一种可实现神经管中基因表达在特定细胞类型中可追踪性下调的方法。我们展示了如何 在卵内 通过电穿孔导入基于 microRNA 的质粒以实现时空可控的 RNA 干扰，可用于研究发育中神经管内联合神经轴突的导向机制。
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摘要
摘要
连合性dI1神经元已被广泛研究，以阐明发育过程中轴突导向的机制1,2这些神经元位于脊髓背侧，其轴突沿特定路径延伸。联合轴突首先向腹侧投射，朝向并穿过底板。在跨越中线后，这些轴突急剧转向头侧，并沿纵向向脑部投射。上述每一步均受到吸引性和排斥性导向信号协同作用的调控。对这些信号的正确解读对于轴突沿既定路径的导向至关重要。因此，研究特定分子在联合轴突导向中的生理作用，最理想的方法是在活体胚胎背景下进行。因此，基因敲低 体内 必须进行精确控制，以仔细区分在发育过程中可能具有多种作用的基因的轴突导向功能。
本文介绍了一种在鸡胚神经管中以细胞类型特异性且可追踪的方式敲低基因表达的方法。我们使用了新型质粒载体3 含有细胞类型特异性启动子/增强子，可驱动荧光蛋白标记物的表达，其后直接连接一个miR30-RNAi转录本4 （位于编码荧光蛋白的cDNA的3'-非翻译区）图1）。当这些载体通过电穿孔导入发育中的神经管时，可有效下调基因表达，同时表达明亮的荧光标记蛋白，从而实现对发生基因敲低的细胞进行直接示踪3在电穿孔前混合不同的RNAi载体，可实现在脊髓不同区域同时敲低两个或更多基因。该方法能够以快速、简便、精确且经济的方式，在发育过程中研究复杂的细胞与分子相互作用。结合在敞书状标本中对联合轴突路径进行DiI示踪，5，该方法是用于 体内 联合轴突生长与导向的细胞和分子机制研究。原则上，任何启动子/增强子均可用于该技术，从而可能使其适用范围更广泛 体内 发育过程中基因功能的研究6.
本视频首先演示了如何操作和开窗处理鸡胚蛋，在神经管内注射DNA质粒以及电穿孔操作步骤。为研究联合轴突导向，将胚胎脊髓以展开书样制备方式取出，固定后注入DiI染料，以便追踪轴突的走行路径。随后将脊髓样本置于盖玻片之间，利用共聚焦显微镜进行观察。
方案
1. 用于细胞类型特异性基因沉默的RNAi质粒DNA的制备
质粒（图1）采用标准的分子克隆技术合成，具体方法此前已有详细描述3,4。
1.1 克隆至载体：寡核苷酸设计
- 我们使用与 pRFPRNAiC 载体产品说明中所述相同的通用寡核苷酸和克隆方案4（ARK-Genomics）。
- 用于克隆至第一个发夹结构位点：
5' 引物 HP1：
5'-GGCGGGGCTAGCTGGAGAAGATGCCTTCCGGAGAGGTGCTGCTGAGCG
3' 引物 HP1：
5'-GGGTGGACGCGTAAGAGGGGAAGAAAGCTTCTAACCCCGCTATTCACCACCACTAGGCA - 用于克隆至第二个发夹结构位点：
5' 引物 HP2：
5'-GGCGGGACGCGTGCTGTGAAGATCCGAAGATGCCTTGCGCTGGTTCCTCCGTGAGCG
3' 引物 HP2： - 5'-CGCCGCGCATGCACCAAGCAGAGCAGCCTGAAGACCAGTAGGCA
- 用于克隆至第一个发夹结构位点：
- 我们使用 Genscript 的 siRNA 靶点查找工具来选择基因特异性靶序列： https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai。
- 将基因特异性 miRNA 克隆至第一个发夹结构位点所用的引物：
以下为沉默GFP的一个示例。
靶序列（22 nt）：5'-GGCACAAGCTGGAGTACAACTA
GFP 正向 HP1 = 59 mer
GFP 反向 HP1 = 58 mer
