大鼠原位肝移植是生物医学研究中不可或缺的实验模型。本文介绍了我们采用50%部分移植物并进行肝动脉重建的大鼠原位肝移植手术操作步骤。
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大鼠原位肝移植是生物医学研究中不可或缺的实验模型。本文介绍了我们采用50%部分移植物并进行肝动脉重建的大鼠原位肝移植手术操作步骤。
在大鼠中采用全肝或部分肝脏移植物进行原位肝移植(OLT)是移植研究中不可或缺的实验模型,可用于移植物保存和缺血-再灌注损伤1,2、免疫应答3,4、血流动力学5,6以及小体积综合征7等方面的研究。大鼠OLT是实验外科中最困难的动物模型之一,需要高超的显微外科技术,且学习过程耗时较长。因此,该模型的应用受到一定限制。由于使用此类复杂动物模型的实验结果的可靠性和可重复性至关重要,参与大鼠OLT的外科研究人员必须接受标准化且精细的手术操作培训。
尽管已报道了多种大鼠OLT技术及其改良方法 8 自从李氏首次描述该模型以来 等 9 1973年,肝动脉重建的消除 10 以及由Kamada引入的套管吻合技术 等 11 在Kamada的模型中,这是一项重大进步,因为它们极大地简化了重建过程。 等,肝动脉重建也被取消。由于大鼠在肝移植后即使没有肝动脉血流仍可存活,因此关于肝动脉重建的价值一直存在较大争议。然而,带肝动脉重建的模型在生理上的优越性正日益得到认可,尤其是在保护胆管系统方面。 8,12 肝脏完整性 8,13,14.
本文中,我们介绍了采用50%部分移植物进行肝动脉重建的大鼠OLT模型的详细手术步骤 离体 肝切除术。各血管及胆管的重建采用以下方法:肝上和肝下下腔静脉使用7-0聚丙烯连续缝合;门静脉采用套管技术;肝动脉和胆管采用支架技术。
1. 基本技术与常见操作步骤
2. 术前准备
3. 供体手术
供体大鼠肝脏摘除示意图见图2。该操作过程约需30-35分钟。
4. 离体 移植物制备
肝脏移植物的所有操作均在盛有冰冻HTK溶液的金属杯中进行。ex vivo 移植物制备过程约需30分钟。
5. 受体手术
受体大鼠移植植入示意图见图9。受体手术耗时60-70分钟,其中包括无肝期10-11分钟和下腔静脉阻断时间约23-24分钟。
6. 术后治疗与随访
手术后立即给予受体大鼠皮下注射头孢呋辛钠(16 mg/kg)和布托啡诺(0.1 mg/kg),溶于共1.5 ml的生理盐水溶液中。将大鼠置于配备加温空气(30–35 °C)和供氧装置的特殊重症监护笼中,使其恢复60分钟。术后3天内每12小时皮下注射一次布托啡诺(0.1 mg/kg)作为镇痛剂。之后将大鼠转移至普通笼具,并自由饮水和进食。
所有受体大鼠(n = 20)在门静脉再灌注后1、3、24和168小时(7天)计划安乐死采血前均存活,且无明显并发症(每个时间点n = 5)。通过27号针头直接穿刺下腔静脉(IHVC)采集血液样本。样本在5,340 × g离心10分钟后获取血清,并检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,该指标反映移植后肝细胞损伤程度。血清ALT水平随时间变化的趋势见图16。ALT水平在24小时达到峰值(均值±标准差:212.6 ± 67.9 IU/L),随后在168小时下降至正常范围(33.6 ± 6.8 IU/L)。

图1. 由14号导管制成的门静脉(PV)袖套,以及由24号导管制成的肝动脉(HA)和胆管(BD)支架。

图2. 大鼠供体肝脏摘除示意图。BD,胆管;HA,肝动脉;IHVC,肝下腔静脉;PV,门静脉;SHVC,肝上腔静脉。

图3. 供体手术操作。a. 将大鼠置于加热垫上,并使用磁性固定器牵开系统。通过腹正中切口并双侧延伸打开腹腔。b. 将支架插入胆管。c. 通过门静脉灌注肝脏。缩写词解释见图2。

图 4. 门静脉套管的连接。a,b. 夹住门静脉主干的DeBakey Bulldog钳置于金属杯上方。该金属杯安装在装有碎冰的塑料盒中。c. 将门静脉穿过套管。d. 将门静脉壁外翻覆盖在套管上,脾静脉残端位于套管外侧的7点钟位置,套管延伸部分位于12点钟位置。e. 使用一圈6-0丝线将门静脉固定在套管上。黑色箭头指示脾静脉残端的位置。

