利用慢病毒介导功能获得或功能缺失，对毛囊再生模型进行组织特异性分析。
本文内容
摘要
摘要
毛囊形态发生是一个复杂的过程，需要上皮来源的角质形成细胞与下方间充质之间的相互作用，是研究器官发育和组织特异性信号传导的优良模型系统。尽管毛囊发育在遗传上具有可操作性，但对该过程中关键因子进行快速且可重复的分析仍具挑战性。本文介绍一种利用慢病毒在组织特异性条件下实现因子靶向过表达或shRNA介导的基因敲低的方法。通过采用一种改良的毛发再生模型5, 6, 11，我们可在原代小鼠角质形成细胞或真皮细胞中实现稳健的获得性或缺失性功能分析，从而促进对导致毛囊形态发生的上皮-间充质信号通路的研究。本文详细描述了如何分离新鲜的原代小鼠角质形成细胞和真皮细胞（包含毛乳头细胞及其前体细胞），将含有shRNA或cDNA的慢病毒感染其中一种细胞群体，再将两类细胞联合移植至裸鼠背部以生成完整毛囊。该方法可在三周内分析生成毛囊所必需的组织特异性因子，为现有的遗传模型提供了一种快速且便捷的补充手段。
方案
1. 准备出生0至2天的新生小鼠用于皮肤解剖
- 使用 CO2 饱和室对新生小鼠进行安乐死，持续至少 20 分钟。解剖前将小鼠置于冰上保存，时间不超过 1 小时。建议使用出生后 0 至 2 天（P0-P2）的小鼠，因为来自较大小鼠的细胞其前体细胞能力下降，导致移植产量降低。准备解剖皮肤时，配制一盘 70% 乙醇（用于步骤 1.3）和三盘洗涤液（用于步骤 3）。提前将 Dispase 溶液解冻并置于 4 °C 保存。在 CO2 过度暴露后，通过颈椎脱位确认小鼠安乐死完成。
- 将已安乐死的小鼠放置于冰上的培养皿中，并转移至无菌超净工作台。
- 将小鼠短暂浸入 70% 乙醇中进行清洗，然后转移至无菌培养皿中。
2. 解剖小鼠皮肤
- 使用无菌剪刀从躯干基部切断每条肢体和尾巴。
- 用一对弯头镊子牢固夹住小鼠身体，用手术刀沿背部皮肤从头部至尾部做切口，注意不要穿透下方的筋膜。
- 小心地从鼠体中线处将皮肤剥离。
- 用弯头镊子牢固夹住已暴露的小鼠身体，将另一对弯头镊子插入小鼠后端皮肤下方，轻柔地将皮肤从臀部拉向腹侧。
- 以连贯的动作小心将皮肤完全剥离小鼠体表，随后丢弃尸体。
3. 清洗皮肤并用 Dispase 溶液孵育
- 将皮肤置于第一皿洗涤液中，真皮面朝下。用镊子将皮肤铺平并搅动。在解剖下一张皮肤时，将此皮肤留在第一皿洗涤液中。
- 当下一张已解剖的皮肤放入第一皿洗涤液后，将前一张皮肤转移至第二皿洗涤液中。所有皮肤收集完毕前，均保留在第二皿洗涤液中。随后将所有皮肤转移至最终洗涤液中，短暂搅动。
- 向无菌的10 cm培养皿中加入10 ml冰上预冷的Dispase溶液。将皮肤转移至Dispase溶液中，并展平，确保真皮面朝下。
- 于4 °C下漂浮孵育8–16小时（可选方案：37 °C下孵育1小时）。
4. 分离真皮和表皮
- 将皮肤转移至新的无菌培养皿中，真皮面朝下展平。用手术刀小心地从一个角固定住真皮。
- 用镊子夹住表皮，缓慢将其从真皮上剥离。表皮应完整地以一片形式剥离。剥离后的表皮呈白色且较薄，而真皮则呈棕褐色、较厚且具有凝胶状质地。
- 将两种组织分别放入不同的无菌培养皿中。
- 若要制备真皮特异性基因敲低/过表达移植物，取真皮组织，用两把手术刀将其切成极小的碎片，丢弃表皮。在感染当天（步骤7），解剖另一组小鼠皮肤，以获取新鲜的未经处理的表皮细胞，与经慢病毒转导的真皮细胞混合使用。
- 若要制备表皮特异性基因敲低/过表达移植物，将每片表皮切成6–8个小片，丢弃真皮。在感染当天（步骤7），解剖另一组小鼠皮肤，以获取新鲜的未经处理的真皮细胞，与经慢病毒转导的表皮细胞混合使用。
5. 从剪碎的组织中解离原代小鼠真皮细胞（mDCs）
- 将真皮组织块与 freshly made Collagenase Solution 在 37 °C 下孵育 1 小时，以解离 mDCs。每只新生小鼠使用 10 ml Collagenase Solution。
- 每 10 分钟轻轻混匀含有真皮的溶液。在显微镜下检查解离程度；消化后的细胞悬液应主要为单细胞。随着真皮细胞从真皮组织中解离，溶液应由澄清变为浑浊。
- 向含有真皮的 Collagenase Solution 中加入 FBS，使其终浓度为 10%，以降低胶原酶活性。
- 将细胞悬液通过 70 μm 细胞滤网转移至新的 50 ml 离心管中，以去除未完全消化的大块组织和完整的毛囊。每 30 ml 滤过液加入 10 ml DMEM/10%FBS，进一步稀释胶原酶。
