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方法文章

Drosophila 幼虫的趋性关联性嗅觉学习

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DOI：

10.3791/4334

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2013年2月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Konstanz, 2Department of Biology, University of Fribourg

本文内容

摘要

Drosophila 幼虫能够将气味刺激与味觉奖励相关联。本文介绍了一种简单的行为范式，可用于分析趋味性联想嗅觉学习。

摘要

下文我们将介绍食欲性关联嗅觉学习的方法学细节 果蝇 幼虫。该装置结合遗传干扰技术，可用来分析特定神经元和分子基础 关联的 在简单的幼虫大脑中学习。

生物体可利用过去的经验来调整当前的行为。这种行为潜能的获得可被定义为学习，而这些潜能的物质基础则被称为记忆痕迹1-4。神经科学家试图通过从无脊椎动物到脊椎动物等多种模式生物，运用各种方法来理解这些过程在大脑中如何以分子和神经元变化的形式组织起来5,6。在这些研究中，采用结构简单且实验上易于操作的模型系统将大有帮助。Drosophila 幼虫因其具备可靠的行為检测方法、多种转基因技术以及仅包含约10,000个神经元的简单神经系统结构，已被证实符合这些要求（尽管存在一些局限性：认知能力有限、行为选择较少，且经验的丰富性尚存疑问）7-10。

Drosophila 幼虫能够形成气味与食欲性味觉强化物（如糖）之间的关联11-14。在由 B. Gerber 实验室建立的标准实验中，动物接受双气味互逆训练：第一组幼虫首先在气味 A 出现时接受味觉强化（糖奖励），随后在无强化条件下暴露于气味 B9；与此同时，第二组幼虫则接受互逆训练，即先在无强化条件下暴露于气味 A，随后在气味 B 出现时接受强化（糖奖励）。随后，测试两组幼虫对两种气味的偏好。对获得奖励的气味表现出相对更高的偏好反映了关联学习能力，结果以行为表现指数（PI）表示。该表现指数具有关联性本质的结论具有说服力，因为除了气味与味觉刺激之间的偶联关系外，其他参数（如气味和奖励的暴露、时间推移及操作处理）在两组之间均无差异9。

方案

1. 准备

  1. 果蝇 野生型幼虫在25 °C、60%-80%湿度、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养。为精确控制幼虫的发育时间，每次将20只雌蝇与10只雄蝇放入一个含有约6 ml标准果蝇培养基的试管（高6 cm，直径2.5 cm）中。让果蝇产卵12小时，第二天将其转移至新的试管。产卵后5-6天，幼虫进入摄食第三龄rd 若在25 °C条件下培养，幼虫已达到三龄阶段，现可用于行为学实验。但需注意仅选取仍位于食物内部的幼虫，避免选取位于瓶壁侧边的幼虫，后者已进入“游走”阶段。rd 龄期阶段”——化蛹前不久——其使用使结果的解释变得复杂。
  2. 2.5% 琼脂糖培养皿的制备（其他实验室在实验全程也使用1%的琼脂浓度，但较低浓度可能允许摄食3rd 将2.5 g琼脂糖溶于100 ml ddH₂O中（以促进三龄幼虫钻入培养基）：2O. 将溶液放入微波炉中加热至开始沸腾。小心摇动溶液，然后再次放回微波炉中，直至所有琼脂糖完全溶解。将热的琼脂糖溶液倒入培养皿中，使培养皿底部完全被覆盖，并形成光滑的表面。让溶液冷却至室温，然后盖上盖子。不要立即盖上盖子，以免盖子内表面产生冷凝水。
  3. 2 M 果糖培养皿的制备：将 2.5 g 琼脂糖溶解于 100 ml ddH₂O 中2O（同样，可使用1%的琼脂浓度；但可能会允许摄食3rd 幼虫龄期在基质中挖掘）。将溶液放入微波炉中加热至开始沸腾。小心摇动溶液后再次放回微波炉，直至所有琼脂糖完全溶解。将35 g果糖小心加入热溶液中；缓慢搅拌混合物，直至糖完全溶解，以避免延缓沸腾。将热的果糖-琼脂糖溶液倒入培养皿中，使底部完全覆盖，并形成光滑表面。让溶液冷却至室温后再盖上皿盖。切勿立即盖上皿盖，否则会导致皿盖上产生冷凝水。
  4. 制备1-辛醇（OCT）气味容器：将10 μl纯OCT注入定制的聚四氟乙烯（Teflon）气味容器中，并用带有多个小孔的盖子密封，以允许气味挥发。该容器的详细描述见Gerber和Stocker 2007。为OCT准备三个气味容器。气味容器可使注入的化学物质挥发，同时避免幼虫直接接触。因此，本实验专门研究幼虫的嗅觉学习，而不受味觉干扰因素的影响。
  5. 乙酸异戊酯（AM）气味容器的制备：将乙酸异戊酯用石蜡油按1:50比例稀释。取10 μl稀释液注入定制的聚四氟乙烯（Teflon）气味容器中，并用带有多个小孔的盖子密封，以允许气味挥发。为AM制备三个气味容器。该稀释步骤出于实际考虑，旨在避免动物对其中一种气味产生过强偏好，从而掩盖两种气味间相对偏好的学习依赖性变化。两种气味吸引力相等这一前提，需在实验前使用后文所述测试方法（2.5）在未经训练的动物中加以验证。此处提供的参数基于Gerber实验室多项已发表研究，并已由本实验室近期成功重复。9,15,16.
  6. 培养皿标记：在行为实验开始前，所有培养皿均需编码。这意味着含有果糖的培养皿需标记为“X”或“A”，仅含琼脂糖的培养皿则标记为“Y”或“B”。该编码应于所有数据记录完成后才向实验者公开。通过“盲法”进行实验，可避免实验者的预期影响幼虫的行为表现。为便于广大读者理解，在下文中我们将仅以条件刺激（CS1或CS2）来指代气味，其中在果糖培养皿（+）上呈现的气味为有奖赏的刺激，而在仅含琼脂糖的培养皿（-）上呈现的气味为无奖赏的刺激。

