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方法文章

使用3DNA分析与构建核酸结构

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DOI：

10.3791/4401

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2013年4月26日

 ,  , 
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

本文内容

摘要

3DNA 软件包是一种广受欢迎且功能多样的生物信息学工具，能够分析、构建和可视化三维核酸结构。本文介绍了 3DNA 中部分新近且常用功能的详细操作流程，适用于单个结构以及相关结构集合的分析。

摘要

3DNA 软件包是一种广受欢迎且功能多样的生物信息学工具，能够分析、构建和可视化三维核酸结构。本文介绍了 3DNA 中部分新近且常用功能的详细操作流程，适用于单个结构以及相关结构集合的分析。方案 1 列出了下载和安装该软件所需的操作指令。接着在方案 2 中，对核酸结构进行分析，包括碱基配对的指认以及描述结构的刚体参数的确定；方案 3 描述了如何根据刚体参数重建结构的原子模型。最新版本的 3DNA（版本 2.1）新增了用于分析和操作结构集合的功能，例如来自核磁共振（NMR）测量和分子动力学（MD）模拟所推导出的结构集合；这些功能在方案 4 和方案 5 中予以介绍。除了 3DNA 独立软件包之外，位于 http://w3dna.rutgers.edu 的 w3DNA 网络服务器还提供了对该软件部分功能的用户友好型界面。方案 6 演示了该网站的一项新功能，即在用户指定位置构建带有结合蛋白的长 DNA 分子模型。

引言

了解 DNA、RNA 及其与蛋白质、药物和其他配体复合物的三维结构，对于阐明它们多样的生物学功能以及合理设计治疗药物至关重要。对这些结构的探索包含三个独立但又密切相关的组成部分：分析（提取形状和相互作用中的模式）、建模（评估能量学和分子动力学）以及可视化。结构分析与模型构建本质上是同一过程的两个方面，而可视化则对这两者起到补充作用。

3DNA 计算机程序套件是一个日益流行的结构生物信息学工具包，具有分析、构建和可视化三维核酸结构的功能。早期的出版物已概述了该软件的功能1，提供了执行选定任务的实验方案2，引入了该软件流行功能的基于网络的界面3，展示了使用收集的结构特征数据库 3DNA4, 5 并展示了该软件在DNA和RNA结构分析中的应用价值6, 7.

本文旨在将3DNA软件工具包介绍给实验室科研人员及其他对利用先进计算工具研究DNA和RNA空间结构感兴趣或有需求的人员。本文提供的实验方案包含逐步操作指南：（i）在Mac OS X系统上下载并安装该软件；（ii-iii）在组成碱基对步骤的层面上分析和修改DNA结构；（iv-v）分析并比对相关DNA结构的集合；（vi）通过用户友好的w3DNA网页界面构建蛋白质结合DNA链的模型。该软件能够分析通过X射线晶体学方法解析的单个结构，也能够分析通过核磁共振（NMR）方法测定或计算机模拟技术生成的大规模结构集合。

此处检测的结构包括：(i) DNA 与 Hbb 蛋白结合的高分辨率晶体结构 Borrelia burgdorferi8 （通过蜱虫传播、可导致人类莱姆病的细菌）9, 10)，（ii）通过分子模拟生成的两组序列相关的大型DNA分子集合11 - 4,500 张 d(GGCAAAATTTTGCC) 的快照2 和 d(CCGTTTTAAAACGG)2 以100皮秒为间隔在计算过程中采集，以及(iii)一组基于NMR的O3 DNA操纵子与头结构域结合的复合物结构集合 大肠杆菌 Lac阻遏蛋白12以下说明包含如何访问与这些结构相关的原子坐标文件的信息，以及如何使用 3DNA（该文件的副本可在 3DNA 论坛上找到） http://forum.x3dna.org/jove）以观察和修饰这些结构。