- 将含有消化后真皮的离心管在台式离心机上以 30 x g 离心 5 分钟，进一步去除完整毛囊。
- 小心将上清液转移至新的 50 ml 离心管中。在台式离心机上以 200 x g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
- 用 DMEM/10%FBS（每只新生小鼠 1 ml）重悬细胞并计数。将细胞接种于 Amniomax C-100 培养基中用于感染（步骤 7），或与慢病毒转导的 KC 混合用于移植（步骤 9）。通常每只新生小鼠可获得约 20 x 106 个细胞。
6. 从剪碎的组织中解离原代角质形成细胞（KC）
- 将表皮组织块与 freshly thawed 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下孵育 15 分钟，以解离角质形成细胞（KC）；每只新生小鼠使用 7 ml 胰蛋白酶-EDTA。
- 每 5 分钟轻轻摇动含有表皮组织的溶液一次。
- 向含有表皮组织的胰蛋白酶-EDTA 溶液中加入等体积的中和液，以降低胰蛋白酶活性。
- 在台式离心机上以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀；未消化的组织应漂浮在上层。
- 小心倾倒掉大部分含有未消化组织的上清液，再用 10 ml 移液器吸除剩余上清液，避免扰动细胞沉淀。用 PBS 重悬细胞沉淀。若角质形成细胞未完全沉淀，可先倾倒大部分上清液，重复离心直至大多数细胞形成沉淀。
- 将细胞悬液通过 70 μm 细胞滤网过滤至新离心管中，以去除残留组织或细胞团块。
- 在台式离心机上以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 用 CnT-07 培养基或 PBS（每只新生小鼠 1 ml）重悬细胞并计数。若需接种细胞用于感染（步骤 7），则使用 CnT-07 培养基；若需与慢病毒转导的 mDCs 混合用于移植（步骤 9），则使用 PBS。通常每只新生小鼠可获得 3–10 × 106 个细胞。
7. 使用含有 shRNA 或 cDNA 的慢病毒感染原代细胞
在感染当天，解剖另一组小鼠皮肤，以制备新鲜的未经处理的原代角质形成细胞（KC）或树突状细胞（mDC），并于移植当天（步骤9）与病毒感染的细胞混合。
-
- 对于成熟树突状细胞（mDCs），将4 × 106个mDCs接种至10 cm培养皿中，使用AmnioMAX-C100培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育，待细胞密度达到约50%时用于次日感染。通常每生成一个移植物需使用3–4个培养皿的mDCs，单次实验若需制备三个移植物，则共需10–12个培养皿。或者，接种后在37 °C、5% CO2条件下孵育至少2小时，使mDCs贴壁并铺展，于接种当日进行感染。mDCs呈成纤维细胞样形态。
- 对于角质形成细胞（KC），将12 × 106个KC接种至10 cm培养皿中，使用CnT-07培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育，次日进行感染。或者，接种后在37 °C、5% CO2条件下孵育至少2小时，使KC贴壁并铺展，于接种当日进行感染。通常每生成一个移植物需使用3–4个培养皿的KC，单次实验若需制备三个移植物，则共需10–12个培养皿。KC呈鹅卵石样形态。
- 在37 °C、5% CO2条件下，用8 μg/ml的Polybrene溶液预孵育细胞5–10分钟。
- 更换培养基，加入慢病毒和8 μg/ml的Polybrene溶液。慢病毒滴度因所用构建体不同而异，应在感染前确定。
- 将培养皿置于台式离心机中，在32 °C、200 × g条件下离心1小时，以促进慢病毒感染细胞。
- 移除含慢病毒的培养基，加入新鲜培养基。对于KC，在加入新鲜培养基前需用PBS洗涤细胞一次。通常感染后的细胞在37 °C、5% CO2条件下过夜恢复。或者，在进行细胞消化制备移植物前，至少在37 °C、5% CO2条件下恢复2小时。继续培养少量感染后的细胞，用于检测感染效率，方法见“代表性结果”部分。
8. 准备用于移植的感染细胞
- 使用步骤 4-6 从皮肤中分离新鲜的原代 mDC 或 KC。将细胞重悬于冰上预冷的无菌 PBS 中。计数细胞。
-
- 对于真皮特异性基因敲低/过表达移植，使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下消化 8 分钟，从培养板上解离感染的 mDC。
