基于探头的尿路共聚焦激光内窥显微技术：操作方法

摘要

基于探头的共聚焦激光内窥显微技术可在膀胱镜检查期间实现对人体泌尿道的实时显微成像，以细胞级分辨率动态观察膀胱癌等病理状态。内窥显微技术可提高标准白光内窥镜检查的诊断准确性，并为术中提供影像引导，从而改善手术切除效果。

摘要

基于探针的共聚焦激光内窥显微技术（CLE）是一种新兴的光学成像技术，可在常规内窥镜检查过程中实现对黏膜表面的实时活体显微成像。目前该技术已应用于呼吸系统¹和消化道^2-6，并在泌尿系统中用于膀胱癌的诊断研究^7-10。CLE 能够以微米级分辨率实时显示细胞形态和组织微结构，同时可动态观察正常及病变血管系统⁷。

基于探针的共聚焦激光显微内镜系统（Cellvizio，Mauna Kea Technologies，法国）由一个可重复使用的光纤成像探针与488 nm激光扫描单元耦合组成。该成像探针可插入标准的软性或硬性内镜的工作通道中。另一种基于内镜的共聚焦激光显微内镜系统（Optiscan，澳大利亚）则将共聚焦显微内镜功能直接集成于内镜上，也已用于胃肠道检查。然而，由于其内镜直径较大，目前在泌尿道中的应用仅限于ex vivo（离体）使用。¹¹ 共聚焦图像的采集通过成像探针与目标组织直接接触完成，并以视频序列形式记录。与胃肠道类似，泌尿道的显微内镜检查也需要外源性对比剂——最常用的是荧光素，可通过静脉或膀胱内途径给药。膀胱内给药是一种成熟的局部给药方法，可在泌尿道实现局部药物递送，同时系统性毒性最小。荧光素可快速染色细胞外基质，且其安全性已得到充分验证。¹² 不同直径的成像探针可适配不同规格的内镜。迄今为止，1.4 mm和2.6 mm的探针已用于软性和硬性膀胱镜检查。¹⁰ 近期推出的< 1 mm成像探针¹³为输尿管镜检查期间在上尿路开展共聚焦激光显微内镜（CLE）提供了可能。荧光膀胱镜检查（即光动力诊断）和窄带成像则是其他可与CLE联合使用的基于内镜的光学成像技术¹⁴，以实现泌尿道的多模态成像。未来，CLE还可与分子对比剂（如荧光标记的多肽¹⁵和抗体）结合，用于具有分子特异性的疾病过程内镜成像。

方案

1. 患者准备

1. 对计划接受诊断性膀胱镜检查及其他内泌尿系统手术（如经尿道膀胱肿瘤切除术，TURBT）的患者，获取其进行共聚焦激光显微内镜（CLE）检查的知情同意。知情同意书中应包含使用膀胱内和/或静脉注射荧光素作为对比剂的说明，并询问患者是否有对荧光素的超敏反应史。
2. 将患者置于膀胱镜检查体位（通常为截石位），并以无菌方式准备。
3. 通过尿道使用硬性或软性膀胱镜进行标准白光膀胱镜检查（WLC）。
4. 在白光下观察膀胱的所有区域（图1），并标记出需进一步进行CLE检查的关注区域。
5. 除白光膀胱镜检查外，还可使用其他宏观光学成像方式对膀胱进行成像，包括荧光膀胱镜检查（图2A）或窄带成像（图2B），以识别更多可疑区域，随后使用CLE进行特征分析。
6. 使用电灼电极或切除环在拟进行成像及活检以获得病理学证实的关注区域附近做一小电灼标记。该电灼标记有助于在后续的CLE成像和活检过程中重新定位。

2. 对比剂

1. 膀胱内灌注造影剂
   1. 将临床级10%荧光素钠用无菌生理盐水（0.9% NaCl）稀释至所需浓度。例如，将4 ml的10%荧光素钠加入396 ml生理盐水中，配制成400 ml的0.1%荧光素钠溶液。
   2. 将无菌导尿管插入膀胱，使用60 ml注射器通过重力作用将稀释后的造影剂灌注至膀胱内。
   3. 夹闭导尿管，使造影剂在膀胱内留置5分钟。
   4. 排出膀胱内的造影剂。使用60 ml注射器以生理盐水冲洗膀胱，清除残留造影剂，冲洗量约为240–300 ml。
   5. 进行共聚焦激光显微内镜（CLE）成像。
2. 静脉注射荧光素钠
   1. 抽取1.0 ml荧光素钠至注射器中。将注射器连接至静脉通路，以团注方式静脉推注0.5–1.0 ml荧光素钠，随后用生理盐水冲洗管路。此步骤通常由手术室内的麻醉团队完成。
   2. 进行共聚焦激光显微内镜（CLE）成像。