这些寡核苷酸中含有形成miRNA侧翼序列（鸡特异性）的共同序列，以及来自人miRNA30的共同环/茎序列。基因特异性靶序列已用下划线标出。请注意，正向链的5'端碱基存在一个错配（本例中以粗体显示；G→A），以模拟miRNA30在该位置的天然错配。
- 用于将基因特异性miRNA克隆到第二个发夹位点的引物：
以下为沉默 LacZ 的一个示例。
靶序列（22 nt）：5'-CGCGCTGTATCGCTGGATCAAA
LacZ 正向 HP2：
LacZ 反向 HP2：
请注意，正向链中靶序列的 5' 端碱基已被改变（以粗体显示；本例中为 C→A），使其与反义链序列不匹配，模拟 miRNA30 的特性。
1.2 PCR 反应与亚克隆
- 将基因特异性寡核苷酸与通用寡核苷酸一起用于PCR反应，以生成带有鸡miRNA侧翼序列的miRNA30样发夹结构。
| 克隆至第一个发夹位点： 1 μl - 10 ng GFP 正向引物 HP1 1 μl - 100 ng 5' 引物 HP1 1 μl - 100 ng 3' 引物 HP1 1 μl dNTPs (10 mM) 5 μl 10x Pfu 反应缓冲液 1 μl Pfu DNA 聚合酶 (Promega) 39 μl PCR 级水 | 或 | 克隆至第二个发夹位点： 1 μl - 10 ng LacZ 正向引物 HP2 1 μl - 100 ng 5' 引物 HP2 1 μl - 100 ng 3' 引物 HP2 1 μl dNTPs (10 mM) 5 μl 10x Pfu 反应缓冲液 1 μl Pfu DNA 聚合酶 (Promega) 39 μl PCR 级水 |
循环：
| 94 °C | 94 °C | 55 °C | 72 °C | 72 °C | 4 °C |
| 1 分钟 | 30 秒 | 30 秒 | 1 分钟 | 9 分钟 | 保持 |
| 30 个循环 | |||||
- 纯化PCR产物，用限制性内切酶消化后亚克隆至载体中：
- 第一个发夹结构位点：使用NheI和MluI
- 第二个发夹结构位点：使用MluI和SphI
- 采用标准方法转化感受态细菌细胞。将细胞涂布于LB琼脂平板（含氨苄青霉素），并通过质粒中量制备试剂盒（例如 Nucleobond Xtra Midi kit, Machery-Nagel）提取DNA。
- 将浓缩的质粒DNA悬浮于无菌ddH2O中，通过分光光度法测定浓度，并于-20 °C保存。
1.3 测序miRNA质粒
在标准条件下，由于发夹结构具有较强的二级结构，测序反应常常失败。为改善此问题7：
- 使用 10 mM Tris-Cl 加 0.01 mM EDTA（pH 8.0）代替水进行测序反应。这有助于提高超螺旋 DNA 向单链 DNA 的转化效率，而单链 DNA 更适合测序。
- 在测序前增加热变性步骤（98 °C，5 分钟），以将质粒超螺旋 DNA 转化为单链 DNA。
2. 电穿孔
2.1 蚕卵处理
- 将鸡蛋放入设定为 38.5 °C 且湿度约为 45% 的孵育箱中。
- 孵育鸡蛋，直至胚胎达到所需发育阶段。为研究联合神经元的轴突导向，我们通常在胚胎达到 Hamburger & Hamilton (HH) 17–18 期时进行电穿孔（孵育约 3 天后）8。然而，注射和电穿孔必须在目标蛋白积累之前完成，以确保基因敲低效率。
- 从孵育箱中取出鸡蛋，并将其置于稳定的水平位置 20 分钟，使胚胎重新定位至蛋黄上方的顶部位置。在此期间将鸡蛋放回孵育箱中。
2.2 试剂与设备的准备
- 配制磷酸盐缓冲液（PBS），并通过高压灭菌或使用0.2 μm滤膜过滤溶液进行灭菌。
- 使用合适的拉制仪（例如Narishige PC-10）将毛细管（World Precision Instruments 1B120F-4；外径/内径1.2 / 0.68 mm）拉制成玻璃微电极。折断微电极尖端，使其尖端直径约为5 μm，并将其连接至一段合适直径的管路。
