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方法文章

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

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DOI：

10.3791/4387

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2013年5月9日

 ,  , 
1Department of Neurology, Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Germany

本文内容

摘要

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。

摘要

越来越多的证据表明，缺血预处理——即对大脑施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血事件提供短暂的保护作用。我们已建立双侧颈总动脉阻断作为预处理刺激，以在C57Bl6/J小鼠中诱导对短暂局灶性脑缺血的早期缺血耐受。在本视频中，我们将演示本研究所采用的方法学。

引言

缺血性卒中是一种死亡率高且带来巨大社会经济负担的疾病1。尽管近几十年来在实验和临床科学研究方面投入了大量努力，但针对急性缺血性卒中患者的治疗手段仍然非常有限2。与此相反，发达国家老年人口比例的上升将在未来几十年显著增加缺血性卒中患者的发病率和患病率3。因此，迫切需要为缺血性卒中患者开发新的治疗策略。

一种研究思路是进一步理解大脑内源性适应机制，以应对有害刺激。这种源于大脑的神经保护作用也被称为缺血预处理（PC）或缺血耐受（IT），描述的是一种现象：当对大脑施加一种无害的有害刺激时，可诱导大脑对随后发生的致损伤性缺血性攻击产生短暂的抵抗能力4。缺血耐受在两个不同的时间窗内发生：早期缺血耐受，出现在预处理后数分钟至数小时内；延迟性缺血耐受，则需要数小时的潜伏期才会出现4。

迄今为止，关于脑部缺血预处理（IT）的研究主要集中在延迟性IT，而对早期IT的机制了解甚少。本研究的目的是建立双侧颈总动脉阻断（BCCAO）模型——这是一种已知可诱导延迟性IT的成熟刺激方法——并验证其作为有效的预处理刺激，能否在C57Bl6/J小鼠中诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期IT。

在两种手术过程（BCCAO 和 MCAO）中，均采用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑血流量（CBF）。

在麻醉且自主呼吸的小鼠中进行双侧颈总动脉阻断（BCCAO）。暴露双侧颈总动脉（CCA），并阻断60秒，随后进行5分钟的再灌注。该BCCAO/再灌注序列重复两次。术后小鼠迅速恢复，未表现出任何功能损伤的迹象。为了排除上述BCCAO方案是否会导致脑内延迟性细胞死亡，我们在另一组小鼠中于BCCAO（或假手术）后72小时进行了末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）染色。

大脑中动脉阻塞（MCAO）是诱导啮齿类动物局灶性脑缺血的广泛应用模型5-7。手术操作按照标准化操作程序（SOP）进行8。暴露左侧颈总动脉（CCA）后，将一根带硅胶涂层的单丝线插入远端CCA，经由颈内动脉（ICA）推进至Willis环，直至阻塞大脑前动脉（ACA），从而在规定时间内闭塞大脑中动脉（MCA）的起始部位。在本研究中，我们采用45分钟的MCAO，通常可导致MCA供血区域出现缺血性病灶，累及纹状体和皮层脑区。

在本研究中，我们采用双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，分析了早期缺血耐受的时程特征。实验结果表明，BCCAO与大脑中动脉阻断（MCAO）之间诱导早期缺血耐受的最佳时间间隔为30分钟。

在本视频中，我们将演示这两种手术操作。 即 BCCAO 和 MCAO

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方案

本文所述所有操作均遵循德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany）的指南与规定进行。

术前操作

1. 单丝的制备

  1. 制备管腔内丝线时，使用8-0尼龙单丝缝合线，并将其剪成每段13 mm的长度。
  2. 为对单丝进行包被，采用Xantopren M黏膜材料（Heraeus Kulzer GmbH，德国汉瑙），通过加入一滴激活剂溶液（Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH，德国汉瑙）进行活化。
  3. 将单丝缓慢穿过硅胶，直至其完全被覆盖。此操作可使单丝表面均匀包被硅胶。注意避免等待过久，因为活化后的包被材料会迅速变硬并干燥。
  4. 在硅胶开始固化之前，建议将单丝在一张纸上轻轻拖过，以去除多余的硅胶。通过此操作，可将硅胶层减薄至约200 μm的厚度。
  5. 将包覆有硅胶的单丝基部插入模型黏土中，使其过夜干燥。

说明：理想情况下，应仅使用经过灭菌或至少消毒的单丝线，以确保手术部位的无菌性。在实际操作中，手工制作的单丝线难以进行灭菌或消毒，因为其质量可能会下降9。因此，使用市售的无菌单丝线可能是更优的选择。

