基于肽段-MHC四聚体的表位特异性T细胞富集

摘要

本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体 实验系统

摘要

研究适应性免疫的科研人员的一项基本需求 体内 实验模型的一项重要能力是能够根据T细胞的T细胞抗原受体（TCR）特异性来鉴定T细胞。目前已有多种间接方法，可通过刺激大量T细胞群体进行检测 体外 通过检测功能性反应（如增殖、细胞因子产生或活化标志物表达）来鉴定针对特定抗原的表位特异性T细胞¹然而，这些方法仅能鉴定出具有多种可能功能之一的表位特异性T细胞，且其灵敏度不足以检测处于初始前体频率水平的表位特异性T细胞。一种常用的替代方法是TCR转基因过继转移模型，该模型将来自TCR转基因小鼠的单克隆T细胞植入组织相容性宿主中，以建立大量表位特异性T细胞前体群体，并可利用同源标志抗体对其进行便捷追踪^2,3尽管该方法具有较强的有效性，但其存在与针对单一表位的T细胞在非生理频率下相关的实验假象问题^4,5此外，该系统无法用于研究多克隆群体中表位特异性T细胞克隆的功能异质性。

研究适应性免疫的理想方法应包括利用一种仅通过识别肽-MHC（pMHC）复合物结合特性来区分T细胞受体（TCR）特异性的技术，直接检测内源性T细胞库中表位特异性的T细胞。使用pMHC四聚体结合流式细胞术可实现这一目标⁶，但该方法仅限于检测抗原诱导克隆扩增后出现的高频率表位特异性T细胞群体。在本实验方案中，我们描述了一种结合pMHC四聚体与磁性细胞富集技术的方法，从而实现从小鼠淋巴组织中检测极低频率的表位特异性T细胞^3,7。利用该技术，可在免疫应答的各个阶段全面追踪小鼠体内完整的内源性表位特异性T细胞群体。

方案

1. 淋巴组织中细胞的分离

1. 向一个含有100 μm尼龙网小方块的60 mm培养皿中加入1 ml冰上预冷的cEHAA（EHAA + 10% FBS、青霉素/链霉素、庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺、55 mM 2-巯基乙醇）或其他等效T细胞培养基，并将培养皿置于冰上。
2. 处死小鼠。
3. 取出脾脏以及尽可能多的易获取的淋巴结，至少应包括腹股沟、腋窝、臂部、颈部和肠系膜淋巴结。将这些组织置于培养皿中尼龙网的上方。
4. 使用盖紧的1.5 ml微量离心管的平顶，轻柔地在尼龙网上研磨淋巴组织以释放淋巴细胞。再加入1 ml cEHAA，用移液器反复吹打使细胞形成单细胞悬液。将细胞悬液通过另一片置于15 ml聚丙烯离心管管口的尼龙网过滤。用另外1 ml冰上预冷的cEHAA冲洗培养皿和尼龙网，将冲洗液合并至同一离心管中。重复上述操作，最终获得4 ml的细胞悬液。
5. 加入冷的分选缓冲液（PBS + 2% FBS、0.05%叠氮化钠），使总体积达到15 ml，然后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
6. 小心吸除上清液，确保管壁无残留液滴。用Fc阻断液（分选缓冲液 + 2.4G2抗体）重悬细胞沉淀，终体积约为沉淀体积的两倍。例如，一只未处理小鼠的脾脏和淋巴结通常产生约100 μl的细胞沉淀，此时应加入100 μl Fc阻断液，使总体积达到200 μl。若出现明显细胞团块，可在此时用移液器吸头小心去除团块。....

结果

图1展示了来自未免疫小鼠的pMHCII四聚体富集脾脏和淋巴结样本的代表性流式细胞术图谱，而图2展示了先前用相应肽段+CFA免疫过的小鼠的代表性数据。通过连续设门可从CD4+ T细胞群分析中排除自发荧光及其他非目标事件。CD8+ T细胞群可作为pMHCII四聚体染色CD4+ T细胞的一个有效内部阴性对照。需要注意的是，富集后的结合组分通常比未结合组分含有更高比例的自发荧光细胞，这使得设门更为困难。

通过将富集样品结合组分中所有细胞的总数（由微球计数分析确定）乘以四聚体阳性细胞所占比例（由细胞染色分析确定），可计算出样品中特异性表位T细胞的绝对数量（方框1）。

对于图1中的未免疫小鼠，样本结合组分中所有细胞的浓度为 (4411/5589) × (200,000) × (0.200/0.005) = 6.31 × 10⁶ /ml。样本中所有细胞的总数为 (6.31 × 10⁶ /ml).......

讨论

基于pMHC四聚体的细胞富集方法是研究内源性T细胞库中表位特异性T细胞的有力工具。使用pMHC四聚体可直接依据T细胞受体（TCR）与同源pMHC配体的结合能力来检测表位特异性T细胞。该富集方法具有高度敏感性，能够在无需改变T细胞遗传背景或前体频率的情况下，从内源性T细胞库中检测到极为稀有的抗原特异性T细胞群体。因此，该技术使研究者能够直接追踪内源性抗原特异性T细胞群体 在体 通过免疫反应的所有阶段，从其初始状态开始研究实验系统。

本方案已针对使用pMHC II类（pMHCII）四聚体从小鼠的次级淋巴器官中富集表位特异性CD4+ T细胞进行了优化。然而，该技术同样适用于pMHC I类（pMHCI）四聚体和CD8+ T细胞⁹。与CD4不同，CD8共受体在稳定TCR-MHC相互作用方面发挥重要作用，这可能对pMHCI四聚体染色产生实际影响¹⁰。尤其需要注意的是，应仅使用不影响CD8-四聚体结合的CD8抗体克隆，并且应在四聚体染色完成后才将抗体加入细胞。事实上，一些pMHCI四聚体已通过改造MHC I类分子上的CD8结合位点（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PE 或 APC 标记的 pMHC 四聚体（或多聚体）	由研究人员制备，或从 NIH 四聚体核心设施获得，或从商业来源购买
抗-PE 偶联磁性微珠	Miltenyi	130-048-801
抗-APC 偶联磁性微珠	Miltenyi	130-090-855
LS 磁性分离柱	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS 或 QuadroMACS 磁铁装置	Miltenyi	130-042-302 或 130-090-976
细胞计数微珠	Life Technologies	PCB-100