- 将铂电极（长0.5 cm）牢固地安装在手持式框架上，电极间距为0.5 cm。将电极连接至方波脉冲发生器（BTX ECM 830）。
- 设置脉冲发生器参数如下：
- 单侧电穿孔：电压：25 V，脉冲次数：5次，脉冲时长：50 msec，脉冲间隔：1 sec
- 双侧电穿孔：电压：18 V，脉冲次数：5次，脉冲时长：50 msec，脉冲间隔：1 sec
- 准备一支带有18 G针头的注射器、手术刀、装有70%乙醇的喷雾瓶以及胶带。
- 在加热板上将石蜡置于烧杯中，于80 °C加热熔化。
2.3 窗口设置
- 用浸有70%乙醇的纸巾擦拭鸡蛋表面。
- 沿鸡蛋长轴方向贴一条胶带。
- 使用解剖刀在蛋壳上打两个小孔：一个位于鸡蛋钝端，另一个位于需要开窗区域的角落。
- 用注射器以约45°角插入钝端的小孔，从每个鸡蛋中抽出约3 ml的蛋清。操作时应小心避免损伤蛋黄。
- 用小型剪刀水平剪开蛋壳形成窗口，以避免损伤胚胎。如有需要，可通过将强光照射在鸡蛋钝端来观察胚胎位置，并用铅笔标记。对于大多数应用，1.5至2 cm见方的窗口较为合适。
- 用毛刷涂抹熔化的石蜡，封闭钝端的孔洞以及蛋壳上的任何裂纹。
- 用透明胶带（e.g. Scotch Magic）密封窗口。
- 将鸡蛋放回培养箱中继续孵化。
2.4 电穿孔
- 准备无菌工具，并用70%乙醇擦拭工作区域。
- 配制注射溶液。合适的DNA浓度需由使用者确定，并根据用于驱动表达的增强子/启动子不同而有所变化。作为参考，我们通常使用0.2–2.0 μg/μl（见讨论部分）。在总共20 μl的体积中，注射混合物应包含：
| RNAi 质粒 DNA（溶于 H20） | X μl |
| 20x PBS | 1 μl |
| 0.4% 台盼蓝 | 2 μl |
| 无菌 ddH20，加至终体积 | 20 μl |
使用轻柔的负压将DNA混合物吸入连接在管路中的玻璃微毛细管中。
- 从开窗的鸡蛋上移除胶带，并根据哈amburger和Hamilton的标准对胚胎进行分期8。
- 使用镊子和弹簧剪小心地去除胚胎尾部一半的胚外膜。在主要的左右卵黄静脉进入躯干的区域，这些膜可轻易从胚胎上掀起。轻轻撕开或剪开膜，并将其向尾部方向拉除。如有需要，可通过在胚胎盘与卵黄之间注射印度墨水或快绿溶液，以更清晰地观察胚胎，具体操作可参考Boulland及其同事提供的视频9。
- 将DNA溶液注射到神经管中央管内，位置位于后肢上方。通过口控方式调节注射体积。蓝色染料应从尾尖向上扩散至发育中脑的脑室。
- 在胚胎上方滴加数滴无菌PBS。
- 将电极平行于胚胎的头尾轴放置。避免接触胚胎或血管。
- 固定电极位置，进行电穿孔。
- 小心取出电极，并用无菌水冲洗，以去除来自蛋清的变性蛋白。
- 如需进行双侧电穿孔，需调换电极的极性，重新将电极平行于胚胎放置，并重复电穿孔操作。随后用无菌水冲洗电极。
- 向胚胎再滴加一些无菌PBS。用胶带重新密封鸡蛋，并将其放回培养箱，直至达到所需发育阶段。妥善密封对防止胚胎脱水至关重要。
3. 脊髓制备
3.1 胚胎解剖
- 在孵化第5天（HH25-26期），使用镊子或小勺将胚胎从蛋中取出，放入涂有硅胶（Sylgard弹性体）的培养皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）内。
- 去除胚外膜，将胚胎背部朝上放置。用0.20 mm昆虫针穿过颈部和尾部，轻轻拉伸后固定于培养皿中以稳定胚胎。
- 若需后续切片，可在此处固定整个胚胎：将PBS替换为4%多聚甲醛（PFA），室温孵育1小时。若要制备敞页式标本，则按以下步骤继续使用未固定的组织进行操作。
3.2 从胚胎中分离脊髓
- 用大头针固定四肢，确保大头针以倾斜角度插入，远离胚胎，以免干扰后续解剖操作。应从下方照亮胚胎，以便在后续步骤中观察组织密度。
