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方法文章

Drosophila 免疫应答与睡眠的定量测量

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DOI：

10.3791/4355

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2012年12月4日

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

本文内容

摘要

为了理解免疫反应与行为之间的关联，我们描述了一种在细菌感染期间测量黑腹果蝇（Drosophila）运动行为的方法，以及通过监测存活率、细菌载量和天然免疫关键调控因子NFκB的实时活性来评估果蝇启动免疫反应能力的方法。

摘要

免疫反应与宿主行为之间存在复杂的相互作用，这一现象已在多种物种中得到描述。特别是在哺乳动物中，睡眠过度已被证实是应对感染的一种反应。 1 并且最近也在 黑腹果蝇2普遍认为，在感染期间睡眠对宿主有益，且对维持强大的免疫系统具有重要意义3,4然而，支持这一假设的实验证据仍然有限4，且免疫反应期间睡眠过多的功能仍不明确。我们采用多学科方法来解决这一复杂问题，并在果蝇这一简单的遗传模型系统中开展了研究 黑腹果蝇我们采用一种标准的检测方法来测量果蝇的运动行为和睡眠，并展示了该方法如何用于检测感染了致病性细菌菌株的果蝇的行为表现。该检测方法还可用于监测个体果蝇在感染过程中的存活时间。其他免疫功能的检测指标包括果蝇清除感染的能力以及NFκB的活化情况，NFκB是一种关键的转录因子，在果蝇先天免疫反应中起核心作用。 果蝇生存结果与感染期间的细菌清除情况共同反映了机体对感染的抵抗性与耐受性。抵抗性是指果蝇清除感染的能力，而耐受性则定义为宿主限制感染所致损伤的能力，从而在体内存在高水平病原体的情况下仍能存活。5. 在感染过程中实时监测 NFκB 活性有助于揭示感染期间存活的分子机制。通过使用 果蝇 这些简单的检测方法有助于对睡眠和免疫反应进行遗传学和分子水平的分析，并揭示这两个复杂系统之间如何相互影响。

方案

本方案采用两种装置（图1) 以获取经细菌感染处理的果蝇所产生的四种不同读数。这些输出包括：1）睡眠/觉醒行为；2）存活结果；3）果蝇体内的细菌载量；以及 4）NFκB 报告基因活性的实时测量 体内结合可利用的遗传工具 果蝇这些测量结果为免疫功能与行为之间的分子关联机制提供了深入见解。

1. 测量果蝇的运动活性与睡眠

  1. 用于测量果蝇运动活性和睡眠的装置，包括 果蝇 活动监测系统（DAM2，Trikinetics）、培养箱、暗室，以及实验动物和活动管的制备方法，此前已有描述6此处采用了相同的方法，仅作了一些细微修改。
    1. 培养箱的照明由培养箱自身控制。因此，必须同步计算机与培养箱之间的时间设置。
    2. 活动管通过在电热板上用去离子水煮沸进行清洗以重复使用。首次煮沸时加入少量洗涤剂，随后将管子充分冲洗，并再重复煮沸两次。若使用纱线塞住管口，含有食物、石蜡、果蝇和纱线的用过的活动管可在不预先取出纱线的情况下直接清洗。
  2. 在开始实验之前，将含有晚期蛹期果蝇的培养物置于培养箱中孵育三到四天，以适应实验所需的光照及其他环境条件。光照：黑暗或恒定光照条件常被用于测量睡眠行为。在本示例中，果蝇被适应于恒定光照条件，以消除昼夜节律钟对免疫反应和行为的影响2,7,8 如所述 图1A，按照所述方法将1至4日龄的果蝇装入Trikinetics DAM2活动监测仪中6，并在感染前至少记录三天。

