通过高通量 PCR 实现对Streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

摘要

以Streptococcus sanguinis为模式生物，建立了一种高效的全基因组范围单基因突变方法。该方法通过高通量重组PCR和转化实现。

摘要

转座子诱变和单基因敲除是细菌全基因组基因敲除中采用的两种方法 ^1,2尽管转座子诱变法耗时较短、成本较低，且无需完整的基因组信息，但该方法存在两个缺陷：（1）混合突变体文库中可能存在不同突变体之间的竞争失衡，导致竞争力下降的突变体被负向筛选；（2）转座子插入可能导致基因部分失活，而非完全丧失功能。单基因缺失分析可在一定程度上弥补转座子诱变法的这些不足。为提高全基因组范围单基因缺失的效率，我们尝试建立一种高通量的全基因组单基因缺失技术，利用 Streptococcus sanguinis 作为一种模式生物。每种基因敲除构建体在 S. sanguinis 基因组设计包含目标基因上游的1-kb区域，该 aphA-3 基因，编码卡那霉素抗性蛋白，以及目标基因下游1 kb的序列。针对每个缺失构建体的这三个组分，分别设计并合成了三组引物F1/R1、F2/R2和F3/R3，并以96孔板形式进行PCR扩增。引物R1和F3包含25 bp的序列，分别与目标区域互补 aphA-3 基因的5'端。大规模PCR扩增 aphA-3 基因仅需操作一次即可构建所有单基因敲除载体。该基因的启动子 aphA-3 基因最初被排除在外，以尽量减少卡那霉素抗性盒可能产生的极性效应。为了构建基因敲除载体，采用96孔板格式进行高通量PCR扩增和纯化。每个基因敲除所用的线性重组PCR扩增片段将通过四轮PCR反应，使用高保真DNA聚合酶制备。初始对数生长期的 S. sanguinis 在添加了2.5%灭活马血清的Todd Hewitt肉汤中培养，以提高对PCR重组构建体转化的感受态。在此条件下，最高可达20%的 S. sanguinis 可使用约 50 ng 的 DNA 进行细胞转化。基于该方法，最终从 2,270 个基因中获得了 2,048 个单基因敲除突变体。 S. sanguinis 排除完全包含在其他开放阅读框内的四个基因的开放阅读框 S. sanguinis SK36 和 218 个潜在必需基因。构建基因缺失载体的技术具有高通量特性，可简便地用于任何可转化细菌的全基因组范围单基因缺失。

方案

1. 引物设计

1. 引物是使用基于内部脚本设计的 S. sanguinis SK36 基因组序列。设计三对引物 F1/R1、F2/R2 和 F3/R3，用于扩增目的基因上游 1-kb 的序列 aphA-3 编码卡那霉素抗性的基因（Km^r）蛋白³ 以及目标基因下游的1-kb序列（图1）。在这些引物中，F1 和 R3 是使用 EMBOSS 程序套件中的 ePrimer3 设计的（http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html）以扩增目标基因上游或下游的侧翼区域。根据目标基因的 5' 和 3' 序列设计基因特异性引物 R1 和 F3。R1 和 F3 引物在其 5' 端含有 25 个碱基的接头序列，该序列与 aphA-3 基因。每对引物的熔解温度均设计为尽可能接近60 °C，以便在96孔板格式的所有PCR反应中使用统一的退火温度。
2. 根据基因顺序，在96孔板中合成F1、R1、F3和R3引物。每块板包含相同基因顺序的一种引物类型。使用多通道移液器将引物稀释至96孔工作引物板中，用于PCR扩增，终浓度为10 μM。

