从小鼠心脏中分离原代类似黑色素细胞的细胞

摘要

在本方案中，w我们在小鼠和人类心脏中鉴定出一种新型的类黑色素细胞（亦称心脏黑色素细胞），这类细胞可诱发小鼠心房心律失常。 

摘要

我们在小鼠和人类心脏中鉴定出一种新型的类黑色素细胞（也称为心脏黑色素细胞），这些细胞在小鼠中可引发心房心律失常。为了研究心脏黑色素细胞的电生理和生物学特性，我们开发了一种从小鼠心脏中分离此类细胞的方法，该方法借鉴了用于分离新生小鼠心肌细胞的技术。为了获得更适合进行更广泛膜片钳或生物化学研究的健康心脏黑色素细胞，我们进一步优化了分离与铺板方法，其基础是最初设计用于分离皮肤黑色素细胞的方案。本文综述中展示了这一优化后的操作流程，可获得数量更多、状态良好的类黑色素细胞，这些细胞可作为纯细胞群进行培养，也可与心肌细胞共培养。

引言

我们近期在小鼠和人类心脏中鉴定出一种表达黑色素合成酶且在形态上类似于皮肤黑色素细胞的新型细胞群体。我们将这些细胞称为“心脏黑色素细胞”，并发现它们存在于人体心房心律失常触发灶常见的解剖位置。我们还发现，在Dct基因种系敲除的小鼠中，心脏黑色素细胞可促进心房心律失常的发生。心脏黑色素细胞在小鼠心房中分布稀疏，占所有心房细胞的比例不足0.1%。为了研究心脏黑色素细胞的电生理和生物学特性，我们开发了一种利用Cre诱导型黑色素细胞特异性标记物从小鼠心脏中分离此类细胞的方法。我们最初的方法借鉴了新生小鼠心肌细胞的分离方案，但仅能获得极少量适用于膜片钳记录或PCR分析的细胞。然而，为了提高心脏黑色素细胞的健康状态和存活率，以便进行更深入的电生理分析或生化研究，我们进一步优化了该方法，参考了皮肤黑色素细胞的分离方案。本综述中描述并演示的这一改进方案能够获得活性更高的心脏黑色素细胞，可用于纯细胞群体培养，或与心肌细胞共培养。

方案

1. 准备必要的溶液和设备

1. 首先，将手术器械（直形镊子、弯形镊子、直形剪刀和弯形剪刀）在121 °C条件下高压灭菌15分钟。准备两套器械，其中一套用于解剖心脏，另一套用于剪碎组织。
2. 将1包MCDB153培养基溶解于900 ml无菌过滤水中，缓慢搅拌至粉末完全溶解。每配制1升终体积的培养基，加入1.2 g碳酸氢钠或15.7 ml碳酸氢钠溶液[7.5% w/v]，搅拌至溶解。用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至7.2，然后在组织培养超净台（生物安全柜）内无菌条件下，通过0.2 μm瓶顶滤器过滤培养基。收集培养基并储存在4 °C条件下。
3. 准备需添加至培养基中的补充成分（见材料清单）。这些补充成分应在细胞接种前立即加入培养基中。
4. 配制含10%胎牛血清（FBS）及抗生素（青霉素和链霉素）的DPBS溶液。
5. 接下来，通过将0.25 g胰蛋白酶（牛胰腺来源，活性> 2,500 USP单位/mg，超纯；USB）加入含抗生素（青霉素和链霉素）的100 ml DPBS中，制备0.25%的胰蛋白酶溶液。
6. 完成本实验所需的其他设备包括：体视显微镜、培养皿（10 cm）、50 ml锥形管、40 μm细胞筛、含抗生素的DPBS、60 mm培养皿和35 mm培养皿。

2. 分离新生小鼠幼崽的心脏

1. 首先，获取出生后0至2天（P0至P2）的新生小鼠仔鼠（n=6至8只）。建议使用Dct-Cre纯合雌鼠与携带R26R:EYFP等位基因或Z/EG等位基因的杂合雄鼠交配产生的仔鼠，以标记类黑素细胞。R26R:EYFP和Z/EG小鼠均可从Jackson Laboratories获得（货号分别为006148和003920）。
2. 接下来，处死新生小鼠，用酒精棉片擦拭其胸部，然后将小鼠置于一个10 cm的培养皿中 含DPBS的培养皿
3. 用无菌镊子和剪刀切开胸部和胸骨处的皮肤，然后在体视显微镜下小心打开胸腔。新生小鼠幼崽的心脏非常小，因此需仔细操作，确保将带有心房的整个心脏完整取出。
4. 用DPBS清洗心脏，并将其转移至新的10 cm培养皿中 培养皿

3. 酶消化

1. 将装有离体心脏的培养皿带入组织培养罩（生物安全柜）中，然后在罩内使用无菌技术按以下步骤操作。
2. 首先，用含抗生素的无菌DPBS洗涤心脏三次。
3. 将心脏（n=6-8）放入一个60 mm的培养皿中，并向皿中加入6-8 ml的0.5%胰蛋白酶溶液。
4. 接着，将心脏切成小块（尺寸小于1 mm），并在5% CO₂气氛中于37 °C孵育30分钟。
5. 孵育结束后，将培养皿中的心肌组织与胰蛋白酶混合液倒入一个无菌的50 ml锥形管中。
6. 然后，使用10 ml无菌移液管，在50 ml锥形管中快速但轻柔地吹打溶液30-50次。
7. 将所得溶液通过置于新的洁净50 ml锥形管上方的40 μm细胞筛网过滤，以收集滤液。
8. 接下来，将50 ml管在台式离心机中以240 × g 在室温下离心5分钟。然后，轻轻吸除上清液，并将沉淀物重悬于6-8 ml无菌DPBS中。重复此步骤2次。此步骤可沉淀心房肌细胞和心肌黑色素细胞，但不会沉淀成纤维细胞，因为成纤维细胞较小，会保留在上清液中。