2. 用致病性细菌菌株感染果蝇

  1. 本文所述方案专用于易培养和保存的 S. marcescens。其他细菌种类的长期保存和培养条件方案会有所不同。S. marcescens 应保存于含 15–50% 甘油的溶液中，置于 -80 °C 环境。为制备长期保存菌种，取两份体积的过夜培养细菌（O.D.600 = 0.5–1.0）与一份体积的高压灭菌 50% 甘油混合于 1.5 ml 微量离心管中，最终甘油浓度为 17%。将离心管储存于 -80 °C。为制备短期使用菌液，用无菌 200 μl 移液枪头刮取冻存菌种，在 LB 琼脂平板上进行三区划线。于 37 °C 培养过夜以获得单菌落，随后将平板储存于 4 °C。
    在预定感染前一天，用无菌 200 μl 移液枪头从 LB 琼脂平板上挑取单个菌落，将枪头浸入含 5 ml LB 培养基的培养管中。在 37 °C、250 rpm 条件下于摇床中培养过夜或最多 16 小时，直至进入对数生长期。使用分光光度计在 OD600 处测定菌液浓度，此阶段浓度范围为 0.5 至 1.0。若浓度过高，需进行传代培养并继续生长数小时以达到最佳浓度。操作过程应在火焰旁进行。某些菌株经基因工程改造具备抗生素抗性，需在培养基中添加相应抗生素进行培养和筛选。S. marcescens（ATCC #8100）不具抗生素抗性，因此应在不含抗生素的无菌培养基中培养。为验证无菌操作技术，应设置不接种细菌的空白培养作为对照。
    用于感染果蝇的溶液包含细菌（稀释至 OD600 = 0.1）和 1% 食用色素（亮蓝 FCF）的 PBS 溶液。对照注射液的配制方法为：在 PBS 中加入与感染液等量的 LB 培养基及 1% 蓝色食用色素。所有溶液应置于冰上保存。
  2. 准备用于注射果蝇的玻璃针。使用微量移液器拉制仪（Narishige）将玻璃毛细管（外径 = 1 mm，内径 = 0.58 mm，WPI）拉制成细尖。在解剖显微镜下，用精细镊子折断针尖，使开口大小足以通过注射器施加负压吸入注射液，同时又足够小以尽量减少注射过程中对果蝇的损伤。折断后针尖直径应约为 40–50 μm。将玻璃针连接至带有导管的 3 cc 塑料注射器。通过手动推动或回抽注射器活塞，控制注射液的流动。避免注射液污染橡胶导管，因为同一套注射装置需用于感染组和对照组的注射操作。
  3. 通过将果蝇置于 CO2 麻醉垫上使其麻醉。CO2 经过密封的水容器以湿润气流，从而增加麻醉垫湿度并减少静电，避免静电干扰果蝇在垫上的操作。使用玻璃针刺入果蝇背部胸部盾片上方区域进行注射。通过食用色素的分布情况确认注射液是否成功注入——当食用色素在果蝇体内扩散时，果蝇会变为蓝色。果蝇接受的细菌剂量可按下方第 3 节所述方法进行定量。某些实验设计中包含对照组，即向果蝇注射不含细菌的 PBS 加食用色素溶液，以模拟无菌性损伤。

3. 测定细菌载量

评估免疫反应对抗细菌感染的一种方法是测定感染后的细菌载量。D. melanogaster 是测定该参数的理想模型，因为可将整只果蝇匀浆，以估算个体内的总细菌数量。本实验方案的原理在于：当细菌在固体培养基（如培养皿中的Luria肉汤（LB）琼脂（LB平板））上生长时，单个细菌会形成肉眼可见且可区分的菌落。因此，通过在LB液体培养基中匀浆感染的果蝇，对匀浆液进行系列稀释，并将稀释后的匀浆液涂布于LB平板上，即可确定感染果蝇体内的细菌细胞数量。应使用一组注射了PBS和食用色素但未注射细菌的果蝇作为对照，以验证感染过程中未被其他细菌物种污染。在此条件下，LB琼脂平板上应无任何菌落形成。