2. 糖奖励训练与测试

  1. 收集30只摄食的3rd 从食物瓶中取出龄期幼虫，转移至第一个含有数滴自来水的培养皿中，用毛笔轻轻将其前后移动。再将其转移至第二个同样含有数滴自来水的培养皿中，检查幼虫体壁是否残留食物糊状物；否则幼虫在实验过程中可能接触到食物气味，这很可能干扰学习过程及测试阶段的表现。
  2. 训练：为了训练幼虫将气味与具有吸引力的糖刺激相关联，采用以下方案。将一个OCT气味容器置于左侧 和 标记为“X”的右侧——因此，含有果糖奖励（+）的培养皿（“盲法”实验，详情见1.6）。将30只正在取食的果蝇群体放入rd 将龄期幼虫置于培养皿中央，盖上皿盖，静置5分钟，使动物暴露于OCT中。确保幼虫未被困在水滴内部，并能克服水滴的表面张力，从而可在培养皿内自由活动，接受嗅觉和/或味觉刺激。
  3. 训练：用湿润的刷子将幼虫从培养皿中移出，转移至另一个标记为“Y”的培养皿上，该培养皿含有仅含琼脂糖（-），并在其左侧放置有AM气味容器 和 右侧。盖上盖子，等待5分钟，期间让动物暴露于AM中。
  4. 训练：重复步骤2.2和2.3两次，使全部30条幼虫均经历三个训练周期：CS1 / (+) - CS2 / (-)；CS1 / (+) - CS2 / (-)；CS1 / (+) - CS2 / (-)。本实验中，CS1代表OCT，CS2代表AM。
  5. 测试：将一个AM和一个OCT气味容器分别放置在仅含琼脂糖的培养皿相对两侧。将训练后的幼虫转移至测试培养皿中央，盖上皿盖，静置5分钟。随后，统计测试培养皿左侧、中央和右侧的幼虫数量。
  6. 重复步骤 2.1）至 2.5），使用第二组 30 只摄食的 3rd 二龄幼虫，但交换AM与OCT的实验角色，使动物接受以下训练：CS2 / (+) - CS1 / (-)；CS2 / (+) - CS1 / (-)；CS2 / (+) - CS1 / (-)。本实验中，CS1代表OCT，CS2代表AM。
  7. 训练的可能安排。上文展示了一种训练方式，包含三次训练试验，分别为 OCT / (+) - AM / (-)，或在相对组中进行同样三次训练试验 AM / (+) - OCT / (-)。然而，为了避免训练过程中出现序列依赖效应，在重复进行完整实验时，必须对刺激序列进行变化。通过改变CS1或CS2的呈现顺序，以及在首次或第二次呈现的培养皿中奖励的分布方式，训练试验可形成四种不同的序列：
第一组CS1 / (+) - CS2 / (-)互易组CS2 / (+) - CS1 / (-)
 CS1 / (-) - CS2 / (+) CS2 / (-) - CS1 / (+)
 CS2 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-)
 CS2 / (-) - CS1 / (+) CS1 / (-) - CS2 / (+)

