执行阴道灌洗、结晶紫染色及阴道细胞学评估以鉴定小鼠动情周期分期

摘要

本文介绍了如何通过简单、非侵入性地采集小鼠阴道涂片样本并进行细胞学评估，来判断小鼠生殖周期的阶段（动情前期、动情期、动情后期或动情间期）。我们进一步阐述了阴道细胞学变化如何反映驱动小鼠生殖周期各阶段转变的循环激素水平。

摘要

快速评估啮齿类动物生殖状态的方法不仅在生殖功能障碍研究中具有重要意义，而且在疾病新小鼠模型的构建以及病理刺激后组织退变（或再生）的激素调控机制研究中也是必需的。小鼠的生殖周期（即动情周期）分为四个阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。这些生殖阶段的转换由卵巢类固醇激素17-β-雌二醇和孕酮、促性腺激素黄体生成素和卵泡刺激素，以及催乳素等激素在血液循环中水平的特征性波动所标志。小鼠阴道道内细胞类型的改变反映了这些内在的内分泌事件。通过每日观察阴道涂片中核上皮细胞、角化鳞状上皮细胞和白细胞的相对比例，可用于判定小鼠所处的动情周期阶段。然而，采集这些样本时所采用的方法若具有侵入性，可能改变动物的生殖状态，并诱发炎症反应，从而干扰涂片的细胞学评估。本文介绍一种简单且非侵入性的操作流程，可用于确定雌性小鼠的动情周期阶段，而不干扰其正常的生殖周期。我们详细说明了如何通过采集和分析阴道涂片中占主导地位的细胞类型来区分动情周期的四个阶段，并阐述了如何结合内分泌状态对这些细胞变化进行解读。

方案

1. 试剂准备

1. 进行无菌阴道灌洗时，将双蒸水（ddH₂O）高压灭菌，并储存于密封容器中，室温保存备用。
2. 用于细胞学评估时，将0.1 g结晶紫粉末加入100 ml双蒸水（ddH₂O）中，充分混匀。结晶紫染液（0.1%）可储存于密封容器中，室温保存备用。

2. 收集阴道细胞（阴道灌洗）

1. 在无菌吸管末端安装一个橡胶吸头 200 μl 尖端吸取约 100 μl 无菌ddH₂O₂使用吸头上的刻度作为体积参考。
2. 将小鼠从小鼠笼中提起，放在笼子的 hopper（盖子）上，使其后端朝向操作者。
3. 牢牢抓住小鼠尾巴，抬高其后躯。此时小鼠仅有前肢抓住加样槽。在此过程中，小鼠可能会排尿。若发生排尿，请等待其排尿停止。若阴道口处残留尿液，可用过量的去离子水冲洗开口处。₂O，使用独立的吸头（即，而不是你的样本采集尖端）。
4. 将ddH₂O的末端放置₂在阴道口处使用O形尖端，注意不要插入开口，因为阴道（和宫颈）刺激可诱导大鼠假孕^1,2最近的报告表明，小鼠对这种效应的敏感性较低，但仍应注意尽量减少重复分析过程中的侵入性程度。³.
5. 轻轻按压胶头，排出约四分之一到一半体积的水（~25-50 μl在阴道口处，液体将自发吸入管腔，无需插入吸头。缓慢释放施加在吸球上的压力，液体将回流至吸头内。避免过快释放压力，以防液体被吸入吸球内部。为达到此目的，可使用带滤芯的吸头。
6. 使用同一吸头、洗耳球和液体重复上一步骤4-5次，以获得单个样本中足够数量的细胞。
7. 将液体置于载玻片上，于室温下静置，使涂片完全干燥。干燥后，可立即对发情期涂片进行染色，或保存后择期染色。