- 对于表皮特异性基因敲低/过表达移植，使用 0.125% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下消化 15 分钟，从培养板上解离感染的 KC。
- 使用 DMEM + 10% FBS（用于 mDC）或中和溶液（用于 KC）中和胰蛋白酶活性。将消化后的细胞转移至 50 ml 离心管中。
- 在台式离心机上以 200 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
- 将细胞重悬于冰上预冷的无菌 PBS 中。计数细胞。
- 将病毒感染的细胞与新鲜制备的未处理对照细胞混合。每例移植中，在冰上预冷的无菌 PBS 中混合 7–10 × 106 个 mDC 与 7–10 × 106 个 KC，并在 4 °C 下用台式离心机离心收集细胞悬液。将细胞重悬于 50–100 μl 冰上预冷的无菌 PBS 中。在裸鼠皮窗模型准备就绪前，始终将细胞置于冰上保存。
9. 在裸鼠背部创建创面床并固定装置
移植前一天，使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌，并将硅胶 chamber 浸泡于 70% 乙醇中进行消毒。使用 chamber 前，将其中的 70% 乙醇更换为无菌 PBS。
- 使用氯胺酮（8 mg/ml）/赛拉嗪（1.6 mg/ml）通过腹腔注射（100 μl/10 g 体重）或其他常用方法对裸鼠（nu/nu，7–12 周龄雌性）进行麻醉。涂抹眼用润滑剂，并在小鼠身下放置加热垫。
- 用碘伏消毒裸鼠背部皮肤，再用酒精棉片清洁。
- 在切口部位局部滴加 1–3 滴 0.25% 布比卡因。用镊子夹住裸鼠颈部基部的皮肤。
- 用无菌剪刀在夹起的皮肤上剪出一个直径约 1 cm 的小圆形切口。
- 将无菌观察室置于创面床上，并用周围皮肤覆盖观察室边缘。
- 沿观察室边缘用缝线固定观察室（每个观察室缝 6 针），如图 2A所示。
- 当观察室准备就绪后，轻轻涡旋混匀细胞悬液，并用连接 1 ml 注射器的 23 号针头吸取。若细胞悬液已沉降至底部，应在吸入针头前用 1 ml 移液器枪头轻轻重悬。
- 用针头穿刺观察室，缓慢将细胞滴加至创面。
- 将小鼠放入洁净的高压灭菌笼具中，每笼饲养 2 只，并在饮水中添加抗生素和泰诺（3 mg/ml）。根据我们的经验，每笼饲养两只雌性小鼠不会对观察室、移植物或动物本身造成不良创伤。
- 在笼具一半下方放置加热垫，观察小鼠直至麻醉作用消退。
10. 在 7-9 天后移除培养室
- 按照步骤9.1麻醉带腔室的裸鼠（nu/nu小鼠），并涂抹眼用润滑剂。
- 用碘伏消毒腔室周围皮肤，再用酒精棉片清洁。
- 小心剪开缝线，并从腔室上移除。
- 轻柔地将腔室从小鼠身上取下。若新生皮肤移植物粘附于腔室，可抬起腔室一部分，用镊子轻轻分离移植物与腔室。在移除腔室时固定住移植物。移植物应呈现无光泽且不透明的外观，如图2B所示。
- 在开放伤口上覆盖含薄层抗生素的非粘连性敷料，并用缝线固定（2针）。
- 用绷带包裹小鼠以固定敷料并保护伤口，将绷带缝合固定。
- 硅胶腔室通过温和皂液刷洗清洁，并用去离子水彻底冲洗。将腔室浸泡于70%乙醇中过夜，晾干后保存。
11. 检查小鼠毛发生长情况
- 在移除培养室3天后，取下绷带和敷料。移植物应呈干燥状，颜色为不透明至棕色。
- 定期检查小鼠的毛发生长情况。移植后约16天应开始出现毛发。
实验步骤概述
第1天（2-3小时）：处死新生幼鼠，剥离皮肤，并于4 °C下用dispase消化过夜。
第2天（2-3小时）：从皮肤中分离原代细胞，并按照推荐的细胞密度进行接种。
第3天（3-4小时）：用慢病毒感染细胞。取另一组新生幼鼠的皮肤，置于4 °C过夜消化。
第4天（6-8小时）：从皮肤中分离原代细胞，计数后置于冰上。通过胰酶消化和离心回收慢病毒转导的细胞，计数后将7-10 × 106个真皮细胞与角质形成细胞混合，每份移植物加入50-100 μl PBS。在小鼠体内制备创面床，安装培养室，将细胞混合物接种于创面床上。
替代实验方案概述
替代实验方案可将实验时间从四天缩短至三天。
- 通过在37 °C下用dispase处理小鼠皮肤1小时，将第1天和第2天的步骤合并（预计时间5-7小时）。
- 通过在细胞接种后2小时即用慢病毒感染细胞，将第2天和第3天的步骤合并（预计时间5-7小时）。
结果
