“游走”阶段。^rd 龄期阶段”——化蛹前不久——其使用使结果的解释变得复杂。
2. 2.5% 琼脂糖培养皿的制备（其他实验室在实验全程也使用1%的琼脂浓度，但较低浓度可能允许摄食3^rd 将2.5 g琼脂糖溶于100 ml ddH₂O中（以促进三龄幼虫钻入培养基）：₂O. 将溶液放入微波炉中加热至开始沸腾。小心摇动溶液，然后再次放回微波炉中，直至所有琼脂糖完全溶解。将热的琼脂糖溶液倒入培养皿中，使培养皿底部完全被覆盖，并形成光滑的表面。让溶液冷却至室温，然后盖上盖子。不要立即盖上盖子，以免盖子内表面产生冷凝水。
3. 2 M 果糖培养皿的制备：将 2.5 g 琼脂糖溶解于 100 ml ddH₂O 中₂O（同样，可使用1%的琼脂浓度；但可能会允许摄食3^rd 幼虫龄期在基质中挖掘）。将....

结果

图1A展示了幼虫嗅觉关联学习实验流程的概览。通过将两种呈现的气味之一与糖奖励配对，幼虫会形成对 rewarded 气味产生趋向性反应的行为潜能，相较于未被奖励的气味。始终使用两组幼虫进行训练，分别将强化物与气味 OCT 或 AM 配对。表现指数（PI）通过两组互为对照的训练组之间的偏好差异来衡量关联功能。

如果在转基因幼虫中分析其关联功能，则需要进行基本感觉-运动能力的测试。该测试通过让幼虫在装有气味物质的容器与空气之间，或在纯琼脂糖与含糖琼脂糖之间进行选择来完成。（此处未展示假训练过程）。幼虫的最终分布记录在特定的数据表中（图2），并以箱形图形式展示（图3）。阳性结果表示偏好指数反映出趋向性选择行为，而表现指数则表明具有趋近性学习能力；负值则表明计算出的偏好指数反映为回避性选择行为，而表现指数则表明具有回避性学习能力。

讨论

Drosophila 幼虫中的所述实验装置可用于在相对简单的脑结构中研究联想性嗅觉学习。该方法简便、经济，易于在实验室中建立，且无需高端仪器设备⁹。本文介绍了一种利用果糖作为奖赏刺激来研究趋利性联想学习的实验版本¹¹。所述实验方案基于一系列参数化研究，系统地考察了训练试验次数、单个检测与群体检测、记忆保持时间、所用气味及其浓度以及性别等因素的影响^9,15,34,35。因此，该行为学实验装置整合了上述信息，形成了一种高度可重复的研究 Drosophila 高级脑功能的方法。最终，由于其装置简单，任何可溶性物质的奖赏或惩罚效应均可通过此检测方法轻松验证。

此外，最近已发表该范式的多种变体，可用于研究幼虫中的联想性视觉学习^23,36（由 Gerber et al. (2004) 建立）；电击、光、热、奎宁或振动也已成功用作联想性嗅觉学习中的厌恶性强化刺激^{9,17,19-21,37-40}。因此，目前已建立了一整套完善的实验体系，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果糖	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
琼脂糖	Sigma	A5093	9012-36-6
1-辛醇	Sigma	12012	111-87-5
乙酸戊酯	Sigma	46022	628-63-7
石蜡油	Sigma	18512	8012-95-1