使用微电极阵列（MEA）对贴壁细胞进行高效、位点特异性siRNA转染

摘要

本文详细介绍了利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养物中进行siRNA随机序列位点特异性转染的实验方案。

摘要

真核生物中RNAi通路的发现以及后续RNAi试剂（如siRNA和shRNA）的发展，为功能基因组学和治疗应用提供了沉默特定基因的有力方法^1-8。基于RNAi的研究面临的主要挑战之一是将RNAi试剂递送至靶细胞。传统的非病毒递送技术，如大容量电穿孔和化学转染方法，通常缺乏对递送空间的精确控制，且转染效率较低^9-12。近年来，阳离子脂质、阳离子聚合物和纳米颗粒等化学转染方法的进步显著提高了转染效率¹³。然而，这些技术仍然无法实现对递送过程的精确空间控制，而这种控制对于微型化高通量技术、单细胞研究以及细胞间相互作用的探究具有重要意义。

基因递送技术的最新进展使得贴壁细胞的高通量转染成为可能^14-23，其中大多数方法采用微尺度电穿孔技术。微尺度电穿孔可实现对递送过程的精确时空控制（可达单细胞水平），并已被证明具有较高的转染效率^{19, 24-26}。此外，基于电穿孔的方法无需像化学转染方法那样，将siRNA和DNA复合物与细胞孵育较长时间（通常为4小时），而是促使裸露的siRNA和DNA分子直接进入细胞质。因此，转染后最早可在6小时即实现基因表达²⁷。本实验室先前已证实，可利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养中实现位点特异性的转染^17-19。在基于MEA的方法中，遗传物质的递送是通过局部微尺度电穿孔实现的。对选定电极施加电脉冲，可在局部产生电场，从而使刺激电极区域内的细胞发生电穿孔。微电极的独立控制不仅提供了对转染过程的空间和时间调控能力，还可在同一细胞培养物上进行多次转染实验，提高实验通量，并减少不同培养物之间的变异性。

本文介绍了利用电穿孔技术将荧光标记的乱序序列siRNA靶向转染贴壁HeLa细胞的实验装置及操作步骤。该相同方案也可用于质粒载体的转染。此外，本方案经微小调整后可轻松拓展应用于多种哺乳动物细胞系。由于微电极阵列（MEA）具有预定义和定制电极图案的商业化产品，因此只要具备基本细胞培养设备的研究实验室均可采用该技术。

方案

1. 多电极阵列准备

1. 用于电穿孔实验的微电极阵列（MEA）可采用先前所述的标准光刻技术自行制备¹⁸，也可直接从MEA制造商供应商处购买，例如Multi Channel Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) 和 Alpha MED Scientific, Inc. (http://www.MED64.com)。本实验所用的MEA是在中国台湾亚利桑那州立大学的洁净室设施内自行制备的，该设施由固体态电子研究中⼼（CSSER）管理。实验中使用的MEA在一个内径为1 cm的玻璃小室中包含32个氧化铟锡电极，呈8行×4列排列，电极直径范围为50–200 μm。玻璃小室通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）键合在MEA上。
2. 在接种细胞前，将MEA置于高压灭菌器中进行灭菌。其他灭菌方法，如70%乙醇浸泡、紫外线处理和热水处理，只要不破坏MEA的完整性，也可使用。
3. 将高压灭菌后的MEA转移至超净工作台，并放入标准无菌聚苯乙烯培养皿中。在向MEA接种细胞前，开启紫外线灯照射20分钟以对超净工作台进行灭菌。若MEA对紫外线敏感，在超净工作台进行紫外线照射期间，需用无菌铝箔覆盖装有MEA的培养皿。....

讨论

在本视频文章中，我们展示了使用微电极阵列（MEA）对HeLa细胞进行位点特异性转染，所用siRNA为乱序序列。该技术的优势之一在于其适用于多种细胞系，包括原代细胞系。本实验室此前已证明该技术可用于对来自E18天大鼠的原代海马神经元培养物以及NIH-3T3细胞进行位点特异性转染，转染物为乱序siRNA序列和GFP质粒^{18, 19}。我们还成功实现了将功能性siRNA递送至HeLa细胞以靶向内源性基因（未发表数据）。典型的商用MEA兼容光学成像（直立显微镜），可利用荧光免疫染色技术定量评估基因沉默的功能性影响。此外，MEA中的微电极可用于监测细胞（如原代神经元）在基因扰动后的电活动。MEA的独特性质使其能够在同一细胞培养物上同时开展多项实验，从而提高实验通量。目前基于MEA的系统主要局限在于转染所需siRNA量较大（400 μl的1 μM siRNA），相较于传统的化学转染方法用量较高，因而限制了系统的成本效益。这一问题可通过将微流控技术与基于MEA的系统结合来部分解决，从而将siRNA电穿孔溶液的总体积减少至几微升以下。此外，微流控技术还可实现不同siRNA分子的连续递送，从而显著提升基于MEA技术的通量。另一种方法是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养基： Advanced MEM L-谷氨酰胺 200 mM 青霉素/链霉素 胎牛血清	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	细胞培养基配制： 在Advanced MEM中加入2% FBS、2% L-谷氨酰胺和2%青霉素-链霉素
胰蛋白酶EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488和罗丹明标记的乱序序列siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
电穿孔缓冲液	Biorad Laboratories	165-2677
波形发生器	Pragmatic	2414A	任何能够提供所需脉冲的波形/脉冲发生器均可使用。