  1. 在进行实际的匀浆步骤之前，将本实验所用的所有材料进行高压灭菌。这包括用剪刀剪过的200 μl移液器吸头、LB培养基以及用于匀浆的研杵。至少在匀浆果蝇前1天，将已灭菌的LB/琼脂培养基倒入10 cm无菌培养皿中制备平板。
  2. 将果蝇麻醉后收集至1.5 ml微量离心管中，并将离心管置于冰上保存。
  3. 在火焰附近进行匀浆操作以防止污染。建议设置未感染果蝇的对照匀浆组，尤其是在使用如S. marcescens这类不具抗生素抗性的菌株时。每种实验条件下至少匀浆2组，每组不少于10只果蝇。每份匀浆所用果蝇数量由实验者自行决定。有些研究组采用每份匀浆1只果蝇的方式，这有助于评估个体果蝇间细菌载量的差异8；而其他研究则采用每份匀浆3–10只果蝇，用于不同基因型或实验条件间的比较9-12。
    1. 向含有果蝇的微量离心管中加入400 μl LB培养基，使用小型电动研磨器和研杵（Kontes）进行匀浆。
    2. 使用已灭菌的剪切移液器吸头，将匀浆液进行1:10系列稀释：取20 μl匀浆后的LB/细菌混合液加入含有180 μl LB培养基的1.5 μl微量离心管中。剪切移液器吸头可防止果蝇残渣堵塞，确保准确转移所需体积。
    3. 稀释倍数需根据经验确定，具体取决于果蝇基因型、所用细菌菌株及实验条件。对于感染S. marcescens的野生型果蝇，感染后立即匀浆的样品可采用1:102或1:103的稀释度；感染后24小时匀浆的样品则采用1:104或1:105的稀释度。
    4. 从最终稀释度的微量离心管中取出100 μl LB/细菌混合液，使用玻璃珠（VWR）将其均匀涂布于LB平板上，以确保菌落分布均匀。
    5. 将使用过的玻璃珠丢弃至100%乙醇溶液中。将LB平板置于37 °C培养箱中过夜培养。
    6. 作为可选步骤，可使用可见光成像系统对LB平板进行成像（FluorChem 8900；Alpha Innotech）。随后可在平板本身或通过Photoshop软件（Adobe Photoshop CS3）中的计数工具，对平板或图像上的菌落数量进行计数。
    7. 使用以下公式计算每只果蝇的菌落形成单位（CFU）数量：[n /(N *D *v)]*V；其中n = LB平板上生长的菌落数量；N = 单个微量离心管中混合的果蝇数量；D = 稀释倍数；v = 涂布到每个平板上的溶液体积；V = 匀浆液的初始体积。

4. 感染后评估睡眠与生存持续时间

  1. 对于不用于测定细菌载量的果蝇，继续监测其行为7至10天。果蝇的存活时间受其基因型、环境条件以及感染所用细菌种类的影响。
  2. 约10天后终止实验，并按照先前所述方法下载和处理行为学数据6。Insomniac2 是基于 Matlab 开发的定制软件，用于分析睡眠参数。在行为学分析中必须排除已死亡果蝇的数据。通常情况下，分析仅限于感染后的第一天内进行，具体时间取决于感染类型和果蝇基因型。实验中果蝇死亡的标志是所有活动计数均降至零的时间点。为便于生存分析，使用基于 Microsoft Visual C++ 6.0 编写的定制软件 Drosonex 处理由 Trikinetics DAM 系统生成的原始数据文件。该软件可将每只果蝇的存活时间（以小时为单位）导出为 Excel 文件，将所有监测装置的活动数据整合至单个电子表格中，并根据用户设定的时间点报告随时间变化的存活果蝇百分比。这些 Excel 文件设计为可直接导入其他统计软件包进行进一步分析。

5. 利用荧光素酶报告基因检测法在感染过程中测定 NFκB 活性

本实验所用的转基因κB-luc果蝇系此前已如Kuo et al., 20102所述构建。简言之，κB-luc报告基因包含8个重复的NFκB结合序列，插入至荧光素酶开放阅读框上游的启动子区域中。

