我们介绍一种在培养条件下维持人肠道黏膜并监测其对多种刺激反应的新方法，监测时间至少可达24小时。采用本方法可维持组织的极性，从而实现通过顶端途径进行生理性的刺激。
本文内容
摘要
摘要
目前很少有模型能够真实模拟复杂的人类肠道微环境，在该环境中会发生多种相互作用。正常的稳态直接依赖于这些相互作用，因为它们可塑造完整的免疫应答，一方面对食物抗原诱导耐受，另一方面对随食物意外摄入的致病微生物启动有效的免疫反应。
肠道稳态的维持还依赖于微生物群（包括食物相关有益菌株）与宿主之间多种复杂的相互作用，这些相互作用调控着黏液的黏附与降解、上皮屏障产生抗菌肽的过程，以及上皮细胞的“教育”过程，从而控制肠道定居淋巴细胞群体的耐受性或免疫原性表型。迄今为止，使用培养的细胞系或外周血单个核细胞进行的体外实验（in vitro）极难重现这些相互作用。此外，小鼠模型在肠道黏膜的多个组分（如黏液层结构、共生菌群组成）方面与人类肠道存在显著差异。因此，针对肠易激综合征、炎症性肠病或结直肠癌等重要应激相关或病理状况的多种临床治疗方案的研究一直难以开展。
为了解决这些问题，我们开发了一种新型系统，能够以极化方式刺激保留了宿主微生物群和免疫反应在体条件作用的人肠道黏膜外植体。极化的顶端刺激对于所引发的免疫反应结果具有重要意义。已有大量研究表明，相同的刺激物在绕过肠上皮顶端面、从基底侧刺激上皮细胞或直接与固有层组分接触时，可能产生完全不同的反应，导致免疫表型从耐受性转变为免疫激活性，并在局部引发不必要的过度炎症。
我们通过在黏膜顶端表面粘附一个洞穴状圆柱体来实现极化刺激，该圆柱体限定了刺激区域，具体操作将在实验方案中描述。我们利用此模型研究了三种不同乳杆菌（Lactobacilli）菌株的差异性效应。结果表明，该模型系统在评估益生菌于健康与疾病状态下的免疫调节特性方面具有很强的实用性。
方案
1. 组织的获取与准备
- 组织（健康或炎症性肠病黏膜）在手术期间获取。一旦标本被切除，应尽快转移至实验室，并保持其在含钙溶液中++/毫克++含青霉素/链霉素的无钙镁HBSS缓冲液，4 °C或冰上保存。
*样本的大小取决于组织的可获得性：所获取的组织部分严格限定为诊断不需要的组织，且在健康个体与炎症性肠病（IBD）患者之间可能存在很大差异。健康组织取自因结肠癌接受手术的患者。
- 轻轻冲洗组织，清除所有肠系膜物质。在培养皿中使用无菌剪刀和镊子将黏膜层与黏膜下层分离，期间将组织保持在HBSS缓冲液中（不必完全浸没）。尽量减少镊子接触黏膜表面。
- 将黏膜切成至少1 cm宽、尽可能长的条状。使用两把无菌手术刀，操作方式类似于切割食物。
- 用HBSS轻柔清洗干净的黏膜，并将其展开放置于培养皿中，使顶侧朝上。
2. 组织切片的固定
- 配制新鲜培养基（tisDMEM）。使用添加谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM）的DMEM，在使用时加入15%北美胎牛血清（FBS-Na）、1% ITS-X 和 200 ng/ml EGF。
- 用剩余的FBS-Na填充一个10 cm的培养皿（约使用30 ml，使金属网格完全浸没），并将金属网格浸入其中。保持培养皿敞开，将塑料圆筒支撑在皿盖上。
*金属网格由铁制成。网孔为方形，边长为0.5 mm。
- 用10或20 μl移液器吸取3 μl手术胶。用镊子牢固夹住塑料圆筒，同时小心地将胶水涂抹至其边缘之一。
- 轻轻将圆筒放置于黏膜的顶端侧，尽可能靠近组织条的一侧边缘。
- 为使胶水有足够时间牢固黏附圆筒与组织，同时准备中心小室的器官培养板：在中心小室中加入850 μl–1 ml培养基，并将金属网格支撑于培养板中心小室的边缘上。
- 使用两把无菌手术刀，如前所述，切除圆筒边缘多余的组织。
- 轻轻提起附着组织的圆筒，将其基底外侧放置于培养板中心的金属网格上。
3. 刺激
- 使用您选择的刺激物及其适宜浓度。
- 将适量体积加至塑料圆筒中心，注意移液枪头不要触碰圆筒或黏膜表面。确保所加液体均匀覆盖圆筒内部表面。推荐加样体积：
大号塑料圆筒：200 μl
中号塑料圆筒：100 μl
小号塑料圆筒：50 μl - 在常规培养箱中孵育，最长不超过 3 小时。
*如果希望延长孵育时间，请务必使用更小体积的刺激物（10-20 μl），并将组织直接置于1 Atm压力、100% O2的环境中（参见3.5）。
- 移除组织顶面的含刺激物培养基，切勿更换新鲜培养基，因为若在顶面保留较厚的液体层，会阻碍气体交换，导致组织无法获得足够的 O2。盖好培养板。
- 将组织置于 1 Atm 压力、100% O2 的环境中。
4. 收获
- 总培养时间达 24 小时（± 2.5 小时）后，借助解剖刀轻轻刮除胶水，小心地将圆柱体从组织上移除，并根据所需的分析目的进行保存（如用于免疫组织化学和/或免疫荧光检测则进行固定，或用于 RNA 纯化与基因表达谱分析、蛋白质纯化与 Western blot 检测则在液氮中速冻）。
- 收集基底外侧培养基用于细胞因子分泌谱分析。以 8,000 rpm 离心 7 分钟以沉淀碎片，将上清液转移至离心管（或分装），并立即在 -20 °C 下保存。
*如果需要长期保存上清液，请将其置于 -80 °C 保存。
结果
我们成功地在体外培养中维持了健康人和炎症性肠病（IBD）患者的肠道黏膜组织健康状态至少24小时，保持了组织的良好活力。根据先前的观察结果1，只有在氧气环境（O2）中进行大部分培养时间（至少占总时间的85%）的情况下，才能实现这一目标，因为在常规培养箱中组织无法存活24小时（图2）。我们还发现，在该模型中，根据刺激的极性（顶端 vs 基底侧）以及刺激物的免疫原性不同，离体组织可表现出不同的反应2,3。