- 使用弹簧剪刀并配合镊子轻轻刮除心脏和内脏器官。若所有器官均已完全去除，则应可见分节的椎骨和脊髓。
- 使用弹簧剪刀，在颈部脊髓上方的椎骨处做一浅切口。将胚胎旋转180°，然后从颈部向尾部方向，在脊髓两侧的椎骨上各做两条短的纵向切口。用镊子将椎骨瓣从脊髓上轻轻掀起，并将包含全部椎骨的组织以单条形式向尾部剥离。
- 轻轻拉伸胚胎，并通过尾部和四肢重新固定大头针。
- 使用精细的显微外科手术刀（e.g. Grieshaber 68101）或钨针，切除覆盖在脊髓上的脑膜。在神经管与背根神经节之间寻找一条深色致密的组织线。必要时调整照明角度。从颈部到尾部，沿该线在脊髓两侧轻轻做纵向切割。由于固定后的胚胎被轻微拉伸，脑膜应会与脊髓自然分离。
- 在肢芽水平及后肢芽尾侧横切脊髓，用镊子以平稳的从头端向尾端的动作将整段脊髓完整取出。此步骤中应始终保持分离的脊髓浸没在PBS中，切勿将其提出培养皿。
3.3 开放式书本样品的固定
- 将分离的脊髓铺展在解剖刀片上，转移至一个新的硅胶包被的培养皿中，该培养皿内含有含4%多聚甲醛的PBS溶液。
- 通过使用0.10 mm昆虫针在六个位置（每侧的头端、中段和尾端）小心地固定脊髓，制备成平展标本。我们通过一个小“标签”标记每个标本，该标签不仅用于识别胚胎，还可指示开放书状标本的前端。
- 在室温下孵育30分钟至1小时。开放书状标本不应过度固定，因为这会降低DiI的扩散效率10并增加背景信号。
- 小心倒掉4% PFA溶液，并替换为PBS。将培养皿置于4 °C保存，直至准备进行DiI注射或封片。
3.4 将DiI注入联合神经元
- 在荧光显微镜下观察打开的脑组织标本，选择合适的一侧进行DiI注射。
- 配制Fast DiI（5 mg/ml溶于乙醇），将溶液吸入连接塑料管的玻璃微量移液管中。尽可能精细地折断玻璃移液管的尖端，以获得极小直径的尖嘴。将针头插入PBS溶液中，检查DiI是否从针头泄漏。若发生泄漏，说明针头直径过大，需重新制备新针头。
- 从下方照亮打开的脑组织标本，寻找位于标本半侧边缘约五分之一宽度处的一条纵向较密集的组织条带。该区域对应于联合神经元的胞体位置，位于顶板腹侧附近。从打开标本的一端开始，将玻璃针头插入组织中，在缓慢退出针头的同时，用嘴控移液器轻轻吹入少量DiI。
- 快速操作，在整个打开标本的长度方向上以约0.5 mm的间隔进行多次注射。若针头堵塞，可用镊子小心清理；若针尖变粗导致DiI泄漏，则应更换针头。
- 每完成一个打开标本后，使用转移移液管吸除并丢弃任何过量或泄漏的DiI。若不执行此步骤，将导致背景信号过高。
- 将标本置于4 °C环境中静置约三天，使DiI沿轴突充分扩散。
3.5 成像用样品安装
- 使用带有18 G针头的注射器涂抹一层薄而连续的真空润滑脂例如 Dow Corning #976V）沿 24 mm × 24 mm 玻璃盖玻片边缘涂抹。向孔中加入数滴无菌 PBS。注意，含甘油的封片剂 n原儿茶酸丙酯可能与DiI不相容11同样，低粘度真空脂可能与PBS混合，导致背景信号升高。
- 将开放书状组织的针取出，并将其转移至 PBS 液滴中。浸没开放书状组织，并将其置于孔板中央。
- 轻轻将另一片24 mm × 24 mm盖玻片置于其上，确保“书本打开”结构保持张开状态。如有必要，可取下盖玻片，重新调整“书本打开”位置。轻轻按压标本四周，使凡士林完全密封。此步骤中多余的PBS将被挤出。避免产生气泡。
- 将制备物置于暗处保存 4 °C 直到准备通过荧光显微镜进行观察和记录为止。应尽快完成（一周内），以确保样品不会干燥。
4. 代表性结果
电穿孔及质粒表达
在上述条件下，荧光蛋白应在相应细胞类型中清晰可检，无需通过抗体标记对信号进行额外放大。荧光蛋白仅应在目标细胞类型中可检。图中展示了利用不同质粒进行电穿孔后的胚胎展开制备样本及横切面的代表性结果。 图2.