  1. 按照第1.2节所述，将果蝇调整至实验所需的光照条件。在此示例中，将1-4日龄的κB-luc果蝇饲养于含有5%蔗糖、2%琼脂培养基的试管中，并置于持续光照（LL）条件下2天，使其与其他实验组果蝇达到相同日龄。
  2. 准备一个96孔微孔板用于饲养果蝇。每个孔包含两层培养基（图2）；上层含有荧光素酶底物——荧光素。向每孔加入300 μl的5%蔗糖、2%琼脂溶液，待其凝固。随后，向每孔加入50 μl上层溶液，其中含5%蔗糖、1%琼脂和2 mM荧光素（Gold BioTechnology, Inc.）。文献中用于测量黑腹果蝇（Drosophila）报告基因活性的荧光素浓度有所不同，最低可至100 μM13。所需浓度可通过实验确定。在添加各层培养基之间，用细网布覆盖微孔板，以促进干燥同时保持无菌状态。微孔板应充分干燥（最长可达一小时），以防止果蝇被困在冷凝水滴中。由于荧光素对光敏感，应尽量避免不必要的光照暴露。
  3. 将透明粘性封膜（Top-Seal-A；Perkin Elmer）贴附于96孔微孔板上，并使用细针在每个孔处穿刺两个小孔。这些小孔不仅可实现每个孔的气体交换，还可用于单独麻醉果蝇。使用锋利刀片和直边工具，在每列之间切开一条缝隙，以便每次以8只为一组方便地装载或卸载果蝇。
    装载果蝇时，从培养箱中取出试管，在CO2麻醉垫上麻醉果蝇。逐个将果蝇按列依次放入各孔中。若果蝇意外粘附于封膜上，请勿干预，通常其可自行脱困。将微孔板放回持续光照（LL）培养箱中，适应新环境并摄取荧光素底物，持续8-24小时。
  4. 培养细菌粘质沙雷氏菌（S. marcescens），并按前述方法制备感染用菌液。
  5. 通过连接低压CO2气路的移液器吸头对果蝇进行麻醉。将移液器吸头直接置于各孔上方的通气孔处。需注意控制CO2压力，确保足以麻醉果蝇但不会造成损伤。以每组八只为单位，将每只果蝇单独转移至CO2麻醉垫上，并按前述方法进行感染。感染后，将每只果蝇放回其原始孔位，并重新密封微孔板。
  6. 检测发光信号（TopCount-NXT Luminescence and Scintillation Counter；Perkin-Elmer）。TopCount发光检测仪配备有可堆叠的样品架，支持程序化自动连续读数，可在任意时长内按设定时间间隔进行（通常最长可达五天）。此功能并非所有仪器均具备，因此使用其他仪器进行实验时，数据采集频率可能较低。发光检测仪置于温控及光照程序受控的房间内。将微孔板装入堆叠架时，应将含果蝇的板夹在透明空白板之间，以确保果蝇接受光照。根据制造商说明设置光度计，至少连续24小时每小时采集一次读数。在此示例中，检测器设定为每孔读取10秒，结果以每秒计数（任意单位）表示，并对每孔取3次读数的平均值。将数据导出至电子表格，进行标准分析并绘制发光强度变化曲线图。

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结果

  1. 感染会促进睡眠。在此示例中，将 Canton-S (CS) 野生型果蝇和缺乏 NFκB 基因 Relish 的突变体果蝇（RelE20）14 分别装入两台 DAM2 活动监测仪中（每种基因型 n=32），并按上述方法进行感染。果蝇维持在持续光照条件下，以消除昼夜节律钟对行为和感染的影响2,7,8。RelE20 突变体已如先前所述与 CS 背景等基因化11。两组果蝇均感染了 S. marcescens，结果如图3所示。在某些情况下，增设一个操作对照组有助于区分操作本身与感染所引起的影响2。操作对照组经历与感染组相同的环境变化，包括从培养箱中取出并麻醉相同时间，但不接受注射。然而，在本例中，感染后 RelE20 突变体果蝇的睡眠时间明显少于 CS 对照组果蝇（图3A）。如前所述6，DAMS 实验还可测量其他行为参数，例如单位时间内的总活动次...

