介绍了一种从小鼠生殖道中高效分离淋巴细胞的方法。该方法利用酶消化和Percoll梯度分离，实现高效的细胞分离。此技术也可适用于其他物种。
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本文内容
摘要
摘要
胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道等黏膜表面为病毒和细菌等病原体提供了入侵门户 1黏膜也是宿主产生抗病原体免疫反应的诱导部位，例如肠道中的派伊尔集合淋巴结和呼吸道中的鼻相关淋巴组织。这一独特特性使黏膜免疫成为宿主防御系统中的关键组成部分。许多研究集中于胃肠道和呼吸道黏膜部位，但对生殖道黏膜部位的研究却较少。生殖道黏膜是性传播疾病（STD）包括细菌和病毒感染的主要感染部位。性传播疾病是当今世界面临的最严重的健康挑战之一。美国疾病控制与预防中心估计，美国每年有1900万例新的性传播感染病例，性传播疾病每年给美国医疗系统带来170亿美元的经济负担。 2，给个体带来更严重的即时及终身健康后果。为应对这一挑战，需要更深入地理解生殖道黏膜免疫，而分离淋巴细胞是此类研究的基本组成部分。本文介绍一种可重复地从小鼠雌性生殖道分离淋巴ocytes用于免疫学研究的方法，该方法可经修改后适用于其他物种。以下方法基于一只小鼠。
方案
1. 生殖道的摘除
- 根据批准的指南实施小鼠安乐死。做低位正中切口并牵开皮肤。
- 分离并完整取出从输卵管至阴道开口的整个生殖道。
- 用剪刀沿纵轴方向将整个生殖道完全剪开。
- 在含有完全RPMI-10/EDTA培养基的培养皿中（配方见下文），用精细手术剪将生殖道组织剪成细小碎片（约 <1 mm），然后将组织转移至125 ml锥形瓶中，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟。此步骤重复两次，之后弃去含有上皮细胞及其他碎片的上清液。
- 将锥形瓶中的内容物通过细胞滤网（40 μm）过滤。用完全培养基冲洗残留的EDTA。
完全RPMI/10：RPMI 500 ml（Gibco），10% 胎牛血清（FBS），热灭活，青霉素/链霉素 5 ml，1 M HEPES 5 ml。
完全RPMI-10/EDTA：10% RPMI（同上）加入5 μM EDTA
2. 消化生殖道组织
- 将组织块转移至含有 20 ml 新鲜 RPMI-10/胶原酶的新培养瓶中（见下文配方），并在 37 °C 下使用磁力搅拌器剧烈搅拌，消化 1 小时。
完全 RPMI-10/胶原酶：使用前，将胶原酶 VIII 型（Sigma；于 -20 °C 保存，或根据制造商说明）重悬，加入完全 RPMI/10 中，终浓度为 450–500 U/ml。 - 第一次消化后，通过 100 μm 细胞筛过滤收集上清液，并将细胞置于冰上保存。
- 将未消化的组织转移至新培养瓶，并使用新鲜的完全 RPMI-10/胶原酶重复步骤 2.1 两次，共进行三次独立的消化。此时，溶液中应无可见的组织块。
- 合并来自同一样本的所有上清液，通过 100 μm 细胞筛过滤收集，离心沉淀细胞。细胞沉淀将通过 Percoll 梯度分离。
3. 使用 Percoll 梯度分离生殖道细胞
- 使用前准备每种浓度的 Percoll：
- 100% 等渗 Percoll：按 9:1 的比例将 Percoll 原液（Pharmacia Biotech）与 10x PBS 混合，用 HCl 调节 pH 至 7.4。
- 40% Percoll 溶液：将 40 ml 的 100% 等渗 Percoll 与 60 ml 完全 RPMI 培养基混合。
- 70% Percoll 溶液：将 70 ml 的 100% 等渗 Percoll 与 30 ml 完全 RPMI 培养基混合。
- 将第 6 步所得的每个细胞沉淀重悬于 40% Percoll 溶液中。使用等体积的 70% Percoll 溶液以形成梯度。梯度管的制备有两种方法：
- 下层叠加法：先将含细胞的 40% Percoll 悬液加入梯度管中，然后小心地将 70% Percoll 从下方叠加。
- 上层叠加法：先将 70% Percoll 加入离心管中，然后缓慢而轻柔地将含有细胞的 40% Percoll 溶液叠加在上层。
- 梯度样品在室温下以 900 × g 离心 20 分钟，关闭刹车。
- 淋巴细胞将位于 40% 与 70% Percoll 层之间的界面处。小心收集界面层，用 RPMI 按 1:3 比例洗涤，然后在 740 × g 下离心沉淀。淋巴细胞将存在于细胞沉淀中，可用于后续实验。
4. 代表性结果
从小鼠生殖道分离淋巴细胞并进行流式细胞术（FACS）分析的示例如图1所示。在经阴道感染Chlamydia muridarum的小鼠感染后第7天，取出其生殖道组织。将两只小鼠的生殖道组织合并，以获得足够数量的淋巴细胞用于FACS检测其功能和表型。分离的组织按照上述方法进行消化和细胞分离处理。单细胞悬液使用多种荧光素标记的抗小鼠CD3、CD4和CD8单克隆抗体进行染色。图1展示了在CD3阳性T淋巴细胞门控基础上，CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞的散点图。本方法可用于分析来自不同疾病模型小鼠生殖道的淋巴细胞，以评估小鼠模型中不同疾病状态下各种免疫细胞的功能和表型特征。这些免疫细胞包括树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、T细胞（抗原特异性T细胞）、B细胞等3-10。
图 1. 采用本文所述方法，从感染了Chlamydia muridarum的小鼠生殖道中分离出淋巴细胞。完成完整的分离步骤后，使用荧光染料标记的 CD3、CD4 和 CD8 抗体对淋巴细胞进行染色。象限数据基于 CD3+ 淋巴细胞设门，显示 CD4+ 与 CD8+ 细胞的分布情况及设门细胞的百分比。
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讨论
本方案展示了如何从小鼠生殖道制备淋巴细胞，该方法易于掌握。此过程最关键的步骤是将细胞置于冰上以维持细胞活性。本方法获得的细胞数量取决于操作技术、操作技巧、小鼠的感染状态（未免疫或感染后某天）、病原体类型（细菌、病毒、真菌）以及所检测的小鼠生殖道部位（输卵管、子宫、阴道段或整个生殖道）。我们课题组及其他研究团队已发表多项关于小鼠生殖道不同淋巴细胞群体的研究5-7。据我们经验，一只未免疫的BALB/c小鼠的整个生殖道可获得约2×106个细胞，细胞活性可达90%。在许多情况下，所分离的淋巴细胞将用于进一步的功能分析和/或流式细胞术分析3-10。与常用的分离方法11相比，本方法的细胞得率提高了10倍。该操作流程相对较长，但可根据分离后淋巴细胞的后续用途进行简化。当细胞用于非功能性检测（如流式细胞术分析）时，可省略Percoll梯度离心步骤以缩短操作时间。本方法为研究黏膜淋巴细胞提供了强大而高效的工具，有助于感染性疾病研究，并推动后续疫苗的研发。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的基金资助，项目编号为 R01-AI026328（KAK）和 R01-AI079004（KAK）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶 | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
参考文献
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