癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。
本文内容
摘要
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是多种癌症肿瘤间质中最显著的细胞类型，尤其是乳腺癌，其显著存在通常与不良预后相关1,2CAFs 是基质成纤维细胞中的一类活化亚群，其中许多表达肌成纤维细胞标志物 α-SMA3癌相关成纤维细胞（CAFs）起源于局部组织的成纤维细胞以及被募集至发育中肿瘤的骨髓来源细胞，并在肿瘤微环境的影响下获得CAFs表型。4CAFs 被证明可通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭的信号通路，促进肿瘤的起始、生长和进展5-8我们证明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过介导促肿瘤炎症，在肿瘤发生的最早期前瘤阶段即开始促进肿瘤生长9尽管越来越多的证据表明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）在促进肿瘤生长中发挥关键作用，但由于缺乏 CAF 特异性标志物以及这些细胞的高度异质性，CAFs 的研究一直面临挑战，多种亚型在肿瘤微环境中共存10此外，研究成纤维细胞 体外 由于它们的基因表达谱在组织培养中常常发生改变，这一过程受到阻碍11,12 为了解决这一问题，并实现对新鲜小鼠和人组织来源的成纤维细胞进行无偏倚的基因表达谱分析，我们基于既往的荧光激活细胞分选（FACS）方案开发了一种新方法13,14我们的方法依赖于利用PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离成纤维细胞。PDGFRα在正常成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）中均高表达。9,15 该方法可分离出纯化的正常成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs），包括但不限于α-SMA+活化的肌成纤维细胞。分离得到的成纤维细胞可用于表征和比较CAFs在肿瘤发生过程中基因表达的演变。事实上，我们及其他研究团队已报道过通过细胞分选分离的成纤维细胞的表达谱分析16本方案已成功用于从皮肤、乳腺、胰腺和肺组织中分离和分析高度富集的成纤维细胞群体。此外，我们的方法还允许对分选后的细胞进行培养，以开展功能实验，并避免肿瘤细胞的污染，而肿瘤细胞污染在尝试培养癌相关成纤维细胞（CAFs）时常常是一个重大障碍。
方案
1. 解剖小鼠的乳腺或皮肤组织
- 在从小鼠中解剖目标组织之前，准备好以下用品和试剂：
材料：
- 手术工具（先用洗涤剂清洗，然后浸入70%乙醇中）。
- 解剖时用于放置小鼠的聚苯乙烯泡沫表面。
- 用于解剖过程中固定小鼠的针或镊子。
- 带盖玻璃消化罐，内含磁力搅拌子（已高压灭菌）。
- 37 °C 水浴，内含浸入式磁力搅拌器，加入足量水以浸没消化罐，并将消化罐置于搅拌板上。
试剂：- FACS 缓冲液 I（4 °C）：无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF）+ 0.5% BSA
- 胶原酶溶液（使用前立即配制）：
0.05 g 胶原酶 II
0.05 g 胶原酶 IV
0.01 g 脱氧核糖核酸酶
20 ml FACS 缓冲液 I。胶原酶溶液使用前需置于冰上保存。 - PharmLyse（氯化铵裂解试剂）
- FACS 缓冲液 II：无钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液 + 1% 胎牛血清。
- 乳腺的解剖 （另请参见17).
- 使用二氧化碳（CO₂）安乐死雌性小鼠2吸入。
- 在泡沫板表面，将小鼠仰卧放置，并使用25号针头牢固固定四肢图1A用70%乙醇充分喷洒小鼠。
- 用镊子提起腹中线处的腹部皮肤，用锐利的剪刀做一小切口。
- 从切口处开始，沿动物体表切开皮肤至颈部，注意避免刺破腹腔或胸腔。
- 从正中切口向腿部方向切割后肢皮肤，形成“Y形”。
- 将小鼠皮肤从躯体上剥离并固定，暴露附着于皮肤内侧的乳腺组织（图1B).
