异源天然产物生物合成的原理、实验步骤及其潜力：以大肠杆菌（E. coli）合成复杂抗生素红霉素A为例

摘要

红霉素A的异源生物合成途径 大肠杆菌 包括以下实验步骤：1）基因转移；2）异源重构；以及3）产物分析。每个步骤将结合利用异源宿主生产治疗性天然产物的动机、潜力与挑战进行阐述 E. coli 作为替代宿主。

摘要

异源生产复杂天然产物是一种旨在应对当前局限性并探索未来可能性的方法。该方法特别适用于那些具有治疗价值但难以充分生产、或可从改进生产方式中获益的化合物。相关实验步骤可分为三个部分：1）基因转移；2）异源重构；3）产物分析。各个实验环节均在持续优化中，以应对这一新兴方法所带来的挑战，并把握其潜在机遇。

异源生物合成始于鉴定出负责某种有价值天然产物的基因序列。由于产物形成所依赖的生物合成途径具有复杂性，将该序列转移至异源宿主的过程变得复杂。红霉素A就是一个很好的例子。其最终生物合成需要20个基因（总计超过>50 kb）。此外，其中三个基因编码巨型合成酶，即每个分子量约为300 kDa的多结构域酶。这些遗传物质必须经过合理设计并转移至E. coli，以实现重建的生物合成。本文将介绍在将红霉素A基因簇转移至E. coli的过程中，PCR扩增、操纵子构建、多顺反子质粒以及电穿孔转化技术的应用。

转移完成后，E. coli 细胞必须能够支持最终的生物合成过程。由于E. coli与大多数负责复杂天然产物合成的原始宿主之间存在显著差异，这一过程也颇具挑战性。细胞必须提供生物合成所需的必要底物，并协调表达转移的基因簇以产生有活性的酶。以红霉素A为例，需对E. coli细胞进行改造，使其提供生物合成所必需的两种前体（丙酰-CoA和(2S)-甲基丙二酰-CoA）。此外，还需进行基因序列修饰、调控质粒拷贝数、共表达分子伴侣素、实现翻译后酶修饰以及优化工艺温度，才能最终实现红霉素A的合成。

最后必须评估成功生产的情况。对于红霉素A的案例，我们将介绍两种方法。第一种是液相色谱-质谱联用（LC-MS）法，用于确认并定量产物的生成。红霉素A的生物活性还将通过生物测定法进行验证，即检测其对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗生素活性。这些评估实验可确立由大肠杆菌（E. coli）合成红霉素A的可行性，并为后续的工程化改造以提升或多样化产物产量，以及利用该策略生产其他复杂天然化合物奠定基础。

引言

红霉素A是一种由革兰氏阳性土壤细菌Saccharopolyspora erythraea产生的聚酮类抗生素，经过数十年的传统诱变与筛选方案，以及近期的工艺优化策略，目前其产量已逐步提升至约10 g/L^1-6。由于天然抗生素生产宿主在培养和/或遗传操作方面存在困难，同时抗生素活性或生长表型的改善易于检测并有助于筛选，因此诱变与筛选策略在抗生素天然产物开发中十分常见。对于红霉素A而言，S. erythraea受限于生长缓慢以及缺乏如E. coli等生物所具备的高效遗传操作手段，从而阻碍了产量的快速提升及新衍生物的生物合成。在认识到这些生产瓶颈并意识到红霉素A类化合物结构多样化的潜力后，科研界开始探索异源生物合成的可行性（图1）⁷。这些研究进展恰逢红霉素A基因簇序列信息的公布^8-11。需要强调的是，目前已测序的复杂天然产物基因簇数量大幅增加^12-16，这进一步推动了异源生物合成研究的发展，以挖掘其编码的药用潜力。实现这一目标，异源重构要求新宿主能够满足特定生物合成途径的需求。E. coli具备技术操作便利性、丰富的分子生物学工具，以及成熟的代谢与工艺工程策略，有利于产物开发。然而，与天然生产宿主相比，E. coli在复杂天然产物合成能力方面表现有限。因此，此前尚不清楚E. coli是否可作为复杂天然产物生物合成....

