癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。
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摘要
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是多种癌症肿瘤间质中最显著的细胞类型，尤其是乳腺癌，其显著存在通常与不良预后相关1,2CAFs 是基质成纤维细胞中的一类活化亚群，其中许多表达肌成纤维细胞标志物 α-SMA3癌相关成纤维细胞（CAFs）起源于局部组织的成纤维细胞以及被募集至发育中肿瘤的骨髓来源细胞，并在肿瘤微环境的影响下获得CAFs表型。4CAFs 被证明可通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭的信号通路，促进肿瘤的起始、生长和进展5-8我们证明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过介导促肿瘤炎症，在肿瘤发生的最早期前瘤阶段即开始促进肿瘤生长9尽管越来越多的证据表明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）在促进肿瘤生长中发挥关键作用，但由于缺乏 CAF 特异性标志物以及这些细胞的高度异质性，CAFs 的研究一直面临挑战，多种亚型在肿瘤微环境中共存10此外，研究成纤维细胞 体外 由于它们的基因表达谱在组织培养中常常发生改变，这一过程受到阻碍11,12 为了解决这一问题，并实现对新鲜小鼠和人组织来源的成纤维细胞进行无偏倚的基因表达谱分析，我们基于既往的荧光激活细胞分选（FACS）方案开发了一种新方法13,14我们的方法依赖于利用PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离成纤维细胞。PDGFRα在正常成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）中均高表达。9,15 该方法可分离出纯化的正常成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs），包括但不限于α-SMA+活化的肌成纤维细胞。分离得到的成纤维细胞可用于表征和比较CAFs在肿瘤发生过程中基因表达的演变。事实上，我们及其他研究团队已报道过通过细胞分选分离的成纤维细胞的表达谱分析16本方案已成功用于从皮肤、乳腺、胰腺和肺组织中分离和分析高度富集的成纤维细胞群体。此外，我们的方法还允许对分选后的细胞进行培养，以开展功能实验，并避免肿瘤细胞的污染，而肿瘤细胞污染在尝试培养癌相关成纤维细胞（CAFs）时常常是一个重大障碍。
方案
1. 解剖小鼠的乳腺或皮肤组织
- 在从小鼠中解剖目标组织之前，准备好以下用品和试剂：
材料：
- 手术工具（先用洗涤剂清洗，然后浸入70%乙醇中）。
- 解剖时用于放置小鼠的聚苯乙烯泡沫表面。
- 用于解剖过程中固定小鼠的针或镊子。
- 带盖玻璃消化罐，内含磁力搅拌子（已高压灭菌）。
- 37 °C 水浴，内含浸入式磁力搅拌器，加入足量水以浸没消化罐，并将消化罐置于搅拌板上。
试剂：- FACS 缓冲液 I（4 °C）：无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF）+ 0.5% BSA
- 胶原酶溶液（使用前立即配制）：
0.05 g 胶原酶 II
0.05 g 胶原酶 IV
0.01 g 脱氧核糖核酸酶
20 ml FACS 缓冲液 I。胶原酶溶液使用前需置于冰上保存。 - PharmLyse（氯化铵裂解试剂）
- FACS 缓冲液 II：无钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液 + 1% 胎牛血清。
- 乳腺的解剖
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结果
以PDGFRα作为成纤维细胞的标记物，可实现组织成纤维细胞的高纯度分离。分选后的纯度达到99%，经分选后分析定量确认（图2A）。通过细胞特异性对照基因的相对表达水平评估非成纤维细胞的污染比例（图2B），通常显示污染率为0.1–0.6%。该纯度水平可支持对分离的成纤维细胞进行高质量的转录组分析9。
在乳腺组织中，正常乳腺组织的成纤维细胞占组织比例为5-20%，而MMTV-PyMT肿瘤中则为1-5%。尽管成纤维细胞总数增加，但由于上皮区室的大量扩张，肿瘤组织中成纤维细胞的相对比例仍低于癌前病变组织。从肿瘤组织中分离得到的成纤维细胞比例降低，也与高度坏死组织带来的技术难度增加以及细胞分选效率下降有关。
分离的成纤维细胞可在分选后直接进行培养，但可能需要数天时间恢复（图2D）。必须使用低代次细胞进行后续所有实验，因为原代成纤维细胞在体外传代培养过程中会发生衰老。
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讨论
尽管在组织培养中进行的实验具有一定的参考价值，并可提示一些能够在体内（in vivo）验证的功能性原理，但已知培养中的细胞在基因表达上会发生显著变化11,12。为了在分析成纤维细胞基因表达时避免组织培养步骤，我们开发了一种可从新鲜的小鼠或人体组织中分离正常成纤维细胞以及癌症相关成纤维细胞（CAFs）的实验方案。该方案已成功应用于小鼠和人类的皮肤、胰腺及乳腺组织9。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离成纤维细胞需要一种能够标记成纤维细胞的表面标志物。我们已证实PDGFRα是一种可靠的表面标志物，可用于高度富集的成纤维细胞群体的分离9。此外，PDGFRα在正常组织成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）上均有表达，因此可实现对组织成纤维细胞无偏倚的分离与分析，而非局限于特定亚群。
成纤维细胞是一类异质性细胞群体，其在标志分子的表达、来源及信号特性方面均存在差异8,10,18。尽管PDGFRα是成纤维细胞可靠的表面标志物，但它并不能标记所有组织中100%的成纤维细胞，因此会存在未.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Yitzchak Oschry 博士和 Orit Sagi-Asif 博士在 FACS 分选方面的帮助。本研究获得了欧洲联盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）向 NE 提供的资助，项目编号为 n ° [276890]，来自以色列癌症协会（#20110078）以及以色列癌症研究基金研究职业发展奖).
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| 胶原酶II | Worthington | LS4176 | |
| 胶原酶IV | Worthington | LS4188 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| 70 μm 细胞滤筛 | SPL | 93070 | |
| 纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 活率探针（7AAD） | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| 抗小鼠 CD140a-PE（PDGFRa） | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| 抗小鼠 F4/80-FITC | Cederlane | CL8940F | |
| 不含酚红的 DMEM | Gibco | 31053 | |
| I型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354236 |
参考文献
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology.
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