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方案

1. 软件包的安装

  1. 访问 3DNA 网站 http://x3dna.org，点击进入 3DNA 论坛链接。在论坛中选择“注册”链接，并按照说明创建新账户。
  2. 以下说明详细描述了在基于 OS X 的 Macintosh 计算机上安装该软件的过程，该计算机使用默认的“bash”shell。有关在 Linux 或 Windows（Cygwin、MinGW/MSYS）系统上使用常用 shell（包括“tcsh”）的安装步骤，请参见 3DNA 论坛中的说明。
  3. 在建立用户名和密码后，登录论坛。在欢迎区域选择“下载”链接，然后在新页面中选择“3DNA 下载”。这将引导您进入 3DNA 下载页面，在此可下载软件的不同版本。
  4. 选择 Mac OS X Intel 链接，以下载包含软件的压缩 tarball 文件（tar.gz）。
  5. 双击（tar.gz）文件，生成一个名为 x3dna-v2.1 的文件夹。此文件夹包含 3DNA 软件套件，可移动至任意位置。为便于本操作流程的说明，我们将该文件夹拖放到“应用程序”目录中。此时，tar.gz 文件已完成其用途，可将其删除。
  6. 打开通常位于“实用工具”下的“终端”应用程序，并使用以下命令切换到第 5 步创建的 x3dna-v2.1 目录（以下所有指令均以回车符结束）：
    cd /Applications/x3dna-v2.1
  7. 输入以下命令以运行使 3DNA 正常运行所需的设置脚本：
    ./bin/x3dna_setup
  8. 复制第 7 步中打印出的两行 export 设置。如果用户已将软件放置在“应用程序”目录中，则这两行应如下所示：
    export X3DNA=/Applications/x3dna-v2.1
    export PATH=/Applications/x3dna-v2.1/bin:$PATH
    如果用户选择将软件安装在其他目录，则 export 命令中将显示不同的目录名称，该名称将替代上述命令中的“Applications”。请注意，如果默认 shell 为“tcsh”而非“bash”，则这两行内容应为：setenv X3DNA /Applications/x3dna-v2.1 和 setenv PATH /Applications/x3dna-v2.1/bin:$PATH。
  9. 在“访达”中检查您的计算机上是否已存在名为 '.bashrc' 的文件。
  10. 打开位于“应用程序”目录中的“文本编辑”应用程序，并在“格式”菜单下选择“转换为纯文本”。
  11. 如果第 9 步中的 '.bashrc' 文件已存在，请在文本编辑中打开该文件，并将第 8 步中的 export 设置粘贴至文件末尾。如果不存在 '.bashrc' 文件，请将第 8 步中的 export 设置粘贴到一个空白文件中，并在您的主目录中将其保存为 '.bashrc' 文件。（主目录在 Macintosh 上以“房屋”图标表示。）
  12. 为使新设置生效，您必须在终端程序中使用以下命令运行新保存的 '.bashrc' 文件：
    source ~/.bashrc
  13. 3DNA 套件现已安装到您的系统中，您可在终端程序中执行协议 2 至协议 5。协议 6 则通过 w3DNA 执行，w3DNA 是 3DNA 软件部分功能的网页界面。

2. 晶体结构分析

  1. 我们以结合在伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）Hbb蛋白上的DNA结构为例，说明核酸结构的分析方法8。该结构对应的原子坐标文件可在蛋白质数据库13（PDB；http://www.rcsb.org）中获取，其结构标识符为2np2。随附的补充数据中包含该文件的副本，也可在3DNA论坛的以下网址获取：http://forum.x3dna.org/jove。
  2. 使用3DNA分析该结构的第一步是生成一个列出所有配对碱基的文件。可通过运行'find_pair'程序实现，输入以下命令：
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    其中，2np2.pdb是上述原子坐标输入文件，2np2.bps是输出的文本文件，包含碱基配对信息。用户可根据需要查看或编辑该碱基配对文件。
  3. 分析的下一步是确定表征该结构的几何参数。这些参数包括标准化学扭转角14、描述糖环折叠状态的伪旋转角15、描述碱基及相邻碱基对排列方式的刚体参数16，以及其他三维化学结构的度量指标。'analyze'命令以第2步生成的碱基对文件作为输入，并生成多个输出文件，这些文件将出现在当前工作目录中。输入以下命令即可完成计算：
    analyze 2np2.bps
    本示例中使用的输出文件包括2np2.out，其中包含所计算参数的概览，以及bp_step.par，其中列出了上述刚体参数。后者文件可轻松导入电子表格程序，用于进一步分析和绘图。参见代表性结果（图1）中的示例。