方案

以下文本针对红霉素A抗生素，但所述步骤设计为可普遍适用于其他天然产物作为异源生物合成的候选物。

1. 红霉素A基因簇转移

1. 设计PCR引物以扩增与红霉素A基因簇相关的所有基因 S. erythraea 染色体。此步骤仅适用于那些遗传序列已被确定的天然产物候选分子。或者，所需基因可通过多家商业供应商进行合成，其优势在于新合成的基因可针对新宿主中的最优密码子使用进行设计 E. coli 宿主。如果进行DNA合成，当前面临的挑战是生成长度可能超过10 kb的巨型合酶基因。从技术上讲，合成是可行的，但过程困难且成本高昂。预计随着基因合成技术的持续改进，将逐步克服现有缺陷，并进一步验证该方法在提供异源遗传物质方面的可行性。
2. 使用新制备的样品进行 PCR S. erythraea 以基因组DNA为模板。染色体DNA可从培养物中制备 S. erythraea 或从该细菌的冻存菌种图3)²⁵PCR反应中可添加DMSO（50 μl反应体系中加入4 μl），以应对目的片段高G+C含量的问题 S. erythraea 基因。每个扩增出的基因都应进行测序，以确认完整基因已被成功获取，且在PCR过程中未引入任何突变。
3. 通过限制性消化和连接，将每个分离出的基因插入专为表达设计的载体中

结果

该方法的预期结果是从 E. coli 异源宿主。这一点最能通过用于确认和定量产物的液相色谱-质谱（LC-MS）结果来体现图 6）以及用于确认最终活性的抗菌生物测定（图7在异源生物合成的整体方案中，这一结果标志着成功。一旦实现，研究工作便转向优化（包括细胞水平和工艺水平）以及分子工程。最终目标包括为原始化合物建立经济高效的生产工艺，并实现对异源系统的可控性，从而能够理性地调整工艺，以生成具有增强或更广活性谱的原始化合物的衍生物。

若未能成功生成目标化合物，则需启动多种应急方案，以评估是何种因素阻碍了生物合成的顺利进行。上述方案中已内置了许多故障排查机制。根据我们的经验，至少应在尝试评估所形成天然产物的生物合成之前，首先确认新引入基因簇的基因表达是否成功（通过可溶性生物合成酶的SDS-PAGE分析）。在基因表达完成后，如上所述，采用蛋白质折叠伴侣、增加基因拷贝数以及优化工艺温度等方法，已被证实是最终实现生物合成的有效手段。

讨论

异源生物合成过程中的关键步骤体现在该流程的三个操作环节：1）基因转移；2）生物合成途径的重建；3）产物分析。任何一个阶段出现问题，都会导致异源生物合成的最终目标失败。其中最具挑战性的环节可能是实现生物合成途径的重建，因为只有成功重建才能进行有效的产物分析。然而，重建的成功依赖于对负责最终生物合成的遗传物质进行精确的设计与转移。同样，已建立的高灵敏度分析方法（如液相色谱-质谱联用，LC-MS）能够检测到极低产量的产物，否则这些产量可能被误判为无产物生成。正是这些因素的综合作用，使得异源生物合成具有高度挑战性。

以红霉素A为例，在将基因整合以实现协调表达和天然产物合成之前，通过PCR分离得到的已确认基因序列需逐一测试其表达情况。在最初的产品分析尝试中，只有当伴侣素（GroEL/ES）与所需基因簇共表达时，才能首先鉴定到中间化合物。最终产物的生成则需要引入一个额外拷贝的、负责生物合成最后一步的基因（eryK）。上述两种措施均得益于所采用的高灵敏度LC-MS分析方法，该方法用于初步评估产物的生成情况。

在确认产物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PCR仪	Eppendorf	Mastercycler personal
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher	BP231
电穿孔仪	BioRad	Micropulser
IPTG	Fisher	BP1620
丙酸钠	Sigma	P1880
L-阿拉伯糖	Sigma	A3256
冷冻摇床	Thermo Scientific	MaxQ 4000
微量离心机	Eppendorf	Centrifuge 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Plasmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
乙酸乙酯	Sigma	270989
甲醇	Sigma	322415
真空离心浓缩仪	Eppendorf	Concentrator 5301
旋转蒸发仪	Buchi	R-200