为了理解免疫反应与行为之间的关联，我们描述了一种在细菌感染期间测量黑腹果蝇（Drosophila）运动行为的方法，以及通过监测存活率、细菌载量和天然免疫关键调控因子NFκB的实时活性来评估果蝇启动免疫反应能力的方法。
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摘要
摘要
免疫反应与宿主行为之间存在复杂的相互作用，这一现象已在多种物种中得到描述。特别是在哺乳动物中，睡眠过度已被证实是应对感染的一种反应。 1 并且最近也在 黑腹果蝇2普遍认为，在感染期间睡眠对宿主有益，且对维持强大的免疫系统具有重要意义3,4然而，支持这一假设的实验证据仍然有限4，且免疫反应期间睡眠过多的功能仍不明确。我们采用多学科方法来解决这一复杂问题，并在果蝇这一简单的遗传模型系统中开展了研究 黑腹果蝇我们采用一种标准的检测方法来测量果蝇的运动行为和睡眠，并展示了该方法如何用于检测感染了致病性细菌菌株的果蝇的行为表现。该检测方法还可用于监测个体果蝇在感染过程中的存活时间。其他免疫功能的检测指标包括果蝇清除感染的能力以及NFκB的活化情况，NFκB是一种关键的转录因子，在果蝇先天免疫反应中起核心作用。 果蝇生存结果与感染期间的细菌清除情况共同反映了机体对感染的抵抗性与耐受性。抵抗性是指果蝇清除感染的能力，而耐受性则定义为宿主限制感染所致损伤的能力，从而在体内存在高水平病原体的情况下仍能存活。5. 在感染过程中实时监测 NFκB 活性有助于揭示感染期间存活的分子机制。通过使用 果蝇 这些简单的检测方法有助于对睡眠和免疫反应进行遗传学和分子水平的分析，并揭示这两个复杂系统之间如何相互影响。
方案
本方案采用两种装置（图1) 以获取经细菌感染处理的果蝇所产生的四种不同读数。这些输出包括：1）睡眠/觉醒行为；2）存活结果；3）果蝇体内的细菌载量；以及 4）NFκB 报告基因活性的实时测量 体内结合可利用的遗传工具 果蝇这些测量结果为免疫功能与行为之间的分子关联机制提供了深入见解。
1. 测量果蝇的运动活性与睡眠
- 用于测量果蝇运动活性和睡眠的装置，包括 果蝇 活动监测系统（DAM2，Trikinetics）、培养箱、暗室，以及实验动物和活动管的制备方法，此前已有描述6此处采用了相同的方法，仅作了一些细微修改。
- 培养箱的照明由培养箱自身控制。因此，必须同步计算机与培养箱之间的时间设置。
- 活动管通过在电热板上用去离子水煮沸进行清洗以重复使用。首次煮沸时加入少量洗涤剂，随后将管子充分冲洗，并再重复煮沸两次。若使用纱线塞住管口，含有食物、石蜡、果蝇和纱线的用过的活动管可在不预先取出纱线的情况下直接清洗。
- 在开始实验之前，将含有晚期蛹期果蝇的培养物置于培养箱中孵育三到四天，以适应实验所需的光照及其他环境条件。光照：黑暗或恒定光照条件常被用于测量睡眠行为。在本示例中，果蝇被适应于恒定光照条件，以消除昼夜节律钟对免疫反应和行为的影响<....
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结果
- 感染会促进睡眠。在此示例中，将 Canton-S (CS) 野生型果蝇和缺乏 NFκB 基因 Relish 的突变体果蝇（RelE20）14 分别装入两台 DAM2 活动监测仪中（每种基因型 n=32），并按上述方法进行感染。果蝇维持在持续光照条件下，以消除昼夜节律钟对行为和感染的影响2,7,8。RelE20 突变体已如先前所述与 CS 背景等基因化11。两组果蝇均感染了 S. marcescens，结果如图3所示。在某些情况下，增设一个操作对照组有助于区分操作本身与感染所引起的影响2。操作对照组经历与感染组相同的环境变化，包括从培养箱中取出并麻醉相同时间，但不接受注射。然而，在本例中，感染后 RelE20 突变体果蝇的睡眠时间明显少于 CS 对照组果蝇（图3A）。如前所述6，DAMS 实验还可测量其他行为参数，例如单位时间内的总活动次.......
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讨论
本方案概述了一种研究行为（特别是睡眠）与免疫反应参数之间关联的方法。这些参数包括细菌载量、生存结局以及通过荧光素酶报告系统测定的NFκB活性。 体内这些参数共同提供了关于果蝇抵抗感染能力的信息。细菌载量和存活结果是免疫反应参数，涉及简单的测量方法 果蝇. RelE20 缺乏在免疫反应中起核心作用的NFκB转录因子的突变体，在细菌感染后会迅速死亡。对行为进行遗传学或其他方式的操控也可能影响这些免疫反应参数，可能通过影响NFκB自身的活性实现。例如，感染前的睡眠剥夺会增加基因表达水平 Relish mRNA，并相对于未剥夺组对照减少每只果蝇的菌落形成单位（cfu/fly）11时钟基因的突变体， 周期7 和 无时性8，也已被报道会降低感染期间的存活率以及细菌清除能力8进一步采用该方法的研究有望揭示行为可能影响免疫功能的机制。
此处所述的注射/感染操作步骤改编自Wu先前描述的.......
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致谢
本研究工作由国家科学基金会（资助号 #IOS-1025627）和美国国立卫生研究院（资助号 #1R21NS078582-01）资助，项目负责人：J.A.W。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| 培养箱 | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 | 任何能够运行程序化光照/温度周期的培养箱均可使用。 |
| Drosophila 活动监测仪 | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | 如其他文献所述6，该系统需要配备计算机接口、软件及其他附件。 |
| Pyrex 玻璃管 | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| 微孔板闪烁及发光计数仪 | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 检测器 | 任何能够检测发光信号的微孔板读板仪均可用于此类报告基因检测。TopCount 含多个检测器和自动堆叠器，可编程实现对多块微孔板的连续读取。 |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | 细菌培养物的成像为可选步骤；任何具备可见光成像功能的数字成像系统均可满足要求。 | |
| 微量移液器拉针仪 | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| 耗材 | |||
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml 注射器 | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| 注射器针头 | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G —— 需剪除针头尖端，以防止对管路造成损伤。 |
| 硅胶管，内径 (0.030")，外径 (0.065")，壁厚 (0.018") | VWR | 60985-706 | 用于将玻璃毛细针连接至注射器 |
| 三通阀 | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes 无绳电动研磨杵 | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes 研磨杵头 | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| 玻璃珠，3 mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ 微孔板 | Thermo Scientific | 7571 | 应选择适用于发光检测的 96 孔板——必须为不透明板。 |
| TopSeal-A：96 孔微孔板密封膜 | PerkinElmer | 6005185 | 微孔板压敏粘性密封膜 |
| D-荧光素钾盐 | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| 软件 | |||
| Insomniac2 | 可向作者申请获取 | 定制软件；由 Westminster College 的 Lesley Ashmore 博士编写 | 基于 Matlab 的软件，已常规用于睡眠数据分析2,6,11 |
| Drosonex | 可向作者申请获取 | 定制软件；由 Sidewalk Software 的 Thomas Coradetti 编写 | 一款 PC 平台 MSVC6 程序，用于对 Trikinetics 系统采集的原始数据进行生存分析 |
| Photoshop CS3 | Adobe | 可用于从数字图像中获取每板菌落形成单位（cfu）的数量（可选） |
参考文献
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila....
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