3. 基于刚体参数构建DNA结构

  1. 除了分析核酸结构外，3DNA 软件还提供了使用“rebuild”命令从刚体参数构建结构模型的功能。在本实验方案中，我们将展示如何构建两个 DNA 螺旋模型：首先使用在方案 2 中计算得到的 Hbb-DNA 复合物的刚体参数，然后使用一组经过修改的参数，其中选定的 roll 角度被改变。roll 角度用于衡量连续碱基对向 DNA 沟槽弯曲的程度16正值的滚动角（roll）与主沟槽变窄相关，负值则与次沟槽变窄相关。标准参考坐标系17 被3DNA及其他主流核酸分析软件所采用 例如 曲线+18确保了在计算沃森-克里克碱基对参数时的数值一致性。
  2. 默认情况下，3DNA 的“rebuild”功能将生成仅包含碱基中原子坐标的精确原子模型。为了创建包含骨架和碱基原子坐标的近似原子模型，请输入以下命令：
    x3dna_utils cp_std bdna
    该命令指示3DNA在根据刚体参数构建模型时引入标准的B型DNA骨架构象。
  3. 要使用 Hbb-DNA 结构中发现的刚体参数构建双螺旋模型，请输入以下内容：
    rebuild -atomic bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    此处“-atomic”表示构建包含所有重原子（非氢原子）坐标信息的全原子模型，“bp_step.par”是协议2第3步生成的文件，其中包含输入的刚体参数，“2np2_rbld_org.pdb”则是所构建结构的原子坐标输出文件。该输出文件遵循PDB格式规范，因此以“.pdb”作为扩展名。
  4. “bp_step.par”文件可进行编辑以生成修饰后的结构。在Macintosh系统上，可按照方案1步骤10所述，使用TextEdit应用程序进行修改。
  5. 在此，我们修改两个最大弯曲位置处形成的极端滚动角。这些以度为单位的数值，在第17行由64.95、在第26行由60.93均更改为零。我们将修改后的文件另存为新名称“bp_step_roll0.par”，并关闭 TextEdit 程序。
  6. 我们使用修改后的步骤参数集作为输入文件，通过键入以下命令来构建结构，如步骤3所示：
    rebuild -atomic bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. 这两个模型可以在标准的分子查看器（如 PyMOL）中查看，www.pymol.org），使用生成的坐标文件（.pdb）作为输入。参见代表性结果（图2用于重建结构图像的图像。

4. 多模型结构文件的分析

  1. 与协议2中分析单个含核酸结构的方法不同，此处我们展示如何分析大量结构的集合。我们考察了通过分子动力学（MD）模拟获得的一系列14个碱基对DNA链中，随时间变化的刚体参数11。该分析共包含4,500个结构，这些结构在MD计算中以100皮秒为间隔提取，并保存在4,500个独立的文件中。随附的补充数据包括这些文件的副本，以及另一组4,500个文件，用于反向序列DNA的模拟（参见引言文本中碱基的精确顺序）。这两组文件以及一个较小的数据子集也可在3DNA论坛获取，网址为 http://forum.x3dna.org/jove。
  2. 分析的第一步与协议2中的步骤相同，即运行“find_pair”程序识别配对碱基。由于整个结构集合具有相同的碱基配对方案，因此只需在代表性文件上运行一次“find_pair”即可。此处我们选择在含有中心AT步的DNA链模拟中的第1001个结构，其文件名为md_AT_set1.pdb.1001。以下指令生成碱基配对信息，并将其存储在文件md_AT_set1.bps中：
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    用户可检查已识别的碱基配对情况，并根据对结构的了解手动修改该文件。
  3. 下一步是使用“x3dna_ensemble analyze”命令确定整个结构集合的几何参数。该程序的输入包括第二步生成的碱基对文件（md_AT_set1.bps）以及一个列出待分析结构的文件。后一个文件在此称为md_AT_set1.list，其中包含4,500个待分析文件，文件名按MD模拟生成的顺序逐行列出。该文件的副本包含在补充材料中，也可在3DNA论坛获取。需要提醒用户的是，由于文件数量庞大，计算时间可能较长（在AMD Phenom II X4 965处理器上约为每1,000个文件20分钟）。通过输入以下命令运行程序：
    x3dna_ensemble analyze -b md_AT_set1.bps -l md_AT_set1.list -o md_AT_set1.out
    在上述示例中，“-b”指第二步创建的碱基对文件，“-l”表示提供了一个文件列表，“-o”允许用户为输出文件指定名称。该命令支持多种选项，例如选择特定模型。用户可输入“x3dna_ensemble analyze -h”以获取更多关于这些选项的信息。
  4. 下一步是从第三步生成的总览输出文件md_AT_set1.out中提取所需的刚体参数。此操作通过“x3dna_ensemble extract”命令完成。输入“x3dna_ensemble extract -l”可列出所有可用的几何参数。此处我们提取roll角，并使用以下命令创建一个以逗号分隔的文本文件（CSV）：
    x3dna_ensemble extract -p roll -s , -f md_AT_set1.out -o md_AT_set1_roll.csv
    该命令中的“-p roll”指定要提取的参数，“-s ,”表示生成逗号分隔文件，“-f”指明来自集合分析命令的输出文件，“-o”允许用户为所有分析结构中沿DNA的roll角CSV输出文件命名。该文件可导入其他程序进行进一步分析和绘图。有关上述两组MD生成数据集中roll角变化的分析，请参见代表性结果（图3），生成这些图像所用的MATLAB脚本可在3DNA论坛获取。