在图1中，我们展示了在3周龄再生毛发移植体中，通过真皮特异性慢病毒shRNA敲低Smoothened（Smo）的结果，Smo是Shh信号通路的关键组分。使用仅含慢病毒载体的对照移植体表现出显著的毛发生长（图1A）。相比之下，真皮特异性敲低Smo导致毛发生长丧失（图1B）。苏木精-伊红染色显示了对照组与实验组中毛囊的发育阶段（图1C, D）。类似处理所导致的毛发生长表型在不同实验之间可能存在变异，包括仅感染慢病毒载体的阳性对照组。因此，每次实验均应包含阳性对照移植体作为参照，因为约30%的移植体可能由于瘢痕形成或移植体附着不完全而失败。在检测两个因子之间相互作用的情况下（例如，过表达某一因子的cDNA以挽救另一因子的shRNA介导的敲低效应），每次实验均应始终包含单独敲低的移植体，以明确展示该基因缺失功能的结果。这将提供必要的参照范围，用于判断特定基因如何干扰毛囊再生通路以及两个基因之间的相互作用方式。
移除培养室（图 2A）时必须小心操作。新形成的移植物应略呈半透明，表面无光泽（图 2B）。移植物可能粘附于培养室，因此轻柔地抬起一侧非常重要，以确保移植物仍附着于创面基底。移植后三天，移植物已较为稳定，此时更换敷料应无明显困难。三周后应可观察到明显的毛发生长（图 2C）。若缺失 mDCs 或 KCs 中的任一类细胞，则伤口愈合部位将完全无毛发生成（图 2D）11。若其中一类细胞发生死亡或丢失，同样会导致无毛发生长；相比之下，真皮层 Smo 基因敲低仅导致毛发再生减少，如 图 1B 所示。
为确保实验成功，在移植前必须实现超过90%的细胞病毒感染率，并达到适当的过表达或敲低效率。由于移植操作存在时间限制，我们建议在开始移植实验前先优化病毒转导效率，并在移植当天保留少量细胞，以验证基因表达的缺失或获得。慢病毒滴度会因所用载体的不同而有所变化，应在感染前测定，以达到90–100%的转导效率。我们通过慢病毒载体共表达的GFP来监测病毒感染效率。我们常规采用定量PCR和/或Western blot检测基因敲低或过表达的程度。使用带有荧光标记的双表达载体标记病毒感染的细胞，可用来评估成熟移植物中信号的持续性以及表达目标载体的细胞数量。我们采用由慢病毒载体pSicoR-CMV-GFP10中CMV启动子驱动的GFP，结合Smo shRNA进行实验。在图3中，我们展示了一个3周龄的真皮特异性移植物，其中GFP通过慢病毒在代表性毛囊的真皮乳头中表达。
图 1. 毛囊生长的组织学分析。 (A) 对照组毛发再生移植物的图像，其真皮细胞感染空载慢病毒载体，角质形成细胞未处理。(B) 在真皮细胞中使用慢病毒 shRNA 沉默 Smoothened 并联合未处理的角质形成细胞，导致毛囊缺失。(C) 苏木精-伊红染色显示，对照组移植物中的生长期（anagen）毛囊向下延伸至真皮层；(D) Smoothened 沉默的毛囊则发育受阻，几乎完全缺失。所有图像均为移植后三周采集。比例尺表示 100 μm。
图2. 原代细胞移植。 (A) 携带缝合腔室的裸鼠（nu/nu小鼠），腔室内含有原代真皮细胞和角质形成细胞。 (B) 移除腔室后暴露出新形成的皮肤，外观 dull 且不透明。 (C) 使用野生型原代真皮细胞和角质形成细胞进行移植，三周后移植物上长出完全成熟的毛发。 (D) 仅添加原代真皮细胞而无角质形成细胞，三周后无毛发生成；仅添加原代角质形成细胞而无真皮细胞时，结果类似。
图 3. 真皮乳头中 GFP 表达的维持。 来自再生移植物（3 周龄）的真皮乳头共聚焦图像。GFP 由慢病毒载体在真皮细胞群中表达，并在真皮乳头中被检测到（绿色）。Versican（红色）标记真皮乳头区域，细胞核用 Hoechst 染色（蓝色）。注意 GFP 特异性地在真皮细胞中表达，而在周围的角质形成细胞中不表达。比例尺为 20 μm。
讨论
毛发重建实验为研究毛囊从头形成的机制提供了一个独特的器官再生模型。本文描述了一种改良的腔室毛发重建实验方法，可用于确定基因在毛囊形成过程中的功能。本实验基于已报道的腔室毛发重建实验5, 6,11，我们对其进行了改进，引入了慢病毒表达技术，以实现对真皮或表皮细胞类型中目标基因的过表达或敲低。本实验为构建组织特异性基因敲除模型提供了一种快速替代方案。通过该方法，从慢病毒感染原代细胞到移植物采集，仅需约三周时间即可验证目标基因在毛囊形成中的功能。本实验还可进一步拓展，用于研究基因间的遗传相互作用，例如通过慢病毒将shRNA与cDNA组合导入同一细胞类型12，同时也可用于分析真皮与表皮细胞类型之间的信号交流。
