本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体 实验系统
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摘要
摘要
研究适应性免疫的科研人员的一项基本需求 体内 实验模型的一项重要能力是能够根据T细胞的T细胞抗原受体（TCR）特异性来鉴定T细胞。目前已有多种间接方法，可通过刺激大量T细胞群体进行检测 体外 通过检测功能性反应（如增殖、细胞因子产生或活化标志物表达）来鉴定针对特定抗原的表位特异性T细胞1然而，这些方法仅能鉴定出具有多种可能功能之一的表位特异性T细胞，且其灵敏度不足以检测处于初始前体频率水平的表位特异性T细胞。一种常用的替代方法是TCR转基因过继转移模型，该模型将来自TCR转基因小鼠的单克隆T细胞植入组织相容性宿主中，以建立大量表位特异性T细胞前体群体，并可利用同源标志抗体对其进行便捷追踪2,3尽管该方法具有较强的有效性，但其存在与针对单一表位的T细胞在非生理频率下相关的实验假象问题4,5此外，该系统无法用于研究多克隆群体中表位特异性T细胞克隆的功能异质性。
研究适应性免疫的理想方法应包括利用一种仅通过识别肽-MHC（pMHC）复合物结合特性来区分T细胞受体（TCR）特异性的技术，直接检测内源性T细胞库中表位特异性的T细胞。使用pMHC四聚体结合流式细胞术可实现这一目标6，但该方法仅限于检测抗原诱导克隆扩增后出现的高频率表位特异性T细胞群体。在本实验方案中，我们描述了一种结合pMHC四聚体与磁性细胞富集技术的方法，从而实现从小鼠淋巴组织中检测极低频率的表位特异性T细胞3,7。利用该技术，可在免疫应答的各个阶段全面追踪小鼠体内完整的内源性表位特异性T细胞群体。
方案
1. 淋巴组织中细胞的分离
- 向一个含有100 μm尼龙网小方块的60 mm培养皿中加入1 ml冰上预冷的cEHAA（EHAA + 10% FBS、青霉素/链霉素、庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺、55 mM 2-巯基乙醇）或其他等效T细胞培养基，并将培养皿置于冰上。
- 处死小鼠。
- 取出脾脏以及尽可能多的易获取的淋巴结，至少应包括腹股沟、腋窝、臂部、颈部和肠系膜淋巴结。将这些组织置于培养皿中尼龙网的上方。
- 使用盖紧的1.5 ml微量离心管的平顶，轻柔地在尼龙网上研磨淋巴组织以释放淋巴细胞。再加入1 ml cEHAA，用移液器反复吹打使细胞形成单细胞悬液。将细胞悬液通过另一片置于15 ml聚丙烯离心管管口的尼龙网过滤。用另外1 ml冰上预冷的cEHAA冲洗培养皿和尼龙网，将冲洗液合并至同一离心管中。重复上述操作，最终获得4 ml的细胞悬液。
- 加入冷的分选缓冲液（PBS + 2% FBS、0.05%叠氮化钠），使总体积达到15 ml，然后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液，确保管壁无残留液滴。用Fc阻断液（分选缓冲液 + 2.4G2抗体）重悬细胞沉淀，终体积约为沉淀体积的两倍。例如，一只未处理小鼠的脾脏和淋巴结通常产生约100 μl的细胞沉淀，此时应加入100 μl Fc阻断液，使总体积达到200 μl。若出现明显细胞团块，可在此时用移液器吸头小心去除团块。
2. 四聚体染色
- 加入PE或APC标记的pMHC四聚体，终浓度为10 nM（或根据经验优化的浓度）。
- 混匀后在室温下孵育1小时（或根据经验优化的时间和温度）。
- 加入预冷的分选缓冲液至15 ml体积，在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。此后样品始终保持在冰上或4 °C环境中。
- 小心吸除上清液，确保管壁无残留液滴。将细胞沉淀重悬于分选缓冲液中，终体积为200 μl。如进行双四聚体富集，则重悬至终体积150 μl。
3. 磁性富集
- 加入 50 μl Miltenyi anti-PE 或 anti-APC 微珠。若进行双重四聚体富集，则两种微珠各加 50 μl。
- 混匀后于 4 °C 孵育 20 分钟。