5. 多模型结构叠加至公共参考坐标系

  1. 最新版本的3DNA（版本2.1）新增了一项功能，允许用户从共同的视角观察多个结构。“x3dna_ensemble reorient”命令可将一组相关结构叠加到一个共同的碱基对或碱基对步上。以下方案将此功能应用于NMR解析的O3 DNA操纵区与Lac阻遏蛋白头部结构域结合的结构12。这些结构以多模型结构文件的形式存储于PDB数据库中，其标识符为2kek，该文件在一个单一文件中包含了所有结构模型，不同于方案4中为4,500个模型分别使用的独立文件。随附的补充数据中包含此文件的副本，也可在3DNA论坛获取：http://forum.x3dna.org/jove。
  2. 与之前的方案相同，第一步是使用“find_pair”程序计算DNA的碱基配对。在此情况下，我们以“2kek.pdb”文件作为输入，并输入以下命令：
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    碱基配对基于PDB文件中的第一个模型生成。可根据已知结构信息，对输出的碱基对文件“2kek.bps”进行手动修正。
  3. 程序“x3dna_ensemble reorient”会将多模型结构中的各个独立模型对齐至一个共同的参考坐标系。该程序需要前一步生成的PDB文件和碱基配对文件作为输入，运行命令如下：
    x3dna_ensemble reorient -b 2kek.bps -f 1 -e 2kek.pdb -o 2kek_fr1.pdb
    其中，“-b”选项指定碱基配对文件，“-f 1”表示所有结构将对齐至第1个碱基对，即序列链5´端的第一个碱基对，“-e”指定输入的集合文件，“-o”允许用户指定输出文件名，此处为“2kek_fr1.pdb”。更多关于命令选项的信息可通过输入“x3dna_ensemble reorient -h”获取。有关对齐后结构的讨论，请参见代表性结果（图4）。

6. 蛋白质修饰的DNA分子的构建

  1. w3DNA 网络界面包含了 3DNA 软件包的一些常用功能。本文重点介绍利用该网络服务器构建蛋白质修饰 DNA 的三维模型的能力。结合的 DNA 片段采用所选蛋白质-DNA 复合物的刚体参数，此处为在方案 2 中分析的与 Hbb 蛋白结合的 DNA 参数值。未结合的 DNA 区域可采用三种用户选定的螺旋构型之一（A 型、B 型或 C 型）。A、B 和 C 分别指通过早期纤维衍射实验获得的三种经典的 DNA 模型，其双螺旋每圈分别包含 11、10 和 9 个碱基对19-21。
  2. 构建蛋白质修饰 DNA 模型的第一步是访问位于 http://w3dna.rutgers.edu 的 w3DNA 网站。在页面左上角菜单中选择“Reconstruction”即可激活在线建模功能。
  3. 下一步是在新页面中间浅色框内选择“Bound Protein-DNA template”链接。此选择将激活一个下拉菜单，允许用户指定结合蛋白质的数量。此处我们选择两个结合的蛋白质，然后点击“Continue”按钮。请注意，模型大小限制为最多 1,000 个碱基对（即 2,000 个核苷酸）和最多 30 个结合的蛋白质。
  4. 选定结合蛋白质数量后，将进入一个类似于图 5所示的参数设置页面。该页面允许用户指定 DNA 序列、未结合 DNA 的螺旋构型，以及结合蛋白质的身份和位置。
  5. 用户在参数设置页面中间的文本框中输入或粘贴所需的序列（图 5，标签 1）。注意仅接受标准残基：A、T、C、G 和 U。此处我们输入一个由 81 个碱基对组成的同聚物序列，完全由 A·T 碱基对构成，其中 A 位于携带序列的链上。
  6. 在文本框下方有一个下拉菜单（图 5，标签 2），用于选择未结合 DNA 区域的螺旋构象。本示例中我们选择 B 型构象。
  7. 在参数设置页面底部附近有一个文本框，用于输入结合位置及结合蛋白质的文件名（图 5，标签 3）。结合位置指定了蛋白质结合片段在 DNA 序列上的中心位置。如果结合的 DNA 包含奇数个碱基对（如 Hbb-DNA 结构），则结合位置表示该片段中间碱基对的位置。在 Hbb 结合 DNA 的情况下，该中间碱基对为 T·T 错配。在本示例中，我们将两个 Hbb 蛋白结合到 DNA 模板上，T·T 错配分别位于 81 碱基对 DNA 序列的第 20 和第 63 位。需要注意的是，结合片段的序列不必与第 5 步中输入的序列一致。如果蛋白质结合区域包含偶数个碱基对，则结合位置表示 DNA 上中间碱基对步（base-pair step）的位置，即结合片段的中心碱基对步位于第 n 和 n +1 个碱基对之间，其中 n 为指定的序列位置。此外请注意，只要某种蛋白质与 DNA 的复合物结构已知并以标准 PDB 格式存储，用户即可使用该蛋白质修饰 DNA13。
  8. 在参数设置页面底部有一个选项框，允许用户生成蛋白质结合 DNA 的预览图（图 5，标签 4）。此处我们勾选该框并点击“Continue”按钮。此操作将生成一个审查页面，列出所选参数以及可能因结合位点重叠而产生的任何错误。用户可点击“Back”按钮进行修改，或点击“Build”按钮继续。
  9. 下一页将显示 DNA-蛋白质复合物在其最伸展构型下的静态图像，并支持通过 Jmol 和 Webmol 进行在线交互式可视化。用户还可以下载符合 PDB 格式规范的坐标文件（.pdb）。方法是点击生成图像下方的“Download the rebuilt pdb file”链接。该文件可轻松导入分子图形软件中进行进一步可视化。有关上述 Hbb 修饰 DNA 的示例以及一条稍长（86 个碱基对）且 Hbb 位于第 20 和第 67 位的链，请参见代表性结果（图 6）。