图 5. 肝动脉内支架的离体(ex vivo)置入。a. 通过夹住膈肌两侧边缘固定肝脏,并利用结扎肝动脉的缝线将其拉直。b. 用直显微镊夹住肝动脉小切口的前壁。c, d. 将支架置入肝动脉,并用6-0丝线固定。

图6. ex vivo 50% 肝切除术示意图。 灰色部分表示被切除的肝叶。ACL,前尾状叶;PCL,后尾状叶;LLL,左外侧叶;LML,中叶左部;RML,中叶右部;SRL,右外侧上叶;IRL,右外侧下叶。

图 7. ex vivo 50% 肝脏切除。a. 结扎尾状叶后部蒂部。 b. 结扎中叶左部分的蒂部。 c. 50% 肝切除前的肝脏。 d. 50% 肝切除后的肝脏。

图8. 肝上腔静脉的离体成形术。 a. 用蚊式钳夹住膈肌两侧边缘以固定肝脏。b. 在两个角部用7-0聚丙烯缝线放置固定缝线。

图 9. 受体大鼠移植肝植入示意图。 采用 7-0 连续缝合线对肝上和肝下腔静脉(SHVC 和 IHVC)进行重建,门静脉(PV)采用套管技术,肝动脉(HA)和胆管(BD)则采用支架技术进行重建。

图10. 受体手术至切除原位肝脏。a. 通过正中切口打开腹腔。b. 结扎右肾上腺静脉。c. 切除原位肝脏。缩写释义见图2。

图11. 肝上腔静脉的吻合。a, b. 肝上腔静脉的外周血管钳固定在一团油性黏土中。两个角部的固定缝线以轻柔的上外侧牵引维持,以扩大吻合口。c. 后排连续腔内缝合正在进行中。d. 前排连续缝合正在进行中。