- 加入冷分选缓冲液至总体积为 15 ml，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。
- 等待期间，将 Miltenyi LS 磁性柱安装至 MidiMACS 或 QuadroMACS 磁铁上，并在柱子正下方的支架上放置一个开口的 15 ml 聚丙烯离心管。
- 向柱顶加入 3 ml 分选缓冲液，使其流入下方 15 ml 管中。
- 将一块 100 μm 尼龙筛网置于柱顶。
- 细胞离心完成后，小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 3 ml 分选缓冲液中。
- 将细胞悬液通过尼龙筛网转移至柱顶。
- 待细胞悬液完全流入柱中后，用另外 3 ml 分选缓冲液冲洗原离心管，并将冲洗液通过尼龙筛网转移至柱中，同时冲洗筛网。随后弃去尼龙筛网。
- 待缓冲液完全流入柱中后，向柱中再加入 3 ml 分选缓冲液。
- 重复步骤 10，共进行 3 次，每次 3 ml，完成三次洗涤。
- 将磁性柱从磁铁上取下，移至一个新的 15 ml 聚丙烯离心管上方。
- 向柱中加入 5 ml 分选缓冲液。
- 立即插入推杆至柱顶，并以连续动作将推杆完全推到底，迫使缓冲液从柱中挤出并流入离心管。
- 将含有洗脱结合组分和流穿未结合组分的离心管于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。
- 小心吸除结合组分的上清液，确保管壁无残留液滴。将细胞沉淀重悬于分选缓冲液中，终体积精确为 95 μl。将未结合组分吸除上清后重悬于 2 ml 分选缓冲液中。
4. 流式细胞术
- 对于每个组分，取出 5 μl 并加入含有 200 μl 计数微球（用分选缓冲液调整至浓度为 200,000/ml）的 5 ml FACS 管中。置于 4 °C 保存，留待后续分析。为节省时间，可在实验开始前将微球预分装至已标记的试管中。
- 配制用于标记细胞表面标志物的抗体主混合液（表 1）。为节省时间，此步骤可在实验开始前完成。
- 对于结合组分，直接将一份抗体混合液加入管中约 90 μl 的细胞悬液中。若需分析未结合组分，则将 90 μl 细胞转移至一个 5 ml FACS 管中，并加入一份抗体混合液。
- 为流式细胞仪设置单色补偿对照。针对每种拟使用的荧光染料，取 50 μl 剩余的未结合组分细胞，置于 5 ml FACS 管中，加入 1 μl 对应荧光染料标记的抗-CD4 抗体。请同时设置未染色对照。
- 涡旋混匀所有样品，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。
- 向每管中加入 5 ml 分选缓冲液，于 4 °C、300 × g 离心 5 分钟。
- 对于结合组分，小心吸除上清液，将细胞重悬于 200 μl 分选缓冲液中，转移至 1.2 ml FACS 微量管中。用另外 200 μl 分选缓冲液冲洗原管，并将冲洗液合并至同一微量管中。若观察到细胞团块，需将细胞通过 50 μm 滤膜过滤。
- 对于未结合组分及补偿对照，倾倒或吸除上清液，将细胞重悬于 2 ml 分选缓冲液中。
- 使用单色补偿对照设置流式细胞仪参数，并选择侧向散射-宽度（SSC-W）作为额外记录参数。
- 采用连续设门策略分析染色样品，以鉴定 CD4+ 或 CD8+ T 细胞，如 图 1 和图 2 所示。对于结合组分，尽可能收集细胞，最多收集总计 2,000,000 个事件。对于未结合组分，收集总计 1,000,000 个事件。采集速率应保持在每秒 3,000 个事件或以下。
- 使用相同的仪器设置分析计数微球样品，共收集 10,000 个总事件。
- 将所有数据保存为 FCS 文件。
5. 数据分析
- 使用 FlowJo 软件分析计数微球样品的 FCS 数据文件。以 FITC 为纵轴绘制前向散射图，并在计数微球周围设置门控（见图 1 和图 2）。确定每个样品中检测到的计数微球总数。从采集的总事件数中减去该数值，以获得所采集的细胞事件数量。
- 利用方框 1 中列出的公式计算每个样品中所有细胞的总数。