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结果

3DNA 软件工具通常用于分析核酸结构。例如，在核酸数据库（Nucleic Acid Database）22（全球核酸结构信息资源库）中，每条新收录的数据都会自动计算并存储碱基对的类型以及表征 DNA 和 RNA 结构中双螺旋片段碱基排列方式的刚体参数。使用方案 2 所确定的刚体参数值能够清晰揭示三维结构中的畸变情况，例如在 Borrelia burgdorferi Hbb 蛋白的晶体复合物中，AT·AT 步骤 13 和 22 处出现的两处 DNA 向大沟方向显著弯曲的现象，其滚转角（roll angle）均为较大正值（分别为 64.95° 和 60.93°）8（图 1）。

该软件通过方案3利用这些参数重建结构的能力，使得确定单个碱基和碱基对步长如何影响整体分子折叠成为可能。如图所示 图2Hbb 诱导的 DNA 全局弯曲不仅反映上述两种极端的碱基对倾斜畸变，而且当这些碱基对步骤被拉直后重建 DNA 结构时，DNA 仍保持高度弯曲。 即 ...

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讨论

本文介绍的一系列实验方案仅涉及3DNA程序套件功能的一部分。这些工具可用于RNA结构，以识别非经典碱基对，确定此类配对发生的二级结构环境，量化螺旋片段的空间排布，测量沿链骨架的碱基重叠程度等。rebuild命令允许用户构建简洁且信息丰富的碱基和碱基对的块状表示形式，如图1插图所示。构建工具还包括在给定结构模板上“穿线”不同序列、生成多种双链、三链和四链DNA结构模型、将模型定向至特定方向等功能。最后，3DNA在多个其他项目中发挥了重要作用，例如：用于核酸溶剂化分析的SwS网络服务27；用于比对RNA三级结构的ARTS网络服务器28；用于分子动力学结果分析与结构预测的MDDNA网络工具29；基于信息驱动的HADDOCK蛋白-DNA对接方法30；用于RNA结构功能注释的SARA服务器31；3D-DART DNA结构建模服务器32；用于蛋白-DNA复合物结构分析的3D-footprint数据库33；用于识别RNA结构中三维片段的RNA FRABASE 2.0...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢 Jiří Šponer 分享了通过分子动力学模拟生成的 DNA 双螺旋结构坐标。同时感谢 Nada Spackova 在下载这些结构过程中的协助。本工作得到了美国公共卫生服务研究基金 GM34809 和 GM096889 的资助，特此致谢。

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参考文献

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