双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

摘要

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。

摘要

越来越多的证据表明，缺血预处理——即对大脑施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血事件提供短暂的保护作用。我们已建立双侧颈总动脉阻断作为预处理刺激，以在C57Bl6/J小鼠中诱导对短暂局灶性脑缺血的早期缺血耐受。在本视频中，我们将演示本研究所采用的方法学。

引言

缺血性卒中是一种死亡率高且带来巨大社会经济负担的疾病¹。尽管近几十年来在实验和临床科学研究方面投入了大量努力，但针对急性缺血性卒中患者的治疗手段仍然非常有限²。与此相反，发达国家老年人口比例的上升将在未来几十年显著增加缺血性卒中患者的发病率和患病率³。因此，迫切需要为缺血性卒中患者开发新的治疗策略。

一种研究思路是进一步理解大脑内源性适应机制，以应对有害刺激。这种源于大脑的神经保护作用也被称为缺血预处理（PC）或缺血耐受（IT），描述的是一种现象：当对大脑施加一种无害的有害刺激时，可诱导大脑对随后发生的致损伤性缺血性攻击产生短暂的抵抗能力⁴。缺血耐受在两个不同的时间窗内发生：早期缺血耐受，出现在预处理后数分钟至数小时内；延迟性缺血耐受，则需要数小时的潜伏期才会出现⁴。

迄今为止，关于脑部缺血预处理（IT）的研究主要集中在延迟性IT，而对早期IT的机制了解甚少。本研究的目的是建立双侧颈总动脉阻断（BCCAO）模型——这是一种已知可诱导延迟性IT的成熟刺激方法——并验证其作为有效的预处理刺激，能否在C57Bl6/J小鼠中诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期IT。

在两种手术过程（BCCAO 和 MCAO）中，均采用激光多普勒血流仪（L....

方案

本文所述所有操作均遵循德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany）的指南与规定进行。

术前操作

1. 单丝的制备

1. 制备管腔内丝线时，使用8-0尼龙单丝缝合线，并将其剪成每段13 mm的长度。
2. 为对单丝进行包被，采用Xantopren M黏膜材料（Heraeus Kulzer GmbH，德国汉瑙），通过加入一滴激活剂溶液（Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH，德国汉瑙）进行活化。
3. 将单丝缓慢穿过硅胶，直至其完全被覆盖。此操作可使单丝表面均匀包被硅胶。注意避免等待过久，因为活化后的包被材料会迅速变硬并干燥。
4. 在硅胶开始固化之前，建议将单丝在一张纸上轻轻拖过，以去除多余的硅胶。通过此操作，可将硅胶层减薄至约200 μm的厚度。
5. 将包覆有硅胶的单丝基部插入模型黏土中，使其过夜干燥。

说明：理想情况下，应仅使用经过灭菌或至少消毒的单丝线，以确保手术部位的无菌性。在实际操作中，手工制作的单丝线难以进行灭菌或消毒，因为其质量可能会下降⁹。因此，使用市售的无菌单丝线可能是更优的选....

结果

我们的BCCAO方案在双侧CCA被阻断时，立即导致脑血流量（CBF）显著降低（>90%）（图1）。通过激光多普勒血流仪（LDF）监测显示，重新开放CCA后血流完全再灌注（图1）。术后动物未表现出任何功能障碍的迹象，且无死亡发生。在另一组动物中，于BCCAO术后72小时进行TUNEL染色，结果显示BCCAO后脑组织中无迟发性细胞死亡的迹象（数据未显示）。

在分析早期缺血耐受（IT）中BCCAO与MCAO之间最佳时间间隔的时间特征（图2）时，我们发现当BCCAO在MCAO前30分钟实施时，与假手术组（n=10）相比，梗死体积显著减小（减少65%，n=10）。此外，当BCCAO在MCAO前2小时和24小时实施时，梗死体积也有所减小（n=10）。其中24小时代表IT的第二个（延迟性）时间窗⁶。

因此，可以得出结论：以双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激时，早期缺血耐受的最优时间窗为短暂性局灶性脑缺血（MC.......

讨论

在本研究中，我们证明了三次短暂性双侧颈总动脉阻断（BCCAO），每次持续一分钟，随后再灌注五分钟，是一种足以诱导早期缺血耐受的适宜缺血预处理刺激方案。

此外，我们已证明所采用的预处理方案是一种安全且微创的程序，术后无明显并发症，脑组织中无凋亡迹象，且无动物死亡。此前已有多种不同的预处理方案被报道^6-7,12。其他研究者曾采用6分钟的双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）作为预处理刺激^13-14。然而，由于每次1分钟、共3次的BCCAO在缺血耐受的早期时间窗内已产生保护作用，且未检测到脑缺血性损伤，因此我们决定采用该方案。

为获得一致的结果，麻醉和手术持续时间以及其他变量（如动物体重、手术期间的脑温、术后液体补充、术后疼痛管理以及术前和术后笼内环境丰富化）均应标准化¹⁵。在整个麻醉过程中，需特别注意维持小鼠正常体温，因为低温本身具有预处理效应，可能干扰双侧颈总动脉结扎（BCCAO）的效果¹⁶。在清醒且自由活动的啮齿类动物中，核心体温通常比相应脑温高约.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双目手术显微镜	Zeiss	Stemi 2000 C
显微镜光源	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
带直肠探针的加热垫	FST	21061-10
立体定位仪	David Kopf	Model 930
剪刀	FST	91460-11
Dumont #5 镊子	FST	11251-10
Dumont #7 镊子	FST	11271-30
微血管夹	FST	00398-02
血管夹施加器	FST	00072-14
弹簧剪	FST	15372-62
持针器	FST	12010-14
缝合针	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 丝线缝线	Feuerstein, Suprama
7-0 丝线缝线	Feuerstein,Suprama
8-0 丝线缝线	Feuerstein, Suprama