一种可实现神经管中基因表达在特定细胞类型中可追踪性下调的方法。我们展示了如何 在卵内 通过电穿孔导入基于 microRNA 的质粒以实现时空可控的 RNA 干扰，可用于研究发育中神经管内联合神经轴突的导向机制。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
连合性dI1神经元已被广泛研究，以阐明发育过程中轴突导向的机制1,2这些神经元位于脊髓背侧，其轴突沿特定路径延伸。联合轴突首先向腹侧投射，朝向并穿过底板。在跨越中线后，这些轴突急剧转向头侧，并沿纵向向脑部投射。上述每一步均受到吸引性和排斥性导向信号协同作用的调控。对这些信号的正确解读对于轴突沿既定路径的导向至关重要。因此，研究特定分子在联合轴突导向中的生理作用，最理想的方法是在活体胚胎背景下进行。因此，基因敲低 体内 必须进行精确控制，以仔细区分在发育过程中可能具有多种作用的基因的轴突导向功能。
本文介绍了一种在鸡胚神经管中以细胞类型特异性且可追踪的方式敲低基因表达的方法。我们使用了新型质粒载体3 含有细胞类型特异性启动子/增强子，可驱动荧光蛋白标记物的表达，其后直接连接一个miR30-RNAi转录本4 （位于编码荧光蛋白的cDNA的3'-非翻译区）图1）。当这些载体通过电穿孔导入发育中的神经管时，可有效下调基因表达，同时表达明亮的荧光标记蛋白，从而实现对发生基因敲低的细胞进行直接示踪3在电穿孔前混合不同的RNAi载体，可实现在脊髓不同区域同时敲低两个或更多基因。该方法能够以快速、简便、精确且经济的方式，在发育过程中研究复杂的细胞与分子相互作用。结合在敞书状标本中对联合轴突路径进行DiI示踪，5，该方法是用于 体内 联合轴突生长与导向的细胞和分子机制研究。原则上，任何启动子/增强子均可用于该技术，从而可能使其适用范围更广泛 体内 发育过程中基因功能的研究6.
本视频首先演示了如何操作和开窗处理鸡胚蛋，在神经管内注射DNA质粒以及电穿孔操作步骤。为研究联合轴突导向，将胚胎脊髓以展开书样制备方式取出，固定后注入DiI染料，以便追踪轴突的走行路径。随后将脊髓样本置于盖玻片之间，利用共聚焦显微镜进行观察。
方案
1. 用于细胞类型特异性基因沉默的RNAi质粒DNA的制备
质粒（图1）采用标准的分子克隆技术合成，具体方法此前已有详细描述3,4。
1.1 克隆至载体：寡核苷酸设计
- 我们使用与 pRFPRNAiC 载体产品说明中所述相同的通用寡核苷酸和克隆方案4（ARK-Genomics）。
- 用于克隆至第一个发夹结构位点：
5' 引物 HP1：
5'-GGCGGGGCTAGCTGGAGAAGATGCCTTCCGGAGAGGTGCTGCTGAGCG
3' 引物 HP1：
5'-GGGTGGACGCGTAAGAGGGGAAGAAAGCTTCTAACCCCGCTATTCACCACCACTAGGCA - 用于克隆至第二个发夹结构位点：
5' 引物 HP2：
5'-GGCGGGACGCGTGCTGTGAAGATCCGAAGATGCCTTGCGCTGGTTCCTCCGTGAGCG
3' 引物 HP2： - 5'-CGCCGCGCATGCACCAAGCAGAGCAGCCTGAAGACCAGTAGGCA
- 用于克隆至第一个发夹结构位点：
- 我们使用 Genscript 的 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
这种基于简单载体的人工miRNA表达策略可用于敲低鸡胚神经管中的内源基因表达。这些功能性工具能够实现多基因沉默、时间控制以及细胞类型特异性，有助于阐明复杂的发育通路。特别是，我们已证明这些质粒在联合轴突导向研究中的实用性，因为这些质粒可用于在联合神经元或其中间靶标——底板3中敲低不同的基因。
由miRNA表达质粒产生的荧光蛋白表达强度和位置（从而指示被沉默的细胞）将取决于以下参数：
- 所使用的增强子：
- β-actin 启动子具有普遍活性
- Math1 增强子仅在 dI1 神经元中具有活性12
- Hoxa1 增强子 III 仅在底板中具有活性13
- 质粒浓度。
若质粒浓度过高，可能导致增强子活性“泄漏”，从而在非目标细胞中表达；而质粒浓度过低则可能降低荧.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
E.S. 实验室的工作由瑞士国家科学基金会资助。我们感谢 Beat Kunz 博士在拍摄过程中提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| 玻璃针拉制仪 | Narishige | PC-10 | |
| 电穿孔仪 | BTX | ECM 830 | |
| 聚二甲基硅氧烷（Sylgard）硅橡胶弹性体 | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| 钨丝，0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 | |
| 昆虫固定针，0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 昆虫固定针，0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont #55 镊子 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | SZX12, BX51 |
参考文献
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneuron....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