- 使用棉签轻轻将乳腺组织与皮肤分离，同时用小型锋利剪刀剪断结缔组织，将乳腺组织向小鼠脊柱方向分离。
- 腹部腺体（#4、5）最适合本方案。您也可以使用2nd 乳腺，但需注意这些腺体在解剖位置上与胸大肌邻近，可能难以完全分离，从而导致获得的细胞来源于混合组织。
- 注意： 解剖肿瘤组织时，建议去除坏死区域。
- 皮肤组织的解剖： 获取皮肤组织最简便的方法是使用小鼠耳朵，可避免脱毛的步骤。若需要较大面积的组织，可剃除小鼠躯干上的毛发后进行皮肤解剖。
- 使用 CO₂ 处死小鼠2 吸入
- 使用锋利的剪刀剪下双耳，并立即放入含有少量（约 0.5 ml）冰上预冷的 PBS 的消化管中。
2. 乳腺/皮肤单细胞悬液的制备
- 将乳腺组织/皮肤放入含有少量 PBS 的消化罐中，并置于冰上。如果组织带有血液，用 PBS 冲洗两次，然后弃去多余的 PBS。
- 用弯头剪刀充分剪碎组织。
- 加入 20 ml 胶原酶溶液（注意：此体积的胶原酶溶液可有效解离约 5 g 乳腺或肿瘤组织，或最多 15 只小鼠的耳组织）。
- 立即置于 37 °C 水浴中的搅拌台上，以中等速度搅拌，孵育 15 分钟。
注意：若消化其他组织，最佳孵育时间可能会有所不同。
- 为终止反应，加入 30 ml 冷的 DMEM + 10% FCS。
- 将组织/培养基混合物通过置于 50 ml 锥形管上方的 70 μm 细胞滤筛进行过滤。
- 在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟。
3. 红细胞裂解
注意：如果小鼠在处死后之前已用 PBS 进行心脏灌注，则此步骤不是必需的。
- 使用连接真空泵的玻璃移液管吸走上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
- 为裂解红细胞，将细胞沉淀重悬于10 ml PharmLyse溶液中，并在室温下孵育5分钟。
- 加入约40 ml FACS缓冲液I，以中和PharmLyse溶液。
- 将装有细胞的锥形管在4 °C条件下以450 × g离心5分钟。
- 吸走上清液。
4. 封闭内源性 Fc
- 可选：计数细胞，以确定后续步骤所需的合适体积。
- 根据细胞数量和所用抗体的量，用 1–3 ml FACS 缓冲液 I 重悬细胞。
- 加入 FcBlock（抗小鼠 CD16/CD32），使其达到 1:50 稀释度（10 μg/ml），冰上孵育 10–20 分钟。
无需洗去 FcBlock。
5. 染色
- 取出100 μl等分试样至离心管中，作为未染色对照和单色对照（根据所用荧光抗体的数量确定）。
- 标记成纤维细胞：加入抗PDGFRα抗体（直接偶联荧光染料），稀释比例为1:50（10 μg/ml）。
- 标记其他细胞群体（例如免疫细胞、巨噬细胞、内皮细胞等）：加入针对表面标志物的适当荧光偶联抗体，稀释比例为1:50。
注意：尽管 PDGFRα 是成纤维细胞的可靠标志物，但仍建议同时使用针对免疫细胞和上皮细胞的抗体，以排除任何双阳性细胞群体，从而提高分离得到的成纤维细胞的纯度。
- 向每支单色对照离心管中各加入 2 μl 的每种抗体。
- 将细胞与抗体在冰上避光孵育 1 小时。
- 洗涤步骤：用 FACS 缓冲液 I 充满各管，于 4 °C 以 450 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于 FACS 缓冲液 I 中，调整细胞浓度至约 2 × 106 个细胞/ml，或根据所用流式分选仪的性能选择最适宜的分选浓度。
可选：分选过程中可将细胞重悬于FACS缓冲液II中，这可能会提高细胞活力。然而，血清中的因子可能会影响基因表达，应进行测试并予以考虑。
- 将标记的细胞转移至带滤膜帽的流式管中：通过滤膜将细胞过滤入管内，以防止细胞团块形成。
- 为排除死细胞，可在样本中加入 7AAD（0.5 μg/ml）或碘化丙啶（PI）（未染色对照样本除外）。
注意：为避免浪费细胞，可在FACS记录后向未染色样本中加入7AAD/PI，并再次用作仅7AAD对照。
- 分析时将样品保持在冰上。
6. 通过流式细胞术分选细胞
（注意：本实验步骤需要具备操作流式细胞分选仪的前期经验，e.g. BD FACS AriaII，或需由熟练的技术人员协助）。
- 使用流式细胞分选软件（BD FACSDiva），设置适当的分析图以分析前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）、7AAD、FITC、PE 以及用于标记细胞的任何其他荧光染料（图2）。
- 在将每个样本上机前，短暂涡旋震荡以重悬细胞。
- 首先分析未染色样本，以设定总细胞群体的门控，排除细胞碎片，并确定自发荧光或背景染色水平。
- 分析未染色样本加7AAD，以从总细胞群体中确定并圈选活细胞群体。
- 分析每种单色对照样本，以确定和校准补偿等参数。
- 分析染色样本，以确定分选门的位置。
- 在设定好目标细胞群体的参数和门控后，开始将标记的细胞群体分选至含有培养基或RNA裂解缓冲液（如RLT缓冲液或Trizol）的EP管或15 ml离心管中。
注意：如果分选大量细胞，不建议直接将细胞分选至RNA裂解缓冲液中，因为与细胞一同进入的鞘液体积较大，会稀释裂解缓冲液，从而降低得率。
- 分选结束后立即离心收集细胞，并根据实验目的将其转移至新鲜培养基或RNA裂解缓冲液中。
- 若需培养分离的细胞，请进行无菌分选。为提高细胞回收率，建议使用不含酚红的DMEM加5% FCS替代FACS缓冲液II，并将细胞收集至含20% FCS的培养基中。
- 若培养分选后的成纤维细胞，务必将其接种于胶原蛋白包被的培养板上，切勿直接接种于塑料表面，以免导致成纤维细胞活化，进而引起基因表达的改变。
结果