2. 手术器械和动物的准备

  1. 所有手术器械均保存在70%乙醇中。此外，在每次新的手术操作前，所有手术器械均需用70%乙醇仔细清洁和消毒。
  2. 在切断前，所有动物的手术区域均用70%乙醇彻底消毒。消毒部位需完全干燥后方可进行切口。未进行额外的毛发修剪，因为这可能导致微小擦伤及继发性皮肤炎症9。

手术操作

3. 激光多普勒探头的放置与监测

  1. 麻醉诱导时，将小鼠暴露于由30%氧气、70% N2O和2.5%异氟烷通过蒸发器产生的气体混合物中。维持麻醉时，异氟烷浓度降至1.5%。在整个手术过程中，小鼠通过呼吸面罩自主呼吸。
  2. 插入直肠温度探头，并将小鼠固定于立体定位仪上，暴露顶骨区域头部。手术期间，小鼠置于温控加热垫上，以维持核心体温恒定在37.0 ± 0.5 °C。行矢状中线切口（长约1 cm）以暴露顶骨颅骨。
  3. 仔细解剖颅骨左侧，并使用速干胶将光纤探头直接固定于冠状缝后方2 mm、外侧5 mm处。随后仔细缝合伤口边缘，以避免脑部低温及感染。
  4. 将小鼠翻转以暴露颈部腹侧。通过连接探头适配器（Master Probe 418-1，Perimed；Järfälla，瑞典）将光纤探头连接至激光多普勒血流仪（PeriFLUX System 5000，Perimed，Järfälla，瑞典）。

注意：在转动小鼠时，应小心弯曲光纤探头，以避免其从颅骨上断裂脱落。

  1. 将激光多普勒血流仪（LDF）设备连接至笔记本电脑。使用 PeriSoft for Windows 软件（版本 2.50，Järfälla，瑞典）开始连续记录 LDF 数值。图1展示了在双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）及再灌注期间，十次 LDF 记录所获得的平均脑血流（CBF）变化过程。

4. 双侧颈总动脉阻断

  1. 麻醉维持方法如3.1节所述。将小鼠仰卧位放置，用胶带将其尾巴和足部固定在加热垫上。沿腹侧正中线做一矢状切口（长约1 cm）。
  2. 仔细分离并游离双侧下颌下腺，以暴露其下方的颈总动脉（CCA）。
  3. 仔细将双侧颈总动脉与其相应的迷走神经及伴行静脉分离，避免损伤这些结构。对迷走神经的操作可能导致短暂性或永久性副交感神经系统功能障碍，进而引发显著的心律失常甚至不可逆的心脏停搏。因此，必须避免对迷走神经进行任何操作。在每侧颈总动脉周围松松地置入一根5-0丝线环形结。
  4. 在每侧颈总动脉与丝线结之间插入一段小硅胶管（直径2 mm）。该硅胶管用作颈总动脉的支撑物，以防止收紧结扎线时损伤动脉壁（图4）。
  5. 通过收紧丝线结，阻断双侧颈总动脉血流1分钟。仅纳入激光多普勒血流仪（LDF）信号下降至<基础值10%的小鼠。在重新开放双侧颈总动脉后，开始5分钟的再灌注期。通过LDF监测确认完全再灌注。若再灌注不完全（即 脑血流量（CBF）恢复程度<基础CBF的90%），则剔除该动物。重复一次1分钟双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）和5分钟再灌注的循环，使总BCCAO持续时间为3分钟。图1展示了在BCCAO和再灌注期间记录的十次LDF测量所得的平均CBF变化过程。操作过程中建议使用生理盐水保持颈部切口湿润。
  6. 最后一次再灌注结束后，移除所有硅胶管、结扎线以及固定在颅骨上的光纤探头，缝合切口，并根据镇痛管理需要反复涂抹利多卡因软膏（Xylocain 2%；AstraZeneca GmbH, Wedel, Germany）。
  7. 将小鼠转移至预热（30 °C）的恢复箱（MediHEAT. PecoServives Ltd. Brough, Cumbria, UK）中，直至其完全恢复意识。之后将小鼠放回动物饲养笼中。

