通过高通量 PCR 实现对Streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

摘要

以Streptococcus sanguinis为模式生物，建立了一种高效的全基因组范围单基因突变方法。该方法通过高通量重组PCR和转化实现。

摘要

转座子诱变和单基因敲除是细菌全基因组基因敲除中采用的两种方法 ^1,2尽管转座子诱变法耗时较短、成本较低，且无需完整的基因组信息，但该方法存在两个缺陷：（1）混合突变体文库中可能存在不同突变体之间的竞争失衡，导致竞争力下降的突变体被负向筛选；（2）转座子插入可能导致基因部分失活，而非完全丧失功能。单基因缺失分析可在一定程度上弥补转座子诱变法的这些不足。为提高全基因组范围单基因缺失的效率，我们尝试建立一种高通量的全基因组单基因缺失技术，利用 Streptococcus sanguinis 作为一种模式生物。每种基因敲除构建体在 S. sanguinis 基因组设计包含目标基因上游的1-kb区域，该 aphA-3 基因，编码卡那霉素抗性蛋白，以及目标基因下游1 kb的序列。针对每个缺失构建体的这三个组分，分别设计并合成了三组引物F1/R1、F2/R2和F3/R3，并以96孔板形式进行PCR扩增。引物R1和F3包含25 bp的序列，分别与目标区域互补 aphA-3 基因的5'端。大规模PCR扩增 aphA-3 基因仅需操作一次即可构建所有单基因敲除载体。该基因的启动子 aphA-3 基因最初被排除在外，以尽量减少卡那霉素抗性盒可能产生的极性效应。为了构建基因敲除载体，采用96孔板格式进行高通量PCR扩增和纯化。每个基因敲除所用的线性重组PCR扩增片段将通过四轮PCR反应，使用高保真DNA聚合酶制备。初始对数生长期的 S. sanguinis 在添加了2.5%灭活马血清的Todd Hewitt肉汤中培养，以提高对PCR重组构建体转化的感受态。在此条件下，最高可达20%的 S. sanguinis 可使用约 50 ng 的 DNA 进行细胞转化。基于该方法，最终从 2,270 个基因中获得了 2,048 个单基因敲除突变体。 S. sanguinis 排除完全包含在其他开放阅读框内的四个基因的开放阅读框 S. sanguinis SK36 和 218 个潜在必需基因。构建基因缺失载体的技术具有高通量特性，可简便地用于任何可转化细菌的全基因组范围单基因缺失。

方案

1. 引物设计

1. 引物是使用基于内部脚本设计的 S. sanguinis SK36 基因组序列。设计三对引物 F1/R1、F2/R2 和 F3/R3，用于扩增目的基因上游 1-kb 的序列 aphA-3 编码卡那霉素抗性的基因（Km^r）蛋白³ 以及目标基因下游的1-kb序列（图1）。在这些引物中，F1 和 R3 是使用 EMBOSS 程序套件中的 ePrimer3 设计的（http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html）以扩增目标基因上游或下游的侧翼区域。根据目标基因的 5' 和 3' 序列设计基因特异性引物 R1 和 F3。R1 和 F3 引物在其 5' 端含有 25 个碱基的接头序列，该序列与 aphA-3 基因。每对引物的熔解温度均设计为尽可能接近60 °C，以便在96孔板格式的所有PCR反应中使用统一的退火温度。
2. 根据基因顺序，在96孔板中合成F1、R1、F3和R3引物。每块板包含相同基因顺序的一种引物类型。使用多通道移液器将引物稀释至96孔工作引物板中，用于PCR扩增，终浓度为10 μM。

结果

使用引物 F1 和 R1 以及 F3 和 R3 进行 PCR 扩增后，分别以 96 孔板形式获得了每个 S. sanguinis 基因上下游约 1 kb 的片段（图 2A）。在本研究的 PCR 条件下，使用设计的引物，每个 PCR 反应均能从 S. sanguinis 基因组 DNA 中扩增出特异性产物。该结果表明，这些引物对 S. sanguinis 的靶标具有高度特异性。通过以三个扩增产物作为 DNA 模板，使用引物 F1 和 R3 进行 PCR 重新扩增，在 96 孔板上高通量地构建了线性重组 PCR 产物（约 3 kb），其结构依次包含每个目标基因上游区域、卡那霉素抗性盒以及每个目标基因下游区域（图 2B）。随后将这些重组 PCR 构建体转化至 S. sanguinis SK36 菌株，并在 BHI 琼脂平板上通过卡那霉素筛选。在大多数转化实验中，经过微需氧条件下 2 天培养后，每块平板可获得超过 1000 个菌落。当使用引物 F1 和 R3 对这些菌落进行 PCR 扩增时，凝胶电泳结果显示.......

讨论

为了尽量减少用外源性抗生素基因替换目标基因时可能对邻近基因产生的极性效应，在初始引物设计过程中采取了两个步骤。对于大多数被删除的基因，引物R1和F3的设计旨在删除从起始密码子后6个碱基开始至终止密码子前30个碱基之间的编码区。保留最后30个碱基对，以保护下游相邻基因可能使用的核糖体结合位点。当两个相邻基因位于相反方向且两种蛋白质的N端彼此靠近时，两基因之间的保留区域扩展至100个碱基对，以避免删除潜在的启动子区域。aphA-3基因的启动子在用于基因删除的重组构建体中被排除⁵。在aphA-3基因中引入了一个核糖体结合位点以实现翻译。为了验证我们的策略，我们随机构建了10个和随后96个等位交换突变株。在卡那霉素筛选平板上分别获得了10个和93个突变株，表明在大多数情况下，无启动子的aphA-3基因能够良好表达。随后，我们为S. sanguinis基因组中所有基因的删除设计并合成了针对无启动子aphA-3基因的引物。然而，我们发现S. sanguinis中某些基因表达水平较低或不表达，这可能会影响无启动子a.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
引物 F2	Integrated DNA Technologies		TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
引物 R2	同上		CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
引物 F2p	同上		GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
引物 P1	同上		GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
引物 P2	同上		GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
引物 5' 端_R1_seq	同上		GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
引物 5' 端_F3_seq	同上		GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
引物 5' 端_R1p_seq	同上		CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep		序列：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA 聚合酶	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA 聚合酶高保真体系
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	限制性内切酶
琼脂	American Bioanalytical	AB01185
琼脂糖	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	脑心浸液培养基
马血清	Fisher Scientific	SH3007403	马血清
Km	Fisher Scientific	BP906-5	卡那霉素
TH 肉汤	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt 肉汤
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR 纯化试剂盒
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR 纯化试剂盒
滤器	Corning	431117	0.22 μm 聚苯乙烯滤膜
Anoxomat 系统	Mart Microbiology b.v.	Anoxomat Mark II
台式离心机	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus 微孔板转子
凝胶成像系统	UVP LLC	BioDoc-It 210
培养箱	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet's Gel XL	Labnet	E0160	Labnet's Gel XL
微量离心机	Eppendorf	22621408	Microcentrifuge 5415 R
多通道移液器	Thermo Scientific	4661040, 4661020	Finnpipette F1
PCR 仪	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR 系统 9700