2. 高通量 PCR 扩增与纯化

1. 为了高通量扩增目标 S. sanguinis 基因上游或下游1 kb的片段，需在冰上于15 ml锥形管中配制PCR混合液，其中包含1640 μl ddH₂O、250 μl 10x高保真PCR缓冲液、200 μl 10 mM dNTP混合物、100 μl 50 mM MgSO₄、100 μl 10 ng/μl S. sanguinis SK36基因组DNA以及10 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。使用多通道移液器将23 μl该混合液转移至96孔PCR板的每个孔中。再使用多通道移液器将10 μM工作浓度引物板中的F1和R1（或F3和R3）各1 μl转移至PCR板对应孔中。密封PCR板后进行扩增：94 °C预变性1分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、54 °C退火30秒、68 °C延伸1.5分钟。
2. 制备含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶，凝胶需具有48个孔以适配多通道移液器加样。在96孔板中将4 μl PCR产物与1 μl 5x DNA上样缓冲液混合，使用10 μl多通道移液器将样品加入琼脂糖凝胶孔中。以135 V电压电泳30分钟，随后在UVP凝胶成像与分析系统下观察条带。
3. 按照生产商说明书，使用PureLink 96 PCR纯化试剂盒并通过离心法对PCR产物进行纯化。洗脱DNA时，向结合板的每个孔中加入40 μl无菌ddH₂O。
4. 随机选取板上若干纯化后的扩增产物，使用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度，并将板上所有扩增产物的浓度调整至约10 ng/μl。
5. 使用EcoRI酶切含有Km^r抗性盒的质粒作为PCR模板。酶切后的质粒通过QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，并将线性质粒DNA的浓度调整至最终10 ng/μl。配制25 μl的Km^r抗性盒扩增反应体系，包括16.4 μl ddH₂O、2.5 μl 10x高保真PCR缓冲液、2 μl 10 mM dNTP混合物、1 μl 50 mM MgSO₄、1 μl 10 μM F2引物、1 μl 10 μM R2引物、1 μl线性质粒DNA以及0.1 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94 °C预变性1分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、68 °C延伸1分钟。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将10个独立PCR反应所得的Km^r抗性盒扩增产物经QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后合并成一批。将合并后的扩增产物浓度调整至10 ng/μl。
6. 为获得最终的线性重组PCR扩增产物，将三个PCR扩增片段（每种取1 μl，近似等摩尔量）混合于同一PCR板孔中作为PCR模板。加入其余PCR组分：14.4 μl ddH₂O、2.5 μl 10x高保真PCR缓冲液、2 μl 10 mM dNTP混合物、1 μl 50 mM MgSO₄、1 μl 10 μM F1引物、1 μl 10 μM R3引物以及0.1 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94 °C预变性2分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、68 °C延伸3.5分钟，最后在68 °C延伸4分钟。
7. 在琼脂糖凝胶上检测PCR扩增产物。按照前述方法对PCR扩增产物进行纯化和定量，并将重组后的PCR扩增产物于-20 °C保存。

3. 感受态细胞的制备

1. 制备Todd Hewitt肉汤，用10 N NaOH调节pH至7.6，加热至沸腾后冷却至室温，并使用0.22 μm聚苯乙烯滤器进行灭菌⁴。在15 ml锥形管中，向11.7 ml Todd Hewitt肉汤中加入300 μl热灭活的马血清（终浓度为2.5%），配制成TH+HS培养基。将TH+HS培养基分装为每管2 ml和10 ml。
2. 取5 μl保存于-80 °C的S. sanguinis SK36菌种接种至2 ml TH+HS培养基中，于37 °C紧密封盖培养过夜，同时将10 ml TH+HS培养基管预温育。
3. 过夜培养后，取50 μl菌液转接至10 ml TH+HS培养基中，于37 °C继续培养3小时（对应OD₆₆₀为0.07–0.08），立即用于转化实验。

4. 细胞转化与抗生素筛选

1. 在96孔板上的EP管中加入2 μl 70 ng的S. sanguinis SK36感受态刺激肽（CSP）和2 μl线性重组PCR扩增产物（约50 ng），并在37 °C预热。将330 μl培养3小时的SK36菌液转移至各管中，在37 °C孵育1小时。以无菌ddH₂O代替DNA作为对照。
2. 将96孔板置于冰上，取100 μl各转化产物涂布于含500 μg/ml卡那霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上。在37 °C微需氧条件下孵育2天。