3. 使用结晶紫进行细胞学染色*⁴

1. 将干燥的载玻片放入盛有结晶紫染液的考普林瓶（或其他类似的染色容器）中，染色1分钟。
2. 将载玻片转移至第二个盛有ddH₂O的考普林瓶中，用ddH₂O洗涤1分钟，重复一次。
3. 用轻质擦拭纸轻轻吸去载玻片边缘多余的ddH₂O，注意避免接触染色后的涂片区域。
4. 用移液器吸取约15 μl甘油滴加至涂片及盖玻片上。或者，也可使用其他组织学封片试剂，以获得更持久、不扩散的染色效果。

* 此处描述的染色方法是任何实验室均可执行的最简单操作步骤。其他方法可提供更详细的细胞信息。例如，采用巴氏染色法（Papanicolaou staining）时，有核上皮细胞的成熟度可通过染色差异进行区分：较不成熟的细胞呈青绿色，而较成熟的细胞则呈粉红色或橙色。这些差异可用于判断动情前期的早期或晚期阶段。⁴

4. 阴道细胞学检查

1. 在光学显微镜下检查涂片，以确定存在的细胞类型。染色后应立即进行显微镜检查，因为在使用甘油封片时，结晶紫会随着时间推移从细胞中扩散。分析时应拍摄显微照片，以记录细胞学特征。
2. 首先在较低放大倍数下全面观察整个涂片，选择一个具有代表性的区域，然后转换至更高放大倍数进行观察。您将观察到角化的鳞状上皮细胞、白细胞和/或有核上皮细胞（代表性结果，图1A-C）。根据所见细胞的比例，可判断小鼠在采样时所处的动情周期阶段（代表性结果，图1D-G）及其即时激素状态（讨论，图2）。

5. 代表性结果

细胞学： 在阴道涂片样本中可检测到三种主要的细胞类型：（1）有核上皮细胞（图1A），（2）角化鳞状上皮细胞（图1B），以及（3）白细胞（图1C）。有核上皮细胞的细胞质染色较浅，细胞膜染色较深，细胞核呈椭圆形（图1A）。角化鳞状上皮细胞染色均匀，形状较其前体有核上皮细胞更呈多边形，且无细胞核（图1B）。多形核白细胞可通过其不规则的形态、深染的多形性细胞核以及较小的体积与上皮细胞相区分（图1C，黑色箭头）。若涂片中存在尿液污染，尿酸结晶因其晶体结构与任何预期的细胞类型均不相同而易于识别（图3）。若出现此情况并影响主要细胞类型的判读，则应弃用该涂片，不得用于分期分析。

分期：通过观察涂片中不同类型细胞的相对比例，可以确定小鼠在样本采集当天所处的动情周期阶段（图1D-G）。在动情前期，细胞几乎全部为成簇的圆形、结构完整的有核上皮细胞（图1D，代表性细胞由白色箭头指示）。在动情期，细胞主要为致密成簇的角化鳞状上皮细胞（图1E，代表性细胞由箭头指示）。在动情后期，以小而深染的白细胞为主（图1F，代表性细胞由黑色箭头指示）；可观察到角化鳞状上皮细胞，常呈碎片状（图1F，代表性细胞由黑色箭头指示）。在动情间期，仍可能偶见角化鳞状上皮细胞（图1G，代表性细胞由黑色箭头指示），但白细胞仍占主导地位（图1G，代表性细胞由黑色箭头指示）。动情后期与动情间期的区别在于动情间期可见有核上皮细胞（图1G，代表性细胞由白色箭头指示）。

图1. 阴道涂片的细胞学评估可用于鉴定动情周期阶段。 在阴道涂片样本中可检测到三种主要细胞类型：(A) 有核上皮细胞，(B) 角化鳞状上皮细胞，以及 (C) 白细胞。根据涂片中这些细胞类型的比例如，可判断小鼠处于 (D) 前动情期、(E) 动情期、(F) 动情后期，或 (G) 动情间期，如代表性结果部分所述。E、F 和 G 中的黑色箭头指向典型的角化鳞状上皮细胞。C、F 和 G 中的黑色箭头指向典型的白细胞。D 和 G 中的白色箭头标示出典型的有核上皮细胞。