4. 接种心源性黑色素细胞样细胞

1. 离心后第三次清洗结束时，小心弃去或吸除洗涤液（DPBS），并将沉淀重悬于6 ml已添加补充物的MCDB培养基中。
2. 用无菌移液管吸取重悬的细胞悬液，将细胞接种至35 mm培养皿或6孔板的一个孔中，并将3只新生小鼠分离得到的心脏细胞合并培养于同一个35 mm培养皿或孔中。
3. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜培养，随后吸除培养基及未贴壁的细胞，用DPBS洗涤一次，再向培养皿中加入新鲜培养基，并每2天更换一次培养基。新生或胚胎心脏分离的细胞可在体外培养中维持长达3周，而成年心脏分离的细胞则可维持培养长达10天。

5. 从成年小鼠心脏中分离类黑色素细胞

1. 首先，在小鼠腹腔注射100 U肝素后，通过中线胸骨切开术处死小鼠（建议使用戊巴比妥处死小鼠，但该药物并非在所有地区均可获得），取出成年小鼠（3–4周龄，n=3）的心脏。
2. 接着，在组织培养罩（生物安全柜）中，用含抗生素的无菌DPBS清洗切除的心脏。用弯头解剖镊轻轻挤压心脏，以去除残留血液，然后再次用DPBS冲洗心脏一次。
3. 从心脏上切除心房及房室环（这些结构中含有类黑色素细胞），并将切除的组织样本置于35 mm培养皿中。
4. 使用弯头剪刀和镊子将心脏切成小块，然后向培养皿中加入6–8 ml的0.5%胰蛋白酶溶液。随后将培养皿在37 °C条件下孵育45–60分钟。
5. 现在，从上述实验步骤的第3.6步开始，继续执行后续操作。

结果

本文所述方案相较于我们先前发表的从小鼠心脏分离心肌黑色素细胞的技术有所改进。该方法利用由黑色素合成酶特异性 Cre 重组酶驱动的荧光标记物来标记心脏中的黑色素样细胞。在处理新鲜分离的胚胎期或新生期细胞时，使用标记物标记心肌黑色素细胞尤为重要，因为此时心肌黑色素细胞与心房肌细胞之间用于区分的形态学差异尚未发育形成（图 1A）。如 图 1A 所示，当分离步骤成功时，会有相当数量的心房肌细胞和心肌黑色素细胞黏附于层粘连蛋白包被的培养皿上，仅有少量细胞不黏附。在此情况下，黏附的细胞会紧贴培养皿底部并呈现扁平状（黄色箭头，图 1A，箭头）。相反，若实验操作不理想，则大多数细胞将无法黏附，且常表现为球形或圆缩状（浅蓝色箭头，图 1A）。

利用绿色荧光成像观察分离的细胞时，可以清楚区分哪些是心脏黑色素细胞，哪些是心房肌细胞（图1）。如上述实验步骤（步骤3.9）所述，通过低速离心去除心房细胞悬液中的成纤维细胞：较大的心房肌细胞和心...

讨论

心脏黑色素细胞存在于心脏中常引发房性心律失常触发灶的解剖部位，这些区域包括肺静脉、房室环、左心房后壁以及卵圆孔（图4）。为了理解这些细胞在心律失常发生中的作用，我们开发了分离这些细胞并研究其生理特性的技术。然而，我们认识到，若能改进该技术以获得更健康且数量更多的心脏黑色素细胞，将有助于进一步研究心脏黑色素细胞对外源性刺激的反应。此外，改进的分离技术还可能支持研究心脏黑色素细胞在正常生理状态及疾病状态下与心房肌细胞之间的相互作用。

本文介绍了一种从小鼠心脏中分离出具有活性的类黑素细胞的方法，该方法基于我们设计的从皮肤分离黑素细胞的实验方案。本方案的关键步骤是从心脏中提取类黑素细胞。虽然从新生小鼠心脏中分离心脏黑素细胞相对简单，但由于成熟心脏间质纤维化程度更高，从中提取心脏黑素细胞要困难得多。在本方案中，我们采用胰蛋白酶消化法从小鼠成熟心脏中提取类黑素细胞。为了优化该方案，我们测试了多种不同的酶组合，其中包括不同浓度的胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶。

我们发现，使用胶原酶（前30分钟）和胰蛋白酶（随...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	溶于水
不含钙和镁的DPBS	Invitrogen	14190136	储存浓度：1x 工作浓度：1x
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140163	储存浓度：100x 工作浓度：1x
胎牛血清	Life Technology	认证合格	工作浓度：4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	溶于DMSO 储存浓度：3.2 μM 工作浓度：32 nM
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T8158	溶于DPBS 储存浓度：0.1 mg/ml 工作浓度：1 μg/ml
二丁酰环磷酸腺苷	Sigma-Aldrich	D0627	溶于DPBS 储存浓度：0.5 mM 工作浓度：5 μM
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634	溶于10 mM乙酸 储存浓度：1 mg/ml 工作浓度：5 μg/ml
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	BD Biosciences	354060	溶于水 储存浓度：4 ng/μl 工作浓度：4 ng/ml