图 12. 门静脉重建。a, b. 用蚊式钳夹住门静脉,并将其固定于油性黏土中,向肝门方向牵拉。c-f. 将套管插入门静脉。

图13. 肝动脉重建。a, b. 将支架置入受体的肝总动脉(CHA),位置位于肝固有动脉(PHA)与胃十二指肠动脉(GDA)的分叉处。

图14. 下腔静脉吻合。a. 两侧角固定缝线。 b. 后壁连续缝合。 c. 前壁连续缝合。 d. 下腔静脉再灌注。缩写说明见 图2。

图15. 所有重建手术步骤均已完成。缩写含义见图2。

图16. 术后血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平随时间变化的过程(n = 20;每个时间点 n = 5)。数据以均值±标准差表示。ALT水平在24小时达到峰值(212.6 ± 67.9 IU/L),随后在168小时下降至正常范围(33.6 ± 6.8 IU/L)。
1973年,Lee 等首次报道了大鼠OLT模型9,该模型通过手工缝合方法重建包括肝动脉在内的所有血管,并采用体外门体分流术。该模型技术复杂,操作困难。随后,同一研究团队于1975年开发了另一种无需重建肝动脉且不使用体外分流的模型10。1979年,Kamada 等进一步引入了套管吻合技术,用于无需肝动脉重建的模型11。经过这些改进,大鼠OLT手术得以简化,受体手术的无肝期缩短,该模型现已被广泛接受并作为标准的实验模型使用。
然而,自那以后,关于大鼠OLT中肝动脉化的意义一直存在较大争议8,因为尽管动脉化操作具有较高技术难度,但并未影响移植后的存活率。已有大量研究报道了采用不同重建技术进行肝动脉化的实验8,例如主动脉节段-主动脉吻合术3,9,17、套管吻合技术18,19,20、套叠式技术5、支架技术13,16以及套筒吻合技术12,21-23。尽管目前大鼠OLT技术仍未实现标准化,但鉴于其生理上的优越性,动脉化模型正日益受到青睐8,12,13,14。在上述技术中,Lehmann et al.16于2005年报道了一种操作简便且快速的支架技术。该研究取得了优异的结果:在再灌注后8小时、24小时以及6个月时,重建的肝动脉均未观察到闭塞现象。因此,我们采用了该技术进行肝动脉化。
我们采用手工缝合的方法重建SHVC和IHVC。该方法可为吻合部位提供最佳的生理条件,从而降低血栓形成的发生率8,同时也是对外科医生进行显微外科模拟与训练的最佳方式。此外,即使血管残端较短,该吻合方法仍可实施。在IHVC吻合方面,与套管法吻合技术相比,该方法无需在移植物侧保留较长的IHVC。因此,当供体肾静脉被解剖以延长移植物侧IHVC时,该方法适用于需要较长IHVC的小体积移植物移植,例如由右外侧叶和尾状叶组成、肝内下腔静脉较短且无SHVC的30%体积移植物2。
关于大鼠肝切除术的技术,迄今为止已有多种方法被报道;其中主要的两种技术是经典的结扎法和血管导向技术24。我们采用经典的结扎法进行50%肝切除15,但手术在手术显微镜下进行,以使操作更加精细,并避免对剩余肝叶及结构造成损伤。
我们描述了模型中受体大鼠的代表性结果:大鼠在为期7天的观察期内存活,未出现明显并发症。通过选择不同的设置,该模型可针对不同的实验目的进行修改,例如延长冷保存时间、延长热缺血时间(包括心脏死亡后捐献)、使用较小的肝脏移植物,或来自肝损伤或肝脏疾病实验模型的移植物。
根据我们的经验,在整个手术过程中有三个关键因素可能影响移植后的存活率,而存活率是评估大鼠OLT结果的最可靠参数:失血量;手术时间,尤其是门静脉和下腔静脉(IHVC)的阻断时间;以及每条血管重建的充分性,因为血管重建不当可能导致狭窄、血栓形成或出血。在该模型的培训阶段,大多数手术失败很可能与上述因素有关。在本视频文章中,我们逐步介绍了带有肝动脉重建的大鼠部分OLT模型的手术操作流程。尽管大鼠OLT模型较为复杂,且需要高超的显微外科技术,但本文提供了大量实用信息,可为该模型的学习与培训提供良好指导。高效掌握该模型对于缩短学习周期、减少训练所需的实验动物数量和成本,以及后续在实验中获得可靠结果尤为重要。这也符合Russell和Burch于1959年提出的动物实验“3R”原则(替代、减少和优化)25。
我们声明不存在利益冲突。根据实验动物科学协会联合会(FELASA)的指南,大鼠在无特定病原体条件下饲养。所有实验均依照德国联邦动物保护法律以及《实验动物护理与使用指南》(美国国立卫生研究院出版物第86-23号,1985年修订版)进行。
作者感谢Pascal Paschenda和Mareike Schulz提供的技术支持。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术显微镜 | Leica | M651 | |
| 光源 | Schott | KL1500LCD | |
| 棉签 | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| 纱布垫(5×5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| 聚维酮碘溶液 | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| 油性黏土 | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | 用于切除肝脏表面的处理 |
| 11号手术刀片 | Pfm medical | 200130011 | 用于套管和支架的制备 |
| 14号导管 | B. Braun | 4268210S | 门静脉套管 |
| 18号导管 | B. Braun | 4268130S | 经门静脉灌注 |
| 24号导管 | B. Braun | 4269071S | 胆管和肝动脉支架 |
| 4-0 丝线缝合线 | Resorba | H3F | 肝脏切除 |
| 6-0 丝线缝合线 | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene(聚丙烯)缝合线 | Ethicon | 8701H | 供体下腔静脉和受体下腔静脉吻合 |
| 4-0 Vicryl 缝合线 | Ethicon | V304H | 腹部关闭 |
| 5 ml 注射器 | Terumo | SS+T05ES1 | 背部垫枕 |
| 加热垫 | Thermo | 190 x 260 mm | |
| 磁性固定牵开系统 | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 | |
| 冷水浴装置 | Huber | 740.000X | 移植物保存 |
| 双极电凝镊 | Söring | MBC-200 | |
| 蚊式止血钳 | BONIMED | 451-476-03 | 使用两把 |
| Adson 微型镊 | Dimeda | 10.176.12 | |
| 弯头微型镊 | AESCULAP | FD281R | |
| 直头微型镊 | Bonimed | 451-476-03 | |
| 弯头微型剪刀 | Medicon | 05.15.83 | |
| 直头微型剪刀 | AESCULAP | FD12 | 精细切口 |
| 普通剪刀 | AESCULAP | BC211W | |
| 微型持针器 | AESCULAP | FD241R | 血管重建 |
| Mayor-Hegar 持针器 | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | 腹部关闭 |
| DeBakey 蛙形钳(直型) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey 蛙形钳(弯型) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky 钳 | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| 外周血管钳 | Teleflex Medical | 353494 | 受体肝下腔静脉 |
| 微型血管钳(一次性) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | 门静脉、供体肝内下腔静脉和受体肝动脉 |
| 微型血管钳(金属) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | 受体肝内下腔静脉 |
| 乳酸林格液 | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| 生理盐水溶液 | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK 溶液 | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | 保存液 |
| 肝素钠 | Ratiopharm | 5394.02.00 | 灌注前 500 IU |
| 8.4% 碳酸氢钠 | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 再灌注后 0.5 ml |
| 5% 葡萄糖溶液 | B. Braun | 6714567.06.00 | 再灌注后 1.0 ml |
| 头孢呋辛钠 | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | 抗生素,16 mg/kg |
| 布托啡诺 | Essex Pharma | 997.00.00 | 镇痛药,0.1 mg/kg |
| 重症监护笼 | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | 术后护理 |
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