图 2. 阴道涂片细胞学反映潜在的内分泌事件。 详细说明亦见于讨论部分。 点击此处查看高清大图。

图3. 尿液污染样本经结晶紫染色后可能出现尿酸晶体。 （A）晶体呈透明状，大小不一（箭头及框选区域在（B）中放大显示）。此视野中无细胞存在。若用于细胞学染色的视野中存在尿酸晶体污染，则可能难以准确识别存在的细胞类型，应弃用该涂片。比例尺 = 50 μm。

讨论

这些细胞类型的变化反映了潜在的内分泌事件。动情周期中的动情前期对应于人类月经周期的卵泡期⁵，其特征是循环中17-β-雌二醇水平在排卵前升高⁶，以及催乳素出现小幅激增⁷（图2，动情前期，左侧面板）。17-β-雌二醇的升高间接刺激下丘脑和隔区的促性腺激素释放激素神经元，进而激活垂体前叶中的响应细胞，使其释放黄体生成素和卵泡刺激素进入血液循环^8,9（图2，动情前期，左侧面板）。从处于动情前期动物采集的阴道涂片中，几乎仅见卵圆形有核上皮细胞（图1D，图2，动情前期，右侧面板）。卵泡刺激素水平达到高峰标志着排卵发生并进入动情期^10,11。在动情期期间，17-β-雌二醇水平下降，而催乳素水平达到峰值^6,7（图2，动情期，左侧面板）。阴道涂片以检测到几乎 exclusively 不规则形状的角化鳞状上皮细胞为特征，这些细胞常成团出现（图1E，图2，动情期，右侧面板）。进入动情后期与黄体酮激素水平持续上升同时发生⁶，对应于人类黄体期的开始¹²（图2，动情后期，左侧面板）。随着黄体酮水平开始上升，以及黄体激活后引发17-β-雌二醇水平出现小幅升高^6,13,14（图2，动情后期，左侧面板）。此阶段阴道涂片中存在的细胞类型包括破碎的角化上皮细胞以及较小、染色较深的白细胞（图1F，图2，动情后期，右侧面板）。最后，小鼠进入动情间期，循环中黄体酮水平达到峰值⁶，对应于人类黄体晚期¹²。随着黄体退化，黄体酮水平随之急剧下降^15,16（图2，动情间期，左侧面板）。在动情间期的涂片中，白细胞占主导地位。角化上皮细胞的频率减少，而在即将过渡至动情前期时，开始重新检测到有核上皮细胞（图1G，图2，动情间期，右侧面板）。

总之，如果采取以下预防措施，这一简单且常规的实验方案可用于估计实验小鼠每日的激素波动并确定其动情周期阶段，同时不改变其生殖状态。应采用本文所述的非侵入性方法进行取样，每天最多取样一次，以避免反复插入阴道、抽吸和搅动，这些操作可能导致阴道刺激，引发炎症反应¹⁷，从而使白细胞及其他细胞类型出现在涂片中，干扰细胞学评估。此外，即使在群体饲养的雌性小鼠中，不同个体出现延长的动情间期和动情期，以及静止期的诱导，均属正常现象¹⁸；准确识别这些阶段对于解释生殖、性别及疾病相关研究中的激素影响具有重要意义。动情周期长度的变异性也受年龄以及雌性小鼠群体内饲养条件（单独或群养）差异的影响^7,19-21。在单性别雌性群体中饲养的雌鼠可能停止动情周期，进入持续的动情间期状态^18,22,23，但通过暴露于经雄性尿液预处理过的笼具，可重新启动动情周期^24,25。因此，为确定某只小鼠个体的动情周期长度，建议谨慎地每日进行本文所述的非侵入性评估，直至观察到两个完整的动情周期为止。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌 200 μl 吸头	Diamed	E340901
乳胶吸球（1 ml）	Fisher	03-488-21
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-15
结晶紫染色液（25 g）	Fisher	C581-25
轻型擦拭纸	VWR	82003-820
甘油	Fisher	BP229-1
显微镜盖玻片（22×30）	Fisher	12-544A