5. 大脑中动脉闭塞

  1. 小鼠重新麻醉后，插入直肠温度探头，并将小鼠置于加热垫上以暴露颈部腹侧。随后，按照BCCAO部分所述方法进行固定。
  2. 使用一根较长的7-0丝线在左侧近端颈总动脉（CCA）周围结扎，并用蚊式钳轻轻将线向尾侧牵拉（图4）。
  3. 在左侧颈外动脉（ECA）周围进行另一处永久性结扎，并将结扎线向动物右侧牵拉（图4）。
  4. 仔细游离包绕左侧颈内动脉（ICA）的结缔组织，轻柔抬起舌下神经，以充分暴露ICA的远端走行。左侧ICA向左弯曲，而翼腭动脉（PPA）则沿近端ICA向右走行（图4）。

注释：还有一条动脉需要辨认，该动脉向右侧走行并朝向尾侧。这是枕动脉，其起始位置存在变异，可能起源于颈总动脉分叉处，也可能起源于颈外动脉的近端（图4）。

  1. 使用5-0丝线在颈内动脉（ICA）近端制作一个松散的缝合环。
  2. 使用小型微血管夹，在5-0松散缝合环的远端暂时阻断颈内动脉（ICA）（图4）。
  3. 使用微血管剪，在颈总动脉（CCA）分叉前的远端部分做一个小切口（图4）。
  4. 将预先选定的硅胶包被单丝线通过该小切口插入颈总动脉（CCA），并推进至颈内动脉（ICA），直至被微血管夹阻挡（图4）。
  5. 小心地从颈内动脉（ICA）上移除微血管夹，同时将单丝线进一步深入推进至颈内动脉（ICA），直至遇到阻力（图4）。 注释：此时，将左手持的镊子翻转，使其不要像握笔一样持握，这有助于更轻松地用镊子夹住丝线。血管夹施加器应由右手持握。可能需要将近端ICA周围的5-0松散缝线略微收紧，以防止切口处出血。
  6. 确认单丝线尖端的准确位置，以检查其是否已进入颈内动脉（ICA）而非咽升动脉（PPA）。如果单丝线尖端误入近端PPA，则应将其轻轻回撤至颈内动脉（ICA）与咽升动脉（PPA）分叉之前，并尝试再次将单丝线推进至颈内动脉（ICA），同时轻轻将近端ICA向右侧牵拉。通过此操作可模拟颈内动脉远端的自然走行，从而更易于进入ICA。
  7. 当单丝线几乎完全进入颈内动脉（ICA）后，收紧围绕近端ICA的5-0松散缝合环，以固定丝线位置。随后剪短所有丝线，缝合皮肤切口。
  8. 术中液体丢失通过腹腔注射1.0 ml生理盐水补充。之后将小鼠转移至预热的恢复箱中，直至完全恢复意识。
  9. 再灌注时，小鼠重新麻醉，小心松开围绕近端ICA的5-0丝线后取出单丝线。随后再次小心收紧5-0缝线，以防止出血。
  10. 确认完全止血后，缝合颈部切口。
  11. 根据需要局部反复涂抹利多卡因软膏以缓解疼痛，并将小鼠转移至预热（30 °C）的恢复箱中，直至完全恢复意识。
  12. 作为大脑中动脉闭塞（MCAO）手术成功的初步提示，可观察到动物出现顺时针转圈行为。功能缺损的严重程度采用改良的小鼠Bederson评分进行量化10。根据该改良Bederson评分，神经功能评分标准如下：0分（运动功能正常）；1分（提起尾巴时躯干和对侧前肢屈曲）；2分（在平坦表面上提起尾巴时向对侧转圈，但静息时姿势正常）；3分（静息时向对侧倾斜）；4分（无自发运动活动或死亡）。

6. BCCAO 假手术

对于BCCAO假手术操作，小鼠需接受与真实BCCAO PC手术相同时间长度的麻醉，分离唾液腺并暴露颈总动脉（CCA）。在假手术过程中，必须避免对颈动脉或迷走神经进行直接操作。对颈总动脉的操作可能损伤其内皮层，导致内皮释放血管活性物质，或在动脉管腔内诱发局部血栓形成。因此，假手术后可能发生血栓栓塞事件，这将对实验结果造成重大干扰。另一方面，对迷走神经的操作可能导致副交感神经系统出现短暂或永久性功能障碍，进而引发显著的心律失常，甚至不可逆的心脏停搏。因此，在BCCAO手术过程中必须避免对迷走神经的任何操作。