我们的毛发检测方法最适合检测毛囊再生过程中显著的功能获得或功能缺失表型，而细微的缺陷则较难观察。我们已成功利用该毛发再生检测方法证明了若干基因在真皮中的特异性功能1,12。根据慢病毒载体表达shRNA时共表达的GFP标记10，我们证实了表达shRNA的供体真皮细胞在再生的毛发移植物中持续存在。在再生毛囊的真皮乳头（DP）中可观察到GFP阳性细胞（图3）。由于细胞表达的GFP水平不同，DP细胞可能具有不同程度的基因敲低，因此所观察到的毛囊表型呈现出从基因功能部分缺失（hypomorph）到完全缺失（null）的连续变化范围。
该实验方法的一个改进方向是在移植前建立一种快速高效的筛选高表达shRNA细胞的策略，例如使用流式细胞术（FACS）来纯化强GFP表达的细胞。另一种替代方案是在本实验中使用突变体或条件性敲除细胞9。另一方面，建立能够维持毛乳头（DP）细胞功能的培养体系非常有价值，因为一旦原代真皮细胞被传代，其DP细胞活性会逐渐丧失。潜在的培养体系包括使用人工微环境来源的生物材料或细胞聚集体培养方法2,7,8,13。另一项改进是开发一种可靠的表皮细胞冻存方法，并实现较高的细胞回收率，这将减少在皮肤特异性功能缺失或功能获得研究中使用第二窝小鼠幼崽（步骤7）来制备新鲜角质形成细胞的需求。
该毛囊腔室检测所生成的毛囊密度和质量与正常小鼠皮肤相似，尽管毛发生长的同步性略低，且毛囊排列方向更为随机。毛发再生基因检测存在一些局限性，包括需要大量慢病毒和细胞数量，并且在手术操作上比其他毛发重建检测（如补片检测和皮瓣检测）更为耗时费力3,4,14。然而，该方法在毛囊质量以及检测毛发生长时间方面优于其他检测方法4。我们建立的靶向毛发再生检测为现有的遗传模型提供了一种快速且便捷的补充手段。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）博士后研究基金 1F32CA14208701（S.X.A.）以及 NIH 基金项目 AR052785 和 AR046786（A.E.O. 和 W.-M.W.）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 补充剂 | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| 庆大霉素 | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | 罗氏 | 4942078001 | |
| I型胶原酶 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| 组织培养皿 | Fisher Scientific | 08-772E | |
| 解剖剪 | Fisher Scientific | 11-999 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 10-275 | 弯曲的 |
| 手术刀 | Medex Supply | GRF-2975#10 | 10 号大小 |
| 70 μm细胞染色剂 | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml 锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| 酒精棉片 | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23号针头 | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| 眼用润滑剂 | 绒毛膜绒毛取样 | 8883660 | |
| 聚维酮碘棉签 | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| 硅胶培养室 | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| 缝合线 | Acuderm | SUP3524 | |
| 弹性绷带 | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| 非粘附性敷料 | TELFA | 1050 | |
| 材料 | |||
洗涤液 PBS Dispase 溶液 HBSS 中和培养基 HBSS Polybrene 溶液 HBSS |
参考文献
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重印与许可