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讨论

本方案概述了一种研究行为（特别是睡眠）与免疫反应参数之间关联的方法。这些参数包括细菌载量、生存结局以及通过荧光素酶报告系统测定的NFκB活性。 体内这些参数共同提供了关于果蝇抵抗感染能力的信息。细菌载量和存活结果是免疫反应参数，涉及简单的测量方法 果蝇. RelE20 缺乏在免疫反应中起核心作用的NFκB转录因子的突变体，在细菌感染后会迅速死亡。对行为进行遗传学或其他方式的操控也可能影响这些免疫反应参数，可能通过影响NFκB自身的活性实现。例如，感染前的睡眠剥夺会增加基因表达水平 Relish mRNA，并相对于未剥夺组对照减少每只果蝇的菌落形成单位（cfu/fly）11时钟基因的突变体， 周期7 和 无时性8，也已被报道会降低感染期间的存活率以及细菌清除能力8进一步采用该方法的研究有望揭示行为可能影响免疫功能的机制。

此处所述的注射/感染操作步骤改编自Wu先前描述的...

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致谢

本研究工作由国家科学基金会（资助号 #IOS-1025627）和美国国立卫生研究院（资助号 #1R21NS078582-01）资助，项目负责人：J.A.W。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
培养箱Percival Scientific, Inc.I30BLLC8
I36VLC8		任何能够运行程序化光照/温度周期的培养箱均可使用。
Drosophila 活动监测仪Trikinetics Inc., Waltham, MADAM2如其他文献所述6，该系统需要配备计算机接口、软件及其他附件。
Pyrex 玻璃管Trikinetics Inc., Waltham, MAPGT-5x65
微孔板闪烁及发光计数仪Perkin ElmerTopCount NXT
12 检测器		任何能够检测发光信号的微孔板读板仪均可用于此类报告基因检测。TopCount 含多个检测器和自动堆叠器，可编程实现对多块微孔板的连续读取。
FluorChem 8900Alpha Innotech细菌培养物的成像为可选步骤；任何具备可见光成像功能的数字成像系统均可满足要求。
微量移液器拉针仪Tritech Research, Inc.Narishige PC-10
耗材
硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instrument Inc.1B100F-4
3 ml 注射器Fisher ScientificBD 305482
注射器针头Fisher ScientificBD 30519618 G —— 需剪除针头尖端，以防止对管路造成损伤。
硅胶管，内径 (0.030")，外径 (0.065")，壁厚 (0.018")VWR60985-706用于将玻璃毛细针连接至注射器
三通阀American Pharmaseal CompanyK75
Kontes 无绳电动研磨杵Fisher ScientificK749540-0000
Kontes 研磨杵头Fisher ScientificK749521-1590
玻璃珠，3 mmVWR26396-630
Microplate Microlite 1+ 微孔板Thermo Scientific7571应选择适用于发光检测的 96 孔板——必须为不透明板。
TopSeal-A：96 孔微孔板密封膜PerkinElmer6005185微孔板压敏粘性密封膜
D-荧光素钾盐Gold BioTechnology, Inc.LUCNA
软件
Insomniac2可向作者申请获取定制软件；由 Westminster College 的 Lesley Ashmore 博士编写基于 Matlab 的软件，已常规用于睡眠数据分析2,6,11
Drosonex可向作者申请获取定制软件；由 Sidewalk Software 的 Thomas Coradetti 编写一款 PC 平台 MSVC6 程序，用于对 Trikinetics 系统采集的原始数据进行生存分析
Photoshop CS3Adobe可用于从数字图像中获取每板菌落形成单位（cfu）的数量（可选）

参考文献

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果蝇免疫反应睡眠测量细菌清除NF-κB 活性运动活动监测生存分析菌落形成单位荧光素酶报告技术恒定光照条件果蝇感染方案
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