通过本方案，我们发现不同的益生菌菌株可引发组织产生不同的反应。Lactobacillus plantarum NCIMB8826 在健康组织上表现出出人意料的免疫原性。与其他两种 Lactobacilli 菌株相反，它不仅诱导淋巴样细胞向黏膜最表层迁移，还显著上调了与该迁移过程相关的趋化因子 CCL4 以及传统上与促炎活性相关的细胞因子 IL-1b。令人意外的是，尽管我们此前在结肠炎小鼠模型中观察到 L. paracasei 具有预防作用4，但当将该菌株的活菌直接应用于炎症性肠病（IBD）组织时，并未产生治疗效果。相反，这三种菌株在疾病急性期应用于 IBD 黏膜时均表现出有害作用2。
此外，我们证明了一种益生菌的代谢产物（称为后生元）能够在应用于炎症性肠病（IBD）黏膜时显著减轻炎症，同时能够保护健康的上皮组织免受一种较强侵袭性的沙门氏菌菌株（FB62）的侵害2。
图1. 装置的示意图与照片。a. 从侧面观察的装置示意图，b. 从顶部观察的装置示意图，c. 用作组织块支撑的金属网格照片。正确放置时，仅基底外侧与中央培养基腔室接触，d. 整个装置的照片。点击此处查看大图。
图 2. 组织仅能在 O2 环境中存活并进行培养。a. 未经培养的组织，取自手术室后立即固定；b. 在 O2 环境中培养 24 小时的组织；c. 在常规培养箱中培养 24 小时的组织。原始放大倍数：5X。
图3. 促炎刺激对组织外植块的影响。C-： 未受刺激的组织，在指定时间点进行培养；Sal： 用Salmonella刺激后在指定时间点进行培养的组织。上皮上层的破坏在2小时时已可见，外植块在24小时后表现出广泛的退行性变化。原始放大倍数：10X。
讨论
长期以来，人们一直强调需要建立符合生理相关性的模型，以有效测试人类肠黏膜的治疗方法。许多研究人员已发现，迄今为止用于该目的的细胞模型5和小鼠模型6均存在潜在的人工假象和缺陷。事实上，尽管常常获得有前景的临床前数据，但这些结果却很少能转化为显著的临床获益。
本研究中描述的方法对现有方案7, 8进行了一种相对简单但有效且新颖的改进，可用于极化培养和刺激人肠道黏膜外植体。
该模型可能为在将任何潜在治疗方法推进至临床之前生成有效的临床前数据提供一种极佳的补充途径。因此，有可能避免不利的临床结果9，研究人员可更安全地将治疗方法推进至临床，用于处理急性炎症状况。
该模型的主要优势在于能够比较极化刺激与非极化刺激，并可在24小时时间范围内动态观察组织的反应。一个非常重要的参数是，在每次实验中，不同处理均应用于来自同一患者的组织外植块，从而能够消除患者间的个体差异。由于外植块相对于活检样本具有较大的尺寸，因此可在同一外植块上进行多种分析，通过多种方法相互验证结果（如ELISA检测、定量rtPCR、微阵列分析、免疫组织化学和/或免疫荧光数据）。此外，未来还可进一步优化其他类型的分析方法，例如从经刺激的外植块中分离特定细胞亚群，并通过流式细胞术评估其表型。
然而，也存在一些重要的局限性需要考虑。目前，该模型不适合对大量治疗方法进行高通量筛选，因为它依赖于组织的可获得性。细胞培养模型可能更适合此类用途，因为其操作更简便，能够对大量样本进行刺激处理10，而我们所描述的模型则更适用于候选治疗方法进入临床前的最终测试。此外，我们成功维持组织存活的时间范围尚不足以支持需要长期监测的实验，例如RNA干扰实验。最后，细菌刺激实验是在常规培养箱中进行的，无法维持或检测厌氧菌的作用效果。未来我们将致力于解决这些问题。
致谢
感谢 Erika Mileti 提供出色的技术支持，感谢 Antonio Di Sabatino 博士提供氧气培养箱。
基金：本工作获得了欧盟第七框架计划（IBDase、ERC：Dendroworld）和Fondazione Cariplo向MR提供的资助，以及Marie Curie国际培训流动网络（Cross-Talk，资助协议编号：21553-2）向KT提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | DE17602E | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | BE17605E | |
| 非必需氨基酸 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| 材料 | |||
| 克隆环 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| 克隆环 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| 克隆环 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| 金属网格 | 自制 | ||
| 中心井器官培养板 | BD Falcon | 353037 | |
| 外科胶水（Vetbond） | 3M | 1469SB | |
| 氧气罐 | 自制 | ||
| 氧气瓶 | Air Liquid Sanità |
参考文献
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056(2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).
重印与许可
标签