人工miRNA的效率
针对新目标基因的人工miRNA必须首先筛选其基因沉默效果的效率和特异性。我们发现，由β-actin启动子驱动的构建体在电穿孔转染后， 0.25 μg/μl，适用于此3. 基因沉默 体内 可通过免疫组织化学进行检测或 原位 杂交
DiI 标记
在野生型胚胎中进行精确定位的DiI注射后，超过80%的注射位点应产生理想且典型的投射轨迹3，如图3所示。个体间的变异性应较低。
图1. 表达miRNA的质粒载体的通用示意图。使用不同的RNA聚合酶II启动子/增强子可实现细胞类型特异性表达。转染的细胞可通过荧光报告基因的表达进行识别，该报告基因与一个或两个人工miRNA直接连接（位于同一转录本中），用于抑制基因表达。文中所述针对LacZ的人工miRNA正义链以粗体标示。
图 2. 电穿孔导入指定质粒载体后获得的荧光蛋白表达模式的代表性示例。横切面和展开图来自在HH18期进行电穿孔、发育至HH25-26期的鸡胚。β-actin启动子驱动广泛性表达，Math1增强子驱动dI1神经元中的表达，Hoxa1增强子特异性驱动底板中的表达。CN，连合神经元；FP，底板。
图 3. 在展开图制备中标记DiI注射位点及其分析方法。应在展开图的电穿孔侧（通过荧光蛋白表达确定）靠近外侧边缘处，以点状模式注射DiI。经过3天扩散后，可在荧光显微镜下观察联合轴突的走行轨迹。正常轴突应朝向底板生长，穿过底板后转向并沿头侧方向延伸。由基因敲低引起的异常表型可与这一典型轨迹进行比较。在本示例中，部分轴突停滞于底板内，或在对侧做出错误的转向决策。
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讨论
这种基于简单载体的人工miRNA表达策略可用于敲低鸡胚神经管中的内源基因表达。这些功能性工具能够实现多基因沉默、时间控制以及细胞类型特异性，有助于阐明复杂的发育通路。特别是，我们已证明这些质粒在联合轴突导向研究中的实用性，因为这些质粒可用于在联合神经元或其中间靶标——底板3中敲低不同的基因。
由miRNA表达质粒产生的荧光蛋白表达强度和位置（从而指示被沉默的细胞）将取决于以下参数：
- 所使用的增强子：
- β-actin 启动子具有普遍活性
- Math1 增强子仅在 dI1 神经元中具有活性12
- Hoxa1 增强子 III 仅在底板中具有活性13
- 质粒浓度。
若质粒浓度过高，可能导致增强子活性“泄漏”，从而在非目标细胞中表达；而质粒浓度过低则可能降低荧...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
E.S. 实验室的工作由瑞士国家科学基金会资助。我们感谢 Beat Kunz 博士在拍摄过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| 玻璃针拉制仪 | Narishige | PC-10 | |
| 电穿孔仪 | BTX | ECM 830 | |
| 聚二甲基硅氧烷（Sylgard）硅橡胶弹性体 | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| 钨丝，0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 | |
| 昆虫固定针，0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 昆虫固定针，0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont #55 镊子 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | SZX12, BX51 |
参考文献
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