- 分析染色后结合组与未结合组样品的 FCS 数据文件。建立一系列连续的包含性门控，以鉴定各样品中的淋巴细胞阳性（lymphoid+）、侧向散射宽度低（side-scatter-widthlo）、倾倒阴性（dump-）、CD3+、CD4+ 或 CD8+、四聚体阳性（tetramer+）T 细胞，如图 1 和图 2所示。
- 将样品中细胞总数乘以用于定义 CD4+tetramer+ 或 CD8+tetramer+ 细胞的各包含性门控频率，计算出表位特异性 T 细胞的总数（方框 1）。
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结果
图1展示了来自未免疫小鼠的pMHCII四聚体富集脾脏和淋巴结样本的代表性流式细胞术图谱，而图2展示了先前用相应肽段+CFA免疫过的小鼠的代表性数据。通过连续设门可从CD4+ T细胞群分析中排除自发荧光及其他非目标事件。CD8+ T细胞群可作为pMHCII四聚体染色CD4+ T细胞的一个有效内部阴性对照。需要注意的是，富集后的结合组分通常比未结合组分含有更高比例的自发荧光细胞，这使得设门更为困难。
通过将富集样品结合组分中所有细胞的总数（由微球计数分析确定）乘以四聚体阳性细胞所占比例（由细胞染色分析确定），可计算出样品中特异性表位T细胞的绝对数量（方框1）。
对于图1中的未免疫小鼠，样本结合组分中所有细胞的浓度为 (4411/5589) × (200,000) × (0.200/0.005) = 6.31 × 106 /ml。样本中所有细胞的总数为 (6.31 × 106 /ml)...
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讨论
基于pMHC四聚体的细胞富集方法是研究内源性T细胞库中表位特异性T细胞的有力工具。使用pMHC四聚体可直接依据T细胞受体（TCR）与同源pMHC配体的结合能力来检测表位特异性T细胞。该富集方法具有高度敏感性，能够在无需改变T细胞遗传背景或前体频率的情况下，从内源性T细胞库中检测到极为稀有的抗原特异性T细胞群体。因此，该技术使研究者能够直接追踪内源性抗原特异性T细胞群体 在体 通过免疫反应的所有阶段，从其初始状态开始研究实验系统。
本方案已针对使用pMHC II类（pMHCII）四聚体从小鼠的次级淋巴器官中富集表位特异性CD4+ T细胞进行了优化。然而，该技术同样适用于pMHC I类（pMHCI）四聚体和CD8+ T细胞9。与CD4不同，CD8共受体在稳定TCR-MHC相互作用方面发挥重要作用，这可能对pMHCI四聚体染色产生实际影响10。尤其需要注意的是，应仅使用不影响CD8-四聚体结合的CD8抗体克隆，并且应在四聚体染色完成后才将抗体加入细胞。事实上，一些pMHCI四聚体已通过改造MHC I类分子上的CD8结合位点（...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Andre Han 和 Lawrence Yen 提供的技术支持，以及 Jenkins 实验室成员在本实验方案开发过程中给予的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PE 或 APC 标记的 pMHC 四聚体（或多聚体） | 由研究人员制备，或从 NIH 四聚体核心设施获得，或从商业来源购买 | ||
| 抗-PE 偶联磁性微珠 | Miltenyi | 130-048-801 | |
| 抗-APC 偶联磁性微珠 | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS 磁性分离柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS 或 QuadroMACS 磁铁装置 | Miltenyi | 130-042-302 或 130-090-976 | |
| 细胞计数微珠 | Life Technologies | PCB-100 |
参考文献
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