以PDGFRα作为成纤维细胞的标记物，可实现组织成纤维细胞的高纯度分离。分选后的纯度达到99%，经分选后分析定量确认（图2A）。通过细胞特异性对照基因的相对表达水平评估非成纤维细胞的污染比例（图2B），通常显示污染率为0.1–0.6%。该纯度水平可支持对分离的成纤维细胞进行高质量的转录组分析9。
在乳腺组织中，正常乳腺组织的成纤维细胞占组织比例为5-20%，而MMTV-PyMT肿瘤中则为1-5%。尽管成纤维细胞总数增加，但由于上皮区室的大量扩张，肿瘤组织中成纤维细胞的相对比例仍低于癌前病变组织。从肿瘤组织中分离得到的成纤维细胞比例降低，也与高度坏死组织带来的技术难度增加以及细胞分选效率下降有关。
分离的成纤维细胞可在分选后直接进行培养，但可能需要数天时间恢复（图2D）。必须使用低代次细胞进行后续所有实验，因为原代成纤维细胞在体外传代培养过程中会发生衰老。
图 1. 从新鲜乳腺组织中纯化成纤维细胞。A- FVB/n /PyMT 小鼠。 B- 暴露的乳腺组织。 C- 从 FVB/n /PyMT 小鼠中解剖获取新鲜乳腺组织，并用胶原酶消化制备成单细胞悬液。细胞使用成纤维细胞表面标志物（PDGFRα）和巨噬细胞表面标志物（F4/80）的抗体进行免疫标记，随后通过 FACS 分选。分选后的成纤维细胞可用于培养或裂解以提取 RNA。 点击此处查看大图。
图 2. 分选后成纤维细胞的表征。A- 小鼠乳腺组织制备成单细胞悬液，并用 PDGFRα 和 F4/80 抗体进行染色。图中显示了流式细胞分选图（左图）。P2 为成纤维细胞门控（PDGFRα+ 细胞），P4 为巨噬细胞门控（F4/80+ 细胞）。分选后对成纤维细胞和巨噬细胞的纯度进行了分析（中图和右图）。B- 通过定量实时 PCR 检测细胞特异性对照基因的表达来评估分选纯度，所用基因包括成纤维细胞标志基因（PDGFRα, Col-1α）、免疫细胞标志基因（CD45, CSF-1R）以及上皮细胞标志基因（E-cadherin）。结果经两个看家基因（GAPDH 和 mGUS）标准化，图中显示相对于 GAPDH 的相对表达量。C- 在未分选的乳腺成纤维细胞总群中 PDGFRα 表达水平的定量分析。D- 分选后成纤维细胞的体外培养。 点击此处查看高分辨率图像。
讨论
尽管在组织培养中进行的实验具有一定的参考价值，并可提示一些能够在体内（in vivo）验证的功能性原理，但已知培养中的细胞在基因表达上会发生显著变化11,12。为了在分析成纤维细胞基因表达时避免组织培养步骤，我们开发了一种可从新鲜的小鼠或人体组织中分离正常成纤维细胞以及癌症相关成纤维细胞（CAFs）的实验方案。该方案已成功应用于小鼠和人类的皮肤、胰腺及乳腺组织9。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离成纤维细胞需要一种能够标记成纤维细胞的表面标志物。我们已证实PDGFRα是一种可靠的表面标志物，可用于高度富集的成纤维细胞群体的分离9。此外，PDGFRα在正常组织成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）上均有表达，因此可实现对组织成纤维细胞无偏倚的分离与分析，而非局限于特定亚群。
成纤维细胞是一类异质性细胞群体，其在标志分子的表达、来源及信号特性方面均存在差异8,10,18。尽管PDGFRα是成纤维细胞可靠的表面标志物，但它并不能标记所有组织中100%的成纤维细胞，因此会存在未被标记的细胞亚群，具体比例取决于组织类型。在皮肤中，约90%的成纤维细胞为PDGFRα阳性（未显示），而在乳腺组织中，约85%的成纤维细胞为PDGFRα阳性（图2C）。在其他组织类型中，表达PDGFRα的成纤维细胞比例可能有所不同，需针对每种组织进行明确界定。然而，在皮肤和乳腺组织中，使用PDGFRα作为细胞表面标志物可有效富集绝大多数组织成纤维细胞，从而实现对分选后细胞的表达谱分析或体外培养。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Yitzchak Oschry 博士和 Orit Sagi-Asif 博士在 FACS 分选方面的帮助。本研究获得了欧洲联盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）向 NE 提供的资助，项目编号为 n ° [276890]，来自以色列癌症协会（#20110078）以及以色列癌症研究基金研究职业发展奖).
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| 胶原酶II | Worthington | LS4176 | |
| 胶原酶IV | Worthington | LS4188 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| 70 μm 细胞滤筛 | SPL | 93070 | |
| 纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 活率探针（7AAD） | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| 抗小鼠 CD140a-PE（PDGFRa） | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| 抗小鼠 F4/80-FITC | Cederlane | CL8940F | |
| 不含酚红的 DMEM | Gibco | 31053 | |
| I型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354236 |
参考文献
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