5. 突变体验证与保存

1. 对每个替换突变株，随机挑取2个单菌落，接种至含有500 μg/mL卡那霉素的5 mL BHI培养基中，于37 °C微需氧条件下过夜培养。将每种培养物用30%甘油在-80 °C条件下冷冻保存。
2. 为检测突变株是否含有预期的基因替换，使用F1和R3引物在96孔PCR板中对每个突变株进行菌落PCR。以单个菌落的约1 μl过夜培养物作为DNA模板，进行25 μl的PCR扩增反应。PCR程序为：94 °C预变性5 min；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30 sec、55 °C退火30 sec、68 °C延伸3.5 min；最后68 °C延伸4 min。
3. 为了准确鉴定双条带突变体或污染的PCR扩增子，将PCR扩增子进行电泳分析，电泳时间为4小时 >12 cm长的含溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶。在此琼脂糖凝胶电泳条件下，任何长度差异≥100 bp的扩增产物均可被清晰识别。当扩增产生的条带来源于Km^r cassette 与野生型基因的预期差异在于 < 100 bp，使用内部T1引物通过PCR检测是否可扩增出野生型基因。
4. 为进一步确认该缺失，使用 PureLink 96 PCR 纯化试剂盒纯化扩增产物，并利用结合 Km 的 P1 引物进行测序^r 胶卷盒。仅保留经测序确认的正确突变体。

结果

使用引物 F1 和 R1 以及 F3 和 R3 进行 PCR 扩增后，分别以 96 孔板形式获得了每个 S. sanguinis 基因上下游约 1 kb 的片段（图 2A）。在本研究的 PCR 条件下，使用设计的引物，每个 PCR 反应均能从 S. sanguinis 基因组 DNA 中扩增出特异性产物。该结果表明，这些引物对 S. sanguinis 的靶标具有高度特异性。通过以三个扩增产物作为 DNA 模板，使用引物 F1 和 R3 进行 PCR 重新扩增，在 96 孔板上高通量地构建了线性重组 PCR 产物（约 3 kb），其结构依次包含每个目标基因上游区域、卡那霉素抗性盒以及每个目标基因下游区域（图 2B）。随后将这些重组 PCR 构建体转化至 S. sanguinis SK36 菌株，并在 BHI 琼脂平板上通过卡那霉素筛选。在大多数转化实验中，经过微需氧条件下 2 天培养后，每块平板可获得超过 1000 个菌落。当使用引物 F1 和 R3 对这些菌落进行 PCR 扩增时，凝胶电泳结果显示...

讨论

为了尽量减少用外源性抗生素基因替换目标基因时可能对邻近基因产生的极性效应，在初始引物设计过程中采取了两个步骤。对于大多数被删除的基因，引物R1和F3的设计旨在删除从起始密码子后6个碱基开始至终止密码子前30个碱基之间的编码区。保留最后30个碱基对，以保护下游相邻基因可能使用的核糖体结合位点。当两个相邻基因位于相反方向且两种蛋白质的N端彼此靠近时，两基因之间的保留区域扩展至100个碱基对，以避免删除潜在的启动子区域。aphA-3基因的启动子在用于基因删除的重组构建体中被排除⁵。在aphA-3基因中引入了一个核糖体结合位点以实现翻译。为了验证我们的策略，我们随机构建了10个和随后96个等位交换突变株。在卡那霉素筛选平板上分别获得了10个和93个突变株，表明在大多数情况下，无启动子的aphA-3基因能够良好表达。随后，我们为S. sanguinis基因组中所有基因的删除设计并合成了针对无启动子aphA-3基因的引物。然而，我们发现S. sanguinis中某些基因表达水平较低或不表达，这可能会影响无启动子a...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
引物 F2	Integrated DNA Technologies		TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
引物 R2	同上		CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
引物 F2p	同上		GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
引物 P1	同上		GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
引物 P2	同上		GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
引物 5' 端_R1_seq	同上		GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
引物 5' 端_F3_seq	同上		GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
引物 5' 端_R1p_seq	同上		CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep		序列：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA 聚合酶	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA 聚合酶高保真体系
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	限制性内切酶
琼脂	American Bioanalytical	AB01185
琼脂糖	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	脑心浸液培养基
马血清	Fisher Scientific	SH3007403	马血清
Km	Fisher Scientific	BP906-5	卡那霉素
TH 肉汤	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt 肉汤
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR 纯化试剂盒
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR 纯化试剂盒
滤器	Corning	431117	0.22 μm 聚苯乙烯滤膜
Anoxomat 系统	Mart Microbiology b.v.	Anoxomat Mark II
台式离心机	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus 微孔板转子
凝胶成像系统	UVP LLC	BioDoc-It 210
培养箱	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet's Gel XL	Labnet	E0160	Labnet's Gel XL
微量离心机	Eppendorf	22621408	Microcentrifuge 5415 R
多通道移液器	Thermo Scientific	4661040, 4661020	Finnpipette F1
PCR 仪	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR 系统 9700