3. CLE 成像

1. 从包装中取出已灭菌的共聚焦激光显微内镜探头（Cellvizio），并将其连接至激光扫描单元（Mauna Kea Technologies，法国巴黎）。
2. 按照制造商的说明对成像探头进行预热和校准。
3. 将膀胱镜或经尿道电切镜重新插入膀胱。使用带有0度镜头的硬性膀胱镜。
4. 将共聚焦激光显微内镜探头沿膀胱镜的工作通道推进，使探头尖端略伸出膀胱镜末端。
5. 在白光下定位先前标记的兴趣区域。根据需要额外灌注生理盐水以清晰显示黏膜，并保持膀胱适度扩张。
6. 操作者用手操控共聚焦激光显微内镜探头，使其与兴趣区域直接进行en face接触。为实现对兴趣区域的光学切片，应在保持直接接触的同时，轻柔地施加和释放探头压力。
   1. 对于位于膀胱前壁的肿瘤，使用标准Albarran桥有助于偏转成像探头，从而实现与兴趣区域的直接接触（图2C）。
7. 常见的兴趣区域包括乳头状肿瘤、非乳头状肿瘤、正常外观黏膜与肿瘤之间的过渡区以及红斑样区域，这些均可通过膀胱内或静脉注射荧光素的方式进行成像。对于切除创面、前列腺部尿道及阴茎部尿道的成像，则必须采用静脉注射荧光素。
8. 当成像探头扫描兴趣区域时，记录图像以供后续分析。注意观察整体细胞形态、边界、排列结构以及新生血管的有无。
9. 完成成像后，将共聚焦激光显微内镜探头从工作通道中撤出。
10. 如需要，可从共聚焦激光显微内镜扫描过的相应兴趣区域获取冷刀活检组织。使用电灼标记作为解剖标志，以便对成像区域与活检区域进行共定位配准。
11. 按常规完成经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）。对于接受静脉注射荧光素的患者，考虑到荧光素在静脉注射后约5分钟经肾脏排泄入膀胱，建议使用连续灌流式电切镜以改善切除过程中的视野清晰度。
12. 从共聚焦图像处理器中调取保存的图像记录，并进行图像分析。

结果

CLE 图像以每秒 12 帧的灰度视频序列文件保存。图像解读可实时进行，并可在研究性方案下用于影响临床决策。离线分析包括视频序列的回溯审查以及额外的图像处理，例如马赛克拼接，⁷ 以及与标准病理学的对比，在该技术的学习曲线阶段具有重要意义。图1B和图1C分别为使用膀胱内注射和静脉注射荧光素钠从两个不同膀胱肿瘤获得的代表性共聚焦激光显微内镜（CLE）图像。对于膀胱肿瘤，细胞特征（例如 形态、凝聚性与边界）以及微结构特征（例如 扁平型与乳头状肿瘤、组织结构及血管特征）可用于区分良恶性病变以及低级别与高级别癌症。由于成像探针可在不同类型的膀胱镜之间互换使用，共聚焦激光显微内镜（CLE）可与其他新兴成像技术联合应用，包括荧光膀胱镜检查（图2A）和窄带成像（图2B），这可能会提高任一技术单独使用的诊断准确性。

讨论

获得并维持固态 表面（en face） 成像探头与膀胱黏膜之间的接触是获得最佳图像质量最关键的步骤。患者通常需要经过约3至5例的操作学习曲线，才能掌握操控成像探头的技巧，并在图像采集过程中稳定地保持探头位置。此外，由于该操作是在无菌条件下进行的 体内，患者移动（即 呼吸运动和血管搏动可能影响成像探头与膀胱的接触。目前仍在研究不同观察者之间的判读差异以及图像解读的学习曲线，后者需要具备广泛的膀胱病理学经验。图像质量的差异可能源于组织本身的变异性及潜在的病理状况。除可疑病变区域外，对正常区域进行成像有助于评估图像质量和荧光素染色效果。

在成像和切除组织过程中，通过电灼标记每个感兴趣区域有助于在膀胱反复排空和充盈期间重新定位已成像和已切除的组织。此步骤称为共配准，对于将共聚焦激光显微内镜（CLE）获得的图像与组织学结果进行对比分析至关重要。上述内容已描述了荧光素膀胱内给药和静脉给药的两种方法，两者在给药时机和是否需要建立静脉通路方面存在一些差异。⁸

根据需要...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cellvizio 100 系列	Mauna Kea Technologies	100 系列	包含共聚焦处理器和 LSU：F400-v2，波长 488 nm
Cellvizio 共聚焦微型探头	Mauna Kea Technologies	Gastroflex UHD
AK-FLUOR 10%	Akorn, Inc.	NDC 17478-253-10