术后操作

7. 梗死体积测量

为评估梗死面积，小鼠在MCAO术后存活72小时。随后对动物实施深度麻醉，取出脑组织，于甲基丁烷中快速冷冻，切片后采用Papanicolau染色法进行苏木精染色，以测量梗死体积。脑切片以600 μm的间隔收集，使用图像分析仪（MCID core 7.0 Rev.2.0，GE Healthcare Niagara Inc）测定梗死体积，并根据Lin et al. 7,11的方法对水肿进行校正。

8. 纳入标准

我们仅纳入在每次BCCAO发作期间经激光多普勒血流仪（LDF）测量显示脑血流量（CBF）减少超过90%的动物。理想情况下，应在BCCAO期间对双侧大脑半球均进行LDF监测。出于操作可行性的考虑，我们仅对左侧大脑半球进行了LDF监测，该侧半球后续将接受MCAO处理。该方法此前已有报道6,12。每次BCCAO发作后的再灌注必须完全（即恢复至基线水平）。为了缩短小鼠处于麻醉状态的总时间，我们未在MCAO手术过程中监测CBF。然而，在另一项预实验中，我们使用独立的动物组在MCAO手术期间通过LDF监测了CBF。在该组小鼠中，我们持续观察到在颈总动脉（CCA）闭塞前相比基线CBF减少了90%。此外，在撤除单丝线栓后，CBF恢复至CCA闭塞后相应基线值的>90%。这些LDF标准在文献中已有确立，并可产生一致的梗死体积7。我们仅纳入MCAO术后麻醉恢复后Bederson评分至少为1分的动物。此外，仅纳入MCAO术后存活达72小时且未出现颅内出血迹象的动物。

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结果

我们的BCCAO方案在双侧CCA被阻断时，立即导致脑血流量（CBF）显著降低（>90%）（图1）。通过激光多普勒血流仪（LDF）监测显示，重新开放CCA后血流完全再灌注（图1）。术后动物未表现出任何功能障碍的迹象，且无死亡发生。在另一组动物中，于BCCAO术后72小时进行TUNEL染色，结果显示BCCAO后脑组织中无迟发性细胞死亡的迹象（数据未显示）。

在分析早期缺血耐受（IT）中BCCAO与MCAO之间最佳时间间隔的时间特征（图2）时，我们发现当BCCAO在MCAO前30分钟实施时，与假手术组（n=10）相比，梗死体积显著减小（减少65%，n=10）。此外，当BCCAO在MCAO前2小时和24小时实施时，梗死体积也有所减小（n=10）。其中24小时代表IT的第二个（延迟性）时间窗6。

因此，可以得出结论：以双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激时，早期缺血耐受的最优时间窗为短暂性局灶性脑缺血（MC...

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讨论

在本研究中，我们证明了三次短暂性双侧颈总动脉阻断（BCCAO），每次持续一分钟，随后再灌注五分钟，是一种足以诱导早期缺血耐受的适宜缺血预处理刺激方案。

此外，我们已证明所采用的预处理方案是一种安全且微创的程序，术后无明显并发症，脑组织中无凋亡迹象，且无动物死亡。此前已有多种不同的预处理方案被报道6-7,12。其他研究者曾采用6分钟的双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）作为预处理刺激13-14。然而，由于每次1分钟、共3次的BCCAO在缺血耐受的早期时间窗内已产生保护作用，且未检测到脑缺血性损伤，因此我们决定采用该方案。

为获得一致的结果，麻醉和手术持续时间以及其他变量（如动物体重、手术期间的脑温、术后液体补充、术后疼痛管理以及术前和术后笼内环境丰富化）均应标准化15。在整个麻醉过程中，需特别注意维持小鼠正常体温，因为低温本身具有预处理效应，可能干扰双侧颈总动脉结扎（BCCAO）的效果16。在清醒且自由活动的啮齿类动物中，核心体温通常比相应脑温高约...

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披露

我们没有需要披露的内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双目手术显微镜ZeissStemi 2000 C
显微镜光源ZeissSteREO CL 1500 ECO
带直肠探针的加热垫FST21061-10
立体定位仪David KopfModel 930
剪刀FST91460-11
Dumont #5 镊子FST11251-10
Dumont #7 镊子FST11271-30
微血管夹FST00398-02
血管夹施加器FST00072-14
弹簧剪FST15372-62
持针器FST12010-14
缝合针Feuerstein, SupramaBER 562-20
5-0 丝线缝线Feuerstein, Suprama
7-0 丝线缝线Feuerstein,Suprama
8-0 丝线缝线Feuerstein, Suprama

参考文献

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