为避免周围实验环境中刺激产生系统性影响，应将一半实验案例设置为左侧呈现OCT、右侧呈现AM；另一半实验案例则设置为左侧呈现AM、右侧呈现OCT。

3. 与任务相关的感知运动能力测试

上述实验设计可用于单独分析野生型取食的3rd龄幼虫的气味-糖学习能力。然而，在日常实验工作中，研究人员通常使用两种或更多不同实验组的幼虫进行比较，以检测嗅觉学习是否依赖于特定基因、特定神经元群、突变品系、特殊食物配方、不同的饲养条件，或在发育期间添加的有毒化学物质等。因此，在测试两个或更多幼虫实验组的所有情况下，必须进行一系列必要的对照实验，以检验不同幼虫组是否具有正常的感官-运动感知能力。这一要求至关重要，因为潜在的表型并不一定源于对气味与糖关联能力的降低或丧失。相反，潜在的学习缺陷可能源于气味和/或糖处理过程中感官-运动通路中任意环节的功能障碍。换句话说，如果一个突变型幼虫无法感知糖，则它无法形成糖的记忆，但这并不能据此推断该幼虫不具备学习能力。具体而言，必须进行以下对照实验，以检测转基因幼虫在OCT、AM以及果糖处理方面是否正常。

1. 测试幼稚型 OCT 偏好

从一个培养瓶中收集30只取食期的3rd龄幼虫。按照2.1节所述方法用自来水小心清洗。将一个含有OCT气味的容器置于琼脂糖培养皿的一侧，将幼虫放置在培养皿中央，盖上皿盖，静置5分钟，使幼虫可在培养皿内爬行并趋向OCT气味源。随后，统计位于测试培养皿左侧、中央和右侧的幼虫数量。

2. 检测初始态AM的偏好性

从一个培养瓶中收集30只取食期的3rd 龄幼虫。按照2.1节所述方法用自来水小心清洗。将一个AM气味容器放置在琼脂糖培养皿的一侧，将幼虫放置于培养皿中央，盖上皿盖，静置5分钟，使幼虫可在培养皿内爬行并朝向AM气味源定向移动。随后，统计位于测试培养皿左侧、中央和右侧的幼虫数量。

3. 测试天然糖偏好

从一个培养瓶中收集30只取食期的3rd龄幼虫。按照2.1节所述，用自来水小心清洗幼虫。准备一个培养皿，其中一半含有2.5%琼脂糖，另一半含有2 M果糖-琼脂糖混合物。将幼虫放入培养皿中，盖上盖子，静置5分钟，使幼虫可在培养皿内爬行并趋向含果糖的一侧。随后，统计位于测试培养皿左侧、中间和右侧的幼虫数量。

半半培养皿的制备：按照上文1.2节所述方法制备普通琼脂糖平板。当琼脂糖填充的培养皿冷却后，用解剖刀沿垂直轴小心地将琼脂糖切开。移除培养皿中一半的琼脂糖。向培养皿空的一半加入热的果糖-琼脂糖溶液（制备方法见1.3节）。注意使两半琼脂糖紧密贴合，避免形成明显的边缘——这会影响幼虫的选择行为，导致行为分析变得相当困难。4

假训练

尽管已测试转基因的3rd龄幼虫是否能在野生型水平上区分OCT与空气（3.1）、AM与空气（3.2）以及糖与纯琼脂糖（3.3），但最近又引入了一组额外的对照实验（讨论见Gerber和Stocker，2007）。这些实验的设计依据如下：在训练过程中，幼虫会经历大量操作处理以及连续的气味和糖刺激。因此，所观察到的学习表型可能存在误导性（尽管未经训练的幼虫在气味和糖感知测试中表现处于野生型水平！）。事实上，转基因动物可能在抗应激能力、动机、疲劳、感觉适应、情境学习以及饱腹状态变化等方面与野生型幼虫存在差异。因此，Michels et al.（2005）引入了以下对照实验，以检验特定突变体是否能够：（1）在对幼虫进行与训练完全相同的操作处理（仅不给予奖励，并仅暴露于两种气味）的情况下，区分AM与空气味容器；（2）在相同处理条件下检测OCT；（3）在模拟训练方式处理幼虫时（仅不提供气味刺激，而仅给予奖励）区分AM与空气味容器；（4）在相同处理流程下检测OCT。有关方法的全面讨论和更多细节，请参见Michels et al.（2005）和Gerber与Stocker（2007）。

