小鼠生殖道黏膜淋巴细胞分离

1。去除生殖道

1. 安乐死鼠标采用批准的指引。低正中切口，并收回皮肤。
2. 隔离和删除整个生殖道，由输卵管阴道口。
3. 打开整个道纵向剪下来的。
4. 良好的手术剪刀切下生殖道细小的碎片（<1毫米左右），一个培养皿完整的RPMI-10/EDTA（见下面的公式），并于125毫升容量瓶中，在室温下搅拌组织在磁力搅拌器上设置15分钟。此过程重复两次，然后将上清液，其中包含上皮细胞和其他碎片，被丢弃。
5. 倒入烧瓶的内容，通过细胞过滤器（40微米）。洗掉EDTA的残余物用完全培养基。
   完整RPMI/10::RPMI500毫升（Gibco）中，10％胎儿牛血清（FBS），热灭活，5 ml青霉素/链霉素，5毫升1M HEPES。
   完整RPMI-10/EDTA:10％RPMI（定义如上）与5μMÊDTA

2。消化生殖道组织

1. 组织片转移到一个新的的烧瓶用20毫升新鲜RPMI-10/collagenase（见下面的配方），并设置为大力搅拌组织在磁力搅拌器上的1小时，在37℃下消化组织。
   以完整的RPMI-10/collagenase:用鼠标右键，重组型胶原酶VIII（Sigma公司;储存在-20°C，或根据制造商的说明。），在使用前，添加到完整的RPMI/10终浓度为450-500U/ml。
2. 第一消化后，收集上清液，通过100μm的细胞过滤网，将细胞置于冰上保持。
3. 未消化的组织转移到新的烧瓶中，并重复执行步骤2.1两次使用的新鲜完全RPMI-10/collagenase为共3个独立的消化。此时，无肉眼可见的组织片应该是在溶液中。
4. 池的上清液一起从样本收集到100微米的细胞过滤。旋转的c英语学习生下来。将使用Percoll密度梯度分离细胞沉淀。

3。使用Percoll密度梯度分离生殖道细胞

1. 使用前准备每个浓度的Percoll:
   • 100％等渗Percoll密度:混合9:1股票的Percoll（Pharmacia公司Biot​​ch）与10倍的PBS。 pH值7.4使用HCL。
   • 40％的Percoll溶液:混合40毫升100％等渗Percoll密度和60毫升的完全RPMI中。
   • 70％的Percoll溶液:混合70毫升100％等渗的Percoll用30毫升完全RPMI。
2. 每个细胞沉淀重悬，从40％的Percoll解决方案中的步骤6。将等体积的70％的Percoll将被用于使梯度。建立梯度管的方法有两种:
   1. 在层:细胞悬液与40％的Percoll成梯度管，然后小心地根据层70％的Percoll。
   2. 过层:第一管中加入70％的Percoll，然后小心地慢慢地加载含有上的细胞的40％的Percoll顶部。
3. 将样品离心梯度@ 900×g离心，室温，20分钟，与制动切断。
4. 淋巴细胞，将在40％和70％的Percoll层之间的界面层。小心收获的接口层，洗与RPMI 1:3，在740 XG降速。淋巴细胞的细胞沉淀中，并准备好以供进一步使用。

4。代表性的成果

从小鼠生殖道和流式细胞术（FACS）分析淋巴细胞的隔离的一个例子是在图1中所示。生殖道衣原体muridarum从阴道内感染的小鼠在感染后7天。两个生殖道汇集在一起​​，以便有足够的淋巴细胞的功能和表型检测用流式细胞仪。解剖组织进行处理，正如上文所述的步骤的消化和隔离。单细胞悬浮液染色各种荧光染料共轭对小鼠CD3，CD4和CD8的单克隆抗体。图1示出的CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞对CD3阳性T淋巴细胞门控的点积呈列。我们的程序可以检查不同的疾病模型生殖道分离出的淋巴细胞，在不同的疾病小鼠模型，以评估各种免疫细胞的功能和表型特征。这些包括不同的免疫细胞，如树突状细胞，中性粒细胞，巨噬细胞的NK细胞，NKT细胞，T细胞（抗原特异性的T细胞），B细胞等^3-10。

图1。淋巴细胞中分离出小鼠的生殖道感染衣原体muridarum的 ，这里介绍的方法使用。后完整的分离过程中，与荧光染料共轭的CD3，CD4和CD8淋巴细胞染色。象限数据选通淋巴细胞CD3 +，显示CD4 +与CD8 +和门控细胞的百分比。

没有利益冲突的声明。