4. 糖奖励学习的数据分析

  1. 为了评估糖奖励学习实验数据，需为两组相互对照训练的实验组分别计算 OCT 偏好指数（PREF OCT）：
    对于接受 OCT/(+) - AM/(-) 训练的第一组：
    PREF OCT (OCT+/AM-) = （位于 OCT 侧的幼虫数量 - 位于 AM 侧的幼虫数量）/ 左侧、右侧及中间区域中所有幼虫的总数
    对于接受 AM/(+) - OCT/(-) 训练的第二组：
    PREF AM (AM+/OCT-) = （位于 AM 侧的幼虫数量 - 位于 OCT 侧的幼虫数量）/ 左侧、右侧及中间区域中所有幼虫的总数
  1. 根据4.1)中得到的两个PREF值计算性能指数（PI）。该PI通过消除气味和惩罚刺激、时间推移及操作处理等干扰因素的影响，反映个体的关联学习能力：
    PI = (PREF OCT (OCT+/AM) + PREF AM (AM+/OCT)) / 2
    因此，PI的取值范围为-1到1。显著负值表示厌恶学习，而显著正值表示趋近学习。一个完整的实验通常包含10个或更多的PI值。数据以箱形图形式展示，包含给定实验组的所有数值；其中50%的数值位于箱体范围内，中位性能指数以箱形图内的一条粗线表示。

5. 与任务相关的感知-运动功能的数据分析

  1. 在检测OCT气味处理是否正常时，通过以下方式计算OCT气味偏好指数：
    Odor PREF OCT = （位于OCT侧的幼虫数 - 位于另一侧的幼虫数）/ 左、右及中间区域内的所有幼虫总数
  2. 在检测AM气味感知是否正常时，通过以下方式计算AM气味偏好指数：
    Odor PREF AM = （位于AM侧的幼虫数 - 位于另一侧的幼虫数）/ 左、右及中间区域内的所有幼虫总数
  3. 在检测果糖感知是否正常时，通过以下方式计算果糖偏好指数：
    PREF fructose = （位于果糖侧的幼虫数 - 位于另一侧的幼虫数）/ 左、右及中间区域内的所有幼虫总数
  4. 假训练的详细步骤见Michels et al. 2005年发表的研究。

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结果

图1A展示了幼虫嗅觉关联学习实验流程的概览。通过将两种呈现的气味之一与糖奖励配对，幼虫会获得对 rewarded 气味产生趋向性反应的行为潜能，相较于未奖励的气味。始终使用两组幼虫进行训练，分别将强化物与气味 OCT 或 AM 配对。表现指数（PI）通过两组互为对照的训练组之间的偏好差异来衡量关联功能。

如果在转基因幼虫中分析其关联功能，则需要进行基本感觉运动能力的测试。这可以通过让幼虫在装有气味物质的容器与空气之间，或在纯琼脂糖与含糖琼脂糖之间进行选择来实现。（此处未展示假训练过程）。幼虫的最终分布记录在特定的数据表中（图2），并以箱线图形式可视化（图3）。阳性结果表示偏好指数反映出趋向性选择行为，而表现指数则表明具有趋近性学习能力；负值则表明计算出的偏好指数反映回避性选择行为，而表现指数表明具有回避性学习能力。

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讨论

Drosophila 幼虫中的所述实验装置可用于在相对简单的脑结构中研究联想性嗅觉学习。该方法简便、经济，易于在实验室中建立，且无需高端仪器设备9。本文介绍了一种利用果糖作为奖赏刺激来研究趋利性联想学习的实验版本11。所述实验方案基于一系列参数化研究，系统地考察了训练试验次数、单个检测与群体检测、记忆保持时间、所用气味及其浓度以及性别等因素的影响9,15,34,35。因此，该行为学实验装置整合了上述信息，形成了一种高度可重复的研究 Drosophila 高级脑功能的方法。最终，由于其装置简单，任何可溶性物质的奖赏或惩罚效应均可通过此检测方法轻松验证。

此外，最近已发表该范式的多种变体，可用于研究幼虫中的联想性视觉学习23,36（由 Gerber et al. (2004) 建立）；电击、光、热、奎宁或振动也已成功用作联想性嗅觉学习中的厌恶性强化刺激9,17,19-21,37-40。因此，目前已建立了一整套完善的实验体系，...

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致谢

我们特别感谢Gerber实验室成员在实验装置的技术指导以及对稿件提出的宝贵意见。同时感谢Lyubov Pankevych在果蝇饲养及野生型CantonS品系维护方面的工作。本研究工作得到了德国研究基金会（DFG）TH1584/1-1号资助、瑞士国家科学基金会（SNF）31003A_132812/1号资助以及康斯坦茨大学Zukunftskolleg（全部资助给AST）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
果糖 Sigma4774057-48-7
NaClFluka713507647-14-5
琼脂糖SigmaA50939012-36-6
1-辛醇Sigma12012111-87-5
乙酸戊酯Sigma46022628-63-7
石蜡油Sigma185128012-95-1

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趋性关联学习糖奖励气味容器果糖奖励遗传干扰行为指数